玄参总DNA提取方法的比较研究

目的探讨药材玄参总DNA的最佳提取方法。方法分别采用SDS法和CTAB法提取药材玄参总DNA,并对其进行核酸含量测定和电泳检测。结果采用SDS法提取的总DNA其OD260/OD280=1.83,而采用CTAB法提取的总DNA其OD260/OD280=1.64;DNA电泳检测显示采用SDS法提取的总DNA条带清晰,而采用CTAB法提取的总DNA出现严重的拖尾现象。结论用SDS法提取药材玄参总DNA优于CTAB法。     

三种方法提取金黄色葡萄球菌DNA的比较

目的对三种金黄色葡萄球菌DNA提取方法的效果进行比较,以期获得一种简便、经济的提取方法。方法采用改良SDS法、NP40法和细菌DNA试剂盒法分别提取同一浓度的金黄色葡萄球菌ATCC25923细菌DNA,利用Nano Drop 2000核酸检测仪测定核酸浓度和纯度,纯度用核酸在波长260 nm处的吸光值与在波长280 nm处的吸光值的比值A260/A280表示,用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量;提取不同浓度梯度的金黄色葡萄球菌ATCC25923细菌DNA,PCR扩增16S r DNA片段检测并比较三种方法的灵敏度。结果三种方法提取金黄色葡萄球菌所得核酸浓度差异有统计学意义(χ~2=6.25,P0.05),NP40法提取浓度较高,改良SDS法较低。试剂盒法提取的DNA纯度较高,A_(260)/A_(280)值在1.8~2.0之间;NP40法提取纯度较差;DNA电泳结果表明SDS法和TIANGEN试剂盒法提取的DNA条带清晰,无拖带现象,NP40法未出现DNA主带,且有拖带现象。所有方法所得DNA经PCR扩增均出现阳性条带。NP40法提取DNA的PCR检测敏感度最高,为1.5×10~6 cfu/ml,改良SDS法敏感度最低,为1.5×10~8 cfu/ml。结论 NP40法提取DNA成本低,耗时少,灵敏度高,适用于金黄色葡萄球菌的快速初筛。     

基于PCR指纹技术鹿鞭鉴定方法的建立及检测试剂盒的研制

目的 建立鹿鞭及其伪品指纹鉴定方法,开发鹿鞭DNA检测试剂盒.方法 采用改良的SDS方法从鹿鞭及牛鞭基因组中提取DNA.以鹿鞭线粒体细胞色素b作为靶基因,设计鹿鞭特异性引物,利用现代DNA指纹技术,研制了鹿鞭DNA提取和检测试剂,建立鹿鞭指纹鉴定方法,开发出鹿鞭DNA检测试剂盒.结果利用PCR指纹技术提取的鹿鞭基因组DNA为21000 bp,纯度为1.80±0.10之间;应用特异性引物可准确鉴别鹿鞭及牛鞭样品,鹿鞭特异性扩增产物DNA分子片段为307 bp,而牛鞭及阴性对照无扩增条带;自主研发鹿鞭DNA检测试剂盒经反复冻融依然有效,多次进行特异性、稳定性和重现性试验,结果完全一致.结论 鹿鞭DNA检测试剂盒可作为鹿鞭鉴定的有效方法,该方法客观、准确、方便,可有效区分鹿鞭及其伪品.     

临床研究3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA的比较

目的 比较3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒(HBV) DNA的灵敏度和特异度,初步探讨其用于HBV DNA检测的临床价值.方法 用3种免核酸提取PCR试剂盒分别检测30例慢性乙型肝炎患者及30例阴性参比血清标本中的HBV DNA,以荧光定量PCR结果为标准,比较3种试剂检测灵敏度和特异度.结果 3种试剂盒的HBV DNA阳性检出率分别为93.3%(28/30)、96.7%(29/30)、100%(30/30);3种试剂检测HBV阴性的特异度均为100%;3种试剂检测灵敏度A公司为103 IU/mL,B、C公司均为102 IU/mL.结论 使用免核酸提取PCR试剂检测HBV快速、简便、高效,可用于临床HBV DNA快速检测.     

PCR法检测血液中白色念珠菌的敏感性研究

目的:探讨PCR法检测血液中白色念珠菌的敏感度.方法:采用 Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取白色念珠菌DNA,应用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,并采用有限稀释法推测PCR法可检测到的全血中最低白色念珠菌数目.结果:以白色念珠菌DNA为模版,用PCR法扩增得到约为500 bp左右的特异性条带;...     

PCR及Real-time PCR评价细菌DNA提取方法

目的:比较几种不同的细菌DNA提取方法,建立一种适于PCR和Real-time PCR的细菌DNA提取方法.方法:分别用蛋白酶K法、碱裂解法、Chelex-100 NP40、Chelex-100 TritonX-100法和水煮法提取同种浓度大肠杆菌DNA,测定OD260/280;用不同方法提取不同浓度的大肠杆菌DNA,进行PCR和实时荧光定量PCR扩增,比较灵敏度.结果:5种方法提取细菌DNA,其中Chelex-100 NP40 法纯度(OD260/280=1.79±0.03)最高,此方法所提取的DNA产物进行PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,其灵敏度为10个/ml细菌浓度.结论:Chelex-100 NP40的细菌DNA提取方法纯度及灵敏度高,且适应于PCR及Real-time PCR.     

干血滤纸片试剂盒和水煮法提取间日疟原虫DNA用于PCR检测的比较

目的：比较水煮法和干血滤纸片基因组DNA分离试剂盒提取间日疟原虫DNA用于PCR检测及克隆研究的差异。方法：采集间日疟患者末梢血制备干血滤纸片,分别用水煮法和QIAamp DNAmini kit试剂盒提取间日疟原虫基因组DNA10份。PCR扩增LDH基因,并克隆质粒pGEM-PvLDH。分析比较2种提取方法的差异。结果：水煮法和试剂盒法提取的间日疟原虫gDNA,均扩增出LDH基因特异条带,但试剂盒提取的gDNA目的条带亮于水煮法。结论：水煮法操作简便、快速、经济,在等量血源条件下,所得DNA量较少、纯度较低;试剂盒提取可获得较高的得率,在定量检测和复合扩增时受到的影响因素较少,成功率较高。     

番茄转基因检测方法的实验研究

目的：探讨转基因番茄的检测方法。方法：采用PCR扩增法，对通常转基因植物共有的35s启动子序列进行检测，确定其是否转基因；结果与结论：采用改进的CTAB方法提取DNA纯度较高，质量较好，反应体系3扩增效果最佳，62～64％为最佳退火温度。     

粪便基因组DNA提取方法比较及在沙门菌定量PCR检测中的应用

目的 建立并优化1种可用于临床微生物检测的粪便微生物基因组DNA提取方法并应用于沙门菌定量PCR快速检测.方法 分别利用土壤微生物基因组DNA提取试剂盒法、微生物基因组DNA提取试剂盒法和本实验室改进酚/氯仿抽提法提取腹泻患者粪便基因组DNA,根据沙门氏菌16srDNA、 dT等基因或DNA功能区序列设计PCR引物,进行多基因定量PCR检测.结果 3种方法提取的基因组DNA均可进行有效的定量PCR扩增,采用所建立的多重PCR方法可特异鉴别粪便沙门氏菌.结论本研究改进的粪便基因组DNA提取方法及临床微生物的定量PCR检测可在较短的时间内实现对大量临床样品快速诊断,有一定应用前景.     

巢式PCR在乙肝病毒X基因检测中的应用

目的 :探讨巢式PCR方法在乙肝病毒X基因 (HBVX)检测中的意义。方法 :随机抽取中国医学科学院肿瘤医院 1 998年 1月至 2 0 0 0年 1 2月的 8例HCC标本石蜡切片 ,提取组织DNA ,应用巢式PCR法进行HBVX基因检测。结果 :在 8例标本中 ,7例在 2 0 0bp～ 30 0bp处出现条带 ,大小符合引物设计HBVX基因 ,检出率为 87.5 %。结论 :应用巢式PCR法进行HBVX基因检测具有方法简单、敏感性高等特点 ,可用于石蜡切片等少量标本的检测。     

番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析

目的：获得取番茄果实特异性E8启动子基因,为实现外源基因在转基因番茄中果实特异性表达做准备。方法：培养中蔬5号（Zhongshu No.5)番茄幼苗，采集叶片，用Omega公司的植物基因组提取试剂盒提取番茄基因组DNA；设计引物，从基因组中通过PCR扩增获得番茄果实特异性E81．1和E82．2启动子基因；克隆进pGEM-T载体，酶切鉴定；送上海基康公司测序；序列分析。结果：从番茄基因组DNA中PCR扩增得到预期大小的启动子片段；构建重组pGEM-T-E81.1和pGEM-T-E82.2载体，经酶切证实具有与目标片段长度相符的插入片段；测序结果分析显示：番茄果实特异性E8启动子序列高度保守，所获得的Zhongshu No.5 E82.2启动子DNA序列与Deikman报道的Cherry种的E82．2启动子同源性为99％，登陆GenBank,ID号为AF515784。结论：成功获得Zhongshu No.5番茄果实特异性E81．1、E82．2启动子基因，为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的工作基础。     

转基因番茄Zeneca B,Da,F实时荧光定量PCR检测体系的建立

摘要：目的构建转基因番茄Zeneca B,Da,F品系的质粒标准分子及其实时荧光定量PCR（qPCR）检测体系。方法基于反
向遗传学原理构建分别含有番茄内标准基因apx检测序列（ERG-apx）,转基因番茄B,Da,F品系pg基因的基因特异性序列
（GS-pg）及其构建特异性序列（CS-16S、CS-16A）的番茄内参质粒标准分子pEasy-T3-APX,转基因番茄B,Da,F品系的构
建特异性质粒标准分子pEasy -T3- 16A、pEasy-T3-16S;以Beacon Designer 7.5设计用于定性PCR和qPCR检测的引物对
和Taqman探针;基于质粒标准分子建立了定性PCR和qPCR检测体系,对方法的特异性、敏感性、重复性、检测下限等指
标进行评估;使用PicoGreen 试剂盒对质粒标准分子进行定量,以质粒pEasy-T3- APX 为背景DNA 定量混有
pEasy-T3-16A或pEasy-T3-16S制备成含量为1%和0.1% (w/w)的两组核酸标准物质,进行所构建qPCR检测体系的定量
性能评价。结果锚定qPCR检测靶序列：ERG-apx 108 bp, GS-pg 108 bp,CS-16S 109 bp、CS-16A 102 bp;酶切鉴定所构
建的质粒标准分子均可得到预期大小的插入子片段;所建立的实时荧光定量PCR（qPCR）检测体系,重复性的相对标准差
（RSD）0.2%~1.5%,检测下限25 copies,标准曲线方程线性关系R2值在0.994~0.998,效率在93.3%~102.4%。经换算系数
Cf换算,对PicoGreen定量的样品进行验证,其实测值与真值的偏差是-9.7%~17.3%。结论成功构建了转基因番茄Zeneca
B,Da,F品系的质粒标准分子及其qPCR检测体系,为转基因番茄Zeneca B,Da,F品系转基因成分的监测建立了可行的
可供使用的定性与定量检测体系。
     

实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠拷贝数

目的利用实时荧光定量PCR法鉴定转基因小鼠外源基因插入拷贝数。方法以TG-CARK转基因首见鼠为研究对象,选取小鼠的高度保守基因Fabpi为内参,利用绝对定量的实时荧光PCR法鉴定转基因小鼠拷贝数,并与传统的Southern blot方法的定量结果进行比较。结果实时定量PCR鉴定的转基因拷贝数与Southernblot法完全一致,三只TG-CARK首见小鼠的拷贝数分别为1,7,45。结论实时定量PCR技术具有高准确性、高稳定性、高通量和低成本的优点,是比传统杂交技术更好的鉴定小鼠转基因拷贝数的方法。     

运用TaqMan探针实时荧光PCR技术检测AKAP10基因2073A/G单核苷酸多态性

目的 建立一套以TaqMan探针实时荧光PCR技术为基础的单核苷酸多态性(SNP)检测平台,并用于AKAP10基因2073A/G SNP的检测. 方法 设计一对TaqMan探针加入到PCR反应系统中,并设立阴阳对照,对AKAP10基因2073A/G SNP进行分型.同时验证部分样本PCR产物的直接测序结果 . 结果 运用TaqMan探针实时荧光PCR技术对AKAP10基因2073A/G SNP检测结果 准确,与PCR产物的直接测序结果 完全一致.AKAP10基因2073A/G多态性分布与性别年龄无关(P>0.05).非条件logistic回归分析提示,AKAP10基因2073A/G突变型(AG+GG)与野生型AA相比增加结直肠癌的发生风险(OR=1.52, 95% CI:1.07～2.15, P=0.019). 结论 通过合理设计TaqMan探针,设立阴阳性对照,应用TaqMan探针实时荧光PCR技术成功建立起一套SNP检测平台.AKAP10基因2073A/G多态性与结直肠癌发病存在显著相关性.     

伯氏疟原虫抗原基因高效植物表达载体的构建

目的构建果实特异启动子驱动的含伯氏疟原虫裂殖子表面蛋白PbMSP4/5(Plasmodium berghei merozoitesurface protein4/5)基因的植物表达载体,并进一步提高抗原基因的表达量和免疫原性,为研制有效的转基因植物疟疾疫苗打下基础。方法分别以提取的番茄和伯氏疟原虫Anka株的基因组DNA为模板,扩增番茄果实特异表达启动子E8的核心序列(约1.11Kb)及PbMSP4/5基因(704bp),并通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,SOE)PCR将二者拼接,拼接后的序列为EM,并合成霍乱毒素B亚基基因CTB,共同构建重组质粒pCAMBIA1302-EM-CTB,电击法转化根癌农杆菌GV3103。结果重组质粒经酶切鉴定证明已成功转化。结论实验成功构建了以番茄果实特异启动子驱动PbMSP4/5基因、以CTB为黏膜免疫佐剂的高效植物表达载体。     

PCR技术在转人肾素基因小鼠繁殖保存及育种中的应用

应用聚合酶链反应(PCR,Polymerase Chain ReacLion)方法检测转基因小鼠繁殖及育种过程中外源基因的整合,筛选携带目的基因的阳性仔鼠。     

SARS冠状病毒S1基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的:为获得抗SARS的转基因植物疫苗,进行了SARS S1基因的克隆,植物表达载体构建的研究。方法:根据SARS S蛋白受体结合结构域318-510氨基酸区域,设计合成长579 bp的序列片断(S1基因)。并以之为模板,进行PCR扩增,扩增产物被克隆至pGEM-Teasy载体进行序列测定。然后将S1基因插入植物表达载体pCAMB IA2301的35S启动子和NOS终止子之间,构建植物表达载体pCS1。将重组体转化大肠杆菌E.coliXL1,并对重组体进行了鉴定。结果:酶切鉴定和序列分析显示,克隆的目的基因与设计的片断序列一致;双酶切表明,植物表达载体的构建完全正确。结论:成功地克隆了S1基因和构建了含有S1基因的植物表达载体,为进一步获得抗SARS的转基因植物疫苗打下了基础。     

果实特异性启动子驱动的含sbr基因植物高效表达载体的构建

目的 构建果实特异性启动子驱动的含编码变形链球菌唾液粘附区(sbr)植物表达载体,进一步提高外源目的基因的表达,为研制有效的转基因植物防龋疫苗打下基础。方法提取番茄基因DNA,利用PCR技术扩增果实特异性启动子E8和2A11基因,双酶切质粒。PROP及PROSC,分别与目的基因连接,构建重组植物表达载体。结果通过双酶切鉴定,目的基因片段已正确整合到植物表达载体中。结论本实验成功构建了果实特异性启动子驱动的含sbr基因的植物表达载体。     

基因微阵列分型与实时荧光定量PCR检测人乳头瘤病毒

目的评价基因微阵列分型方法与实时荧光定量PCR技术检测人乳头瘤病毒及其对宫颈癌患者诊断的意义。方法基因微阵列检测人乳头瘤病毒21种亚型;实时荧光定量PCR技术定量检测人乳头瘤病毒6/11型和16/18型。结果基因微阵列检测人乳头瘤病毒较实时荧光定量PCR技术阳性检出率更高(P<0.05),而在特异性上无显著差异(P>0.05)。两种方法联合检测可以提高检测特异性和敏感度。结论基因微阵列分型方法可用于宫颈癌筛查,而实时荧光定量PCR技术对宫颈癌患者疗效判断和预后更有意义。     

实时定量PCR检测BK病毒时尿样本的优化处理

目的建立简便有效的样本处理方法,提高实时荧光定量PCR法检测尿液中BK病毒载量的敏感性和准确性。方法任意选择24例BK病毒阳性样本,每一样本进行4种不同的处理:原尿、原尿病毒DNA提纯、1:10稀释尿液、1:100稀释尿液,实时荧光定量PCR法检测各组样本BK病毒载量,所测数据用SPSS11.0进行统计学分析。结果4种不同的处理方法对实时荧光定量PCR法检测尿液中BK病毒载量有明显的影响:原尿阴性3例,病毒载量在4组中的最低值占66.7%;1:100稀释尿阴性2例,病毒载量在4组中的最高值占79.2%,但中位值和1:10稀释组差异无统计学意义;DNA纯化组与1:10稀释尿液病毒检出率相当,均为100%,但DNA纯化组目标基因的流失量较明显。结论在临床尿液中BK病毒载量检测时,1:10稀释尿在实时荧光定量PCR检测BK病毒时DNA损失小,效率高,且处理过程简便、成本低,是一种较好的尿样本处理方法。