C-Jun蛋白对糖皮质激素受体表达及转录激活能力的影响

目的观察促进与抑制c-Jun蛋白表达对糖皮质激素受体(GR)表达和转录激活能力的影响,探索c-Jun与GR功能的相互关系.方法采用基因重组技术,构建PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒,电穿孔法分别转染U937细胞c-Jun蛋白表达真核载体与PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒,观察c-Jun表达对GR表达和转录激活能力的影响.结果成功构建PAVU6-c JunsiRNA干涉质粒,转化U937细胞后GR的表达和转录激活活性有增强,而转染c-Jun表达载体pCMV-c JunGR的表达和转录激活活性有所减弱.结论c-Jun蛋白表达水平对GR的表达和转录激活活性有影响,抑制c-Jun蛋白表达,一定程度上可促进GR表达并增强其转录激活功能.     

C-Jun蛋白对糖皮质激素受体表达及转录激活能力的影响

目的观察促进与抑制c-Jun蛋白表达对糖皮质激素受体(GR)表达和转录激活能力的影响，探索c-Jun与GR功能的相互关系。方法采用基因重组技术，构建PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒，电穿孔法分别转染U937细胞c-Jun蛋白表达真核载体与：PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒，观察c-Jun表达对GR表达和转录激活能力的影响。结果成功构建PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒，转化U937细胞后GR的表达和转录激活活性有增强，而转染c-Jun表达载体pCMV-c JunGR的表达和转录激活活性有所减弱。结论c-Jun蛋白表达水平对GR的表达和转录激活活性有影响，抑制c-Jun蛋白表达，一定程度上可促进GR表达并增强其转录激活功能。     

LPS调节U937细胞上B7-H1表达的初步研究

目的了解脂多糖（LPS）刺激后U937细胞上B7-H1的表达变化情况。方法培养U937细胞,用荧光半定量实时PCR和流式细胞仪技术,分别观测未刺激和用LPS刺激的U937细胞B7-H1mRNA与蛋白的表达情况。结果未经刺激的U937细胞组成性表达B7-H1,LPS刺激可显著增强B7-H1基因mRNA的转录和蛋白的表达。结论LPS在转录与翻译两个环节均可上调U937细胞B7-H1的表达水平。     

维生素D3诱导的U937细胞中CD14表达的实验研究

目的: 探讨维生素D3诱导U937细胞上CD14蛋白的表达及其对内毒素 (LPS)刺激的反应性。方法: 用0. 1μmol/LVitD3与U937细胞共同培养 24h诱导CD14基因的表达, 并观察U937细胞对不同浓度的LPS刺激不同时间的反应性。结果: VitD3能稳定诱导U937细胞表达CD14mRNA和CD14蛋白。经VitD3诱导的U937细胞对LPS刺激的敏感性显著增强, 表现为低浓度LPS刺激即能诱导该细胞核中NF -κB激活, 促进TNF- αmRNA的转录和表达, 并将表达的TNF α释放入培养上清中。结论: VitD3能诱导U937细胞中CD14基因和蛋白的表达, 并增加其对LPS刺激的反应性。     

TM-TNF-α介导的反向信号协同增强sTNF-α对U937细胞的激活作用

目的用sTNFRⅠ预先激活TM-TNF-α介导的反向信号，观测其对sTNF-α激活单核细胞系U937细胞的影响。方法预先用sTNFRⅠ与U937细胞作用30min，洗涤后加入sTNF-α作用不同时间，观测预激活反向信号对sTNF-α刺激U937产生活性氧、胞内促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8 mRNA的转录及IkB-α水平(Western blot)的影响。结果单独用sTNFRⅠ激活的反向信号并不影响U937细胞的功能，而预激活反向信号能协同增强sTNF-α刺激U937细胞产生活性氧，且呈sTNFRⅠ浓度、sTNF-α浓度依赖关系；预激活反向信号协同增强sTNF-α刺激U937炎性细胞因子mRNA(TNF-α、IL-1β、IL-8等)的转录水平；并促进U937细胞IkB-α的降解。结论预先激活TM-TNF-α介导的反向信号协同增强sTNF-α对U937的激活作用，提示反向信号可能参与机体对早期炎症反应的调节。     

地塞米松对PMA诱导CD18表达的抑制作用

目的:研究GC抑制CD18表达的作用。方法:选用PMA刺激下的U937细胞为实验模型,运用定量RT-PCR、Northern杂交检测U937细胞CD18 mRNA的表达水平。结果:Dex能明显抑制PMA诱导CD18 mRNA的表达,这种抑制作用具有明显的剂量依赖性,GR的拮抗剂RU38486能够明显扭转Dex的抑制作用。结论:Dex通过GR介导能在转录水平上抑制PMA诱导的CD18 mRNA的表达,该作用可能与糖皮质激素受体(GR)在转录水平拮抗NF-κB有关。     

TWEAK蛋白对肝癌细胞增殖的影响

目的 观察TWEAK蛋白对肝癌细胞系增殖的影响,探讨TWEAK对肝癌细胞增殖的作用.方法构建PAVU6-TWEAK siRNA干涉质粒,转染HepG2和QGY7703肝癌细胞株,MTT法检测抑制TWEAK蛋白表达对肝癌细胞增殖的影响,并于培养体系中加入TWEAK蛋白,检测肝癌细胞增殖活性.结果成功构建PAVU6-TWEAK siRNA干涉质粒,转化肝癌细胞后肝癌细胞增殖受抑.肝癌培养体系中加入TWEAK蛋白后,肝癌细胞增殖活性有所增强.结论 TWEAK蛋白可促进肝癌细胞的增殖活性,抑制TWEAK表达,一定程度上可抑制肝癌细胞增殖.     

上调c-myc基因的表达对U937白血病细胞的影响

 目的：构建稳定表达外源c-myc基因的人单核细胞白血病细胞株U937,并初步分析其特性。方法：首先构建重组质粒MSCV-c-myc-IRES-GFP （MMIG）载体,分别用MMIG及空载体MSCV-IRES-GFP（MIG）包装病毒,并感染U937细胞,用流式细胞术分选绿色荧光细胞,获得 U937/GFP和U937/MYC细胞,用荧光显微镜及流式细胞术检测GFP阳性率,用Western blotting测定细胞中c-Myc、survivin、X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）和Bcl-2的蛋白表达水平,流式细胞术检测U937/GFP和U937/MYC细胞周期,并用MTT法测定U937/GFP和U937/MYC细胞的生长情况,克隆形成实验检测克隆形成能力。结果：荧光显微镜观察,MIG和MMIG病毒感染后,2种细胞均表达绿色荧光蛋白;流式细胞术结果显示,MIG病毒感染的细胞荧光率为26.0%,MMIG病毒感染的细胞荧光率为277%;Western blotting的结果显示,c-Myc蛋白在MMIG病毒感染的细胞中表达水平升高。流式细胞术分选后,荧光显微镜观察可见绿色荧光蛋白表达明显增多,U937/GFP和U937/MYC细胞绿色荧光蛋白表达率分别达98.7%和93.7%。 U937/MYC细胞中c-Myc蛋白表达较U937/GFP细胞显著升高,c-Myc蛋白下游的survivin表达增多,而凋亡相关蛋白XIAP及Bcl-2的表达则没有明显变化。细胞周期检测显示,U937/MYC细胞处于S期的细胞数增多。MTT实验结果显示,U937/MYC细胞的生长速率较U937/GFP细胞增快。U937/MYC细胞的克隆形成能力较U937/GFP细胞强。结论：成功构建了c-myc基因高表达的U937稳定细胞株U937/MYC。在U937/MYC细胞中,c-Myc及其下游的survivin表达明显上调,处于细胞周期S期的细胞数增多、细胞生长加快、克隆形成能力增强,提示c-Myc可能通过增强自我更新能力、加快细胞周期、促进相关抗凋亡蛋白表达从而提高细胞的存活率。     

PMA对U937细胞CD18mRNA表达的诱导作用及其机制

目的:研究PMA对CD18mRNA表达的促进作用及机制。方法:选用PMA刺激下的U937细胞为实验模型,运用定量RT-PCR方法检测U937细胞CD18mRNA的表达水平。结果:PMA具有浓度和时间依赖性地诱导U937细胞CD18mRNA表达的作用,这种作用能分别被PKC、NF-κB抑制剂所抑制,但不能被转录因子AP-1抑制剂所抑制。结论:PMA能激活细胞的PKC,进而通过其后的信号转导通路促进CD18mRNA的表达,转录因子NF-κB为PMA刺激下的U937细胞CD18基因转录所必需,而AP-1则相反。     

TM-TNF-α介导的反向信号下调sTNF-α激活后U937细胞因子mRNA的表达

目的：观测TM-TNF-α介导的反向信号对sTNF-α激活后U937细胞因子mRNA的影响，构建TM-TNF-α胞浆段缺失突变体，并进一步验证。方法：sTNF-α激活U937细胞后撤除，加入可溶性TNFR（sTNFRⅠ）激活TM-TNF-α介导的反向信号，用RT—PCR方法检测反向信号对活化后U937细胞因子IL-1β、IL-8 mRNA的影响；采用分子克隆技术构建TM-TNF-α胞浆段缺失突变重组体，采用电穿孔法转染U937，并用Western blot检测蛋白表达。结果：sTNF-α激活U937细胞后撤除，高表达的细胞因子IL-1β、IL-8 mRNA随着时间的延长而逐渐降低；sTNFRⅠ激活的TM-TNF-α介导的反向信号可加速细胞因子mRNA的降解，且使mRNA降解至50％的时间分别由约75、60分钟缩短至约45、35分钟。成功构建TM-TNF—α胞浆段缺失突变重组体pcDNA3．0-△csTM-TNF—α并瞬时转染U937细胞，Western blot结果显示U937细胞膜表面除表达26000的野生型TM-TNF-α蛋白外，还可表达约20000的突变体蛋白。这种缺失胞浆段的突变体蛋白可竞争性抑制反向信号对活化后U937细胞因子mRNA的下调作用。结论：TM-TNF-α介导的反向信号可下调sTNF-α激活后U937细胞因子mRNA的表达；且TM-TNF-α胞浆段为其介导的反向信号所必需。     

SiRNA沉默JAB1表达抑制肝癌细胞增殖

 目的 观察沉默Jab1基因表达对人肝癌细胞HepG-2增殖的影响。方法 利用RNA干扰技术构建PAVU6-JAB1 siRNA干扰质粒,将其转染HepG-2细胞,采用Real-time PCR、Western blot等方法对Jab1表达进行检测,WST-8、流式细胞分析对细胞增殖的影响。结果 成功构建PAVU6- JAB1 siRNA干扰质粒,转染HepG-2细胞后Jab1蛋白表达量较对照组明显降低,P27kip1蛋白表达量明显升高 (P<0.01)。转染96 h后能显著抑制细胞增殖活性,由空载体转染组的99.6%?1.4%降至70.8%?1.6%。结论 构建靶向Jab1基因的干扰质粒能下调Jab1基因的表达,上调P27kip1蛋白水平,并抑制HepG-2细胞在体外的增殖活性。     

GAMMA-INTERFERON (IFN-γ) AUGMENTS APOPTOTIC RESPONSE TO MISTLETOE LECTIN-II VIA UPREGULATION OF FAS/FAS L EXPRESSION AND CASPASE ACTIVATION IN HUMAN MYELOID U937 CELLS

Mistletoe lectin-II, a major composition of Korean mistletoe (Viscum album coloratum), is known as a potent apoptosis inducer. The previous research has demonstrated that Korean mistletoe lectin-II induces apoptosis via c-Jun N terminal kinase (JNK) activation in human myeloid U937 cells. The purpose of this research is to prove the synergistic action of mistletoe lectin-II and interferon-γ (IFN-γ) in the apoptotic cytotoxicity of U937. When U937 cells were treated with mistletoe lectin-II after being differentiated by IFN-γ, the proteolytic activity of caspase-3 and 9 was markedly elevated and that of caspase-8 was prolonged for 18 hr. The activation of caspase-3-like protease requires the earlier cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase(PARP). Caspase-1 was, however, not activated during the resting phase and nor in IFN-γ-differentiated U937 cells. Western blot analysis revealed that, in IFN-γ-differentiated U937 cells, the expression of Fas (CD95/APO-1) & Fas ligand(FasL) increases the apoptotic sensitivity against Mistletoe lectin-II. Fas (CD95/APO-1) & FasL were not significantly induced solely by mistletoe lectin-II. Furthermore the activity of JNK1 in U937 cells was also markedly increased with IFN-γ-differentiation, compared to that of the control. These results suggest that the IFN-γ-differentiation of U937 cells increases the susceptibility to mistletoe lectin-II-induced apoptosis.     

Gamma-interferon (IFN-gamma) augments apoptotic response to mistletoe lectin-II via upregulation of Fas/Fas L expression and caspase activation in human myeloid U937 cells

Mistletoe lectin-II, a major composition of Korean mistletoe (Viscum album coloratum), is known as a potent apoptosis inducer. The previous research has demonstrated that Korean mistletoe lectin-II induces apoptosis via c-Jun N terminal kinase (JNK) activation in human myeloid U937 cells. The purpose of this research is to prove the synergistic action of mistletoe lectin-II and interferon-γ (IFN-γ) in the apoptotic cytotoxicity of U937. When U937 cells were treated with mistletoe lectin-II after being differentiated by IFN-γ, the proteolytic activity of caspase-3 and 9 was markedly elevated and that of caspase-8 was prolonged for 18 hr. The activation of caspase-3-like protease requires the earlier cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase(PARP). Caspase-1 was, however, not activated during the resting phase and nor in IFN-γ-differentiated U937 cells. Western blot analysis revealed that, in IFN-γ-differentiated U937 cells, the expression of Fas (CD95/APO-1) & Fas ligand(FasL) increases the apoptotic sensitivity against Mistletoe lectin-II. Fas (CD95/APO-1) & FasL were not significantly induced solely by mistletoe lectin-II. Furthermore the activity of JNK1 in U937 cells was also markedly increased with IFN-γ-differentiation, compared to that of the control. These results suggest that the IFN-γ-differentiation of U937 cells increases the susceptibility to mistletoe lectin-II-induced apoptosis.     

ＩＬ—６在Ｕ９３７细胞中特异、持续激活ＳＴＡＴ３

目的 探讨ＩＬ－６在Ｕ９３７细胞中产生生物学效应的信号转导基础。方法 检测ＩＬ－６对Ｕ９３７细胞生长与分化的影响。并采用凝胶阻滞电泳法,检测ＩＬ－６在Ｕ９３７细胞中激活核因子的情况。结果 ＩＬ－６可诱导Ｕ９３７细胞向巨噬细胞方向分化。分化的细胞酸性醋酸酯酶（ＡＮＡＥ）活性、硝基蓝四唑（ＮＢＴ）还原能力及ＣＤ５４表达增强,ＳＴＡＴ３可被ＩＬ－６显著激活,其活性呈一定的剂量与时间依赖性;而ＮＦ－ＩＬ６、ＮＦ－kB、ＡＰ－１及其它ＳＴＡＴ家族成员则无明显激活。结论 Ｕ９３７细胞的终分化可能是ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３通路介导的。