人Sox2对CD133基因启动子的调控研究

目的构建人Sox2基因的真核表达载体并研究其对CD133基因启动子的调控。方法采用PCR方法,从人乳腺癌细胞MCF-7的cDNA中扩增出Sox2基因全长,将其定向克隆至真核表达载体pcDNA3.0中,构建重组质粒pcDNA-Sox2,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序正确后,分别将空载pcDNA3.0与重组质粒pcDNA-Sox2转染人神经胶质瘤U251细胞系,通过RT-PCR和Western blot方法,验证Sox2 mRNA和蛋白的表达。同样采用PCR方法,以人全基因组DNA为模板扩增CD133基因的启动子P1-3片段,并将此片段克隆到PGL3-basic荧光素酶报告基因质粒中,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序正确后,将空载PGL3-bas-ic与PGL3-CD133-p1-3转染人神经胶质瘤U251细胞系,用双荧光素酶检测方法分析Sox2对CD133基因转录水平上的调控。结果扩增出954bp的Sox2基因,并检测到重组质粒Sox2 mRNA和蛋白的表达。扩增出2440bp的CD133-p1-3启动子片段,且Sox2可上调CD133基因启动子的表达。结论成功构建了人Sox2基因真核表达载体,以及CD133启动子荧光素酶报告质粒,并检测到Sox2与CD133之间存在一定的调控关系,为进一步研究人Sox2对CD133的作用奠定了基础。     

中国人脑胶质瘤中表皮生长因子受体的表达

目的：研究中国人脑胶质瘤中表皮生长因子受体（EGFR）的表达及其在脑胶质瘤靶向性基因治疗中的意义。方法：应用免疫组化法检测人脑胶质瘤组织及瘤周组织EGFR的表达水平，检测人脑胶质瘤细胞株U87MG、U251MG和大鼠脑胶质瘤株C6表面EGFR的表达，筛选EGGR高表达胶质瘤细胞株作为靶向性非病毒载体基因转移系统的靶细胞。结果：肿瘤组织与瘤周组织的EGFR表达水平有显区别，肿瘤组织EGFR表达水平明显高于瘤周组织（P＜0．01）；肿瘤组织EGFR表达水平与肿瘤级别有显相关性，肿瘤级别越高，EGFR表达水平越高（P＜0．05）；人脑胶质瘤细胞株U251MG为EGFR相对高表达细胞株，其平均表达水平明显高于U87MG和C6细胞株。结论：中国人脑胶质瘤中存在表皮生长因子受体的过度表达，不同胶质瘤细胞株表皮生长因子受体的表达相差悬殊，EGFR可作为靶受体应用于脑胶质瘤的靶向性基因治疗。     

翼状胬肉上皮异常表达表皮生长因子受体家族

目的　了解表皮生长因子受体家族［表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor EGFR)、ErbB2及 ErbB3］在翼状胬肉上皮内的表达.方法　用免疫荧光组织化学及Western blot方法对15例初发性翼状胬肉患者切除的翼状胬肉组织中EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白进行检测,并与正常人结膜组织进行对照.结果　免疫荧光组织化学染色显示,在正常结膜上皮中,EGFR在其基底层细胞表达,而ErbB2及ErbB3则在其表层细胞表达.15例翼状胬肉上皮的11例EGFR、ErbB2及ErbB3表达方式与正常结膜明显不同,EGFR、ErbB2及ErbB3均在翼状胬肉上皮的全层表达,4例表达方式与正常结膜相似.Western blot检测进一步证实11例翼状胬肉上皮EGFR、ErbB2及ErbB3表达较正常结膜高.结论　翼状胬肉组织上皮EGFR、ErbB2及ErbB3表达增加,提示翼状胬肉可能是一组织增生性疾病,翳状胬肉上皮EGFR、ErbB2及ErbB3的异常表达及其与其上皮下组织相互作用可能是翼状胬肉发病的重要原因之一.     

LRIG1过表达对顺铂诱导的胶质瘤细胞凋亡的影响及其机制

目的 研究过表达富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains-1,LRIG1)对顺铂(cisplatin,CDDP)诱导的胶质瘤细胞U251凋亡的影响及其机制.方法 应用脂质体介导的基因转染技术将对照质粒(EGFP-N1)及LRIG1质粒(EGFP-N1-LRIG1)分别转染胶质瘤细胞系U251,设为对照组和LRIG1过表达组,用Real-time PCR检测转染后LRIG1表达水平;用Annexin Ⅴ/7AAD双标流式细胞术检测细胞凋亡;用Western blot检测各目的 蛋白表达水平.结果 LRIG1过表达组LRIG1 mRNA及蛋白均较对照组明显增高;0、10、20 μg/mL CDDP作用下,LRIG1过表达组细胞凋亡率均明显高于对照组(P<0.01);随着CDDP浓度增加,胶质瘤细胞U251磷酸化表皮生长因子受体(P-EGFR)表达增加;不同浓度CDDP作用下,LRIG1过表达组P-EGFR水平均较对照组明显降低,促凋亡蛋白Bax,Caspase-3表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低.结论 LRIG1通过下调P-EGFR水平而促进顺铂诱导的胶质瘤细胞凋亡,增强胶质瘤细胞对顺铂的敏感性.     

LRIG1对胶质瘤细胞中表皮生长因子受体的抑制作用及其机制

目的 验证LRIG1在胶质瘤细胞中对表皮生长因子受体(EGFR)的抑制作用,探讨其作用机制.方法 采用激光共聚焦显微镜及Western blot法检测LRIG1质粒转染前后神经胶质瘤H4细胞中EGFR和LRIG1的亚细胞定位和表达情况.结果 在H4细胞中LRIG1低表达,EGFR高表达,均主要为膜表达;转染LRIG1质粒后,LRIG1表达增强,EGFR表达下降.结论 LRIG1主要位于胶质瘤细胞膜上,对膜受体EGFR有抑制作用,参与EGFR的负反馈调节.     

翼状胬肉上皮异常表达表皮生长因子受体家族

目的：了解表皮生长因子受体家族[表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor EGFR）、ErbB2及ErbB3]在翼状胬肉上皮内的表达。方法：用免疫荧光组织化学及Western blot方法对15例初发性翼状胬肉患切除的翼状胬肉组织中EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白进行检测，并与正常人结膜组织进行对照。结果：免疫荧光组织化学染色显示，在正常结膜上皮中，EGFR在其基底层细胞表达，而ErbB2及ErbB3则在其表层细胞表达。15例翼状胬肉上皮的11例EGFR、ErbB2及ErbB3表达方式与正常结膜明显不同，EGFR、ErbB2及ErbB3均在翼状胬肉上皮的全层表达，4例表达方式与正常结膜相似。Western blot检测进一步证实11例翼状胬肉上皮EGFR、ErbB2及ErbB3表达较正常结膜高。结论：翼状胬肉组织上皮EGFR、ErbB2及ErbB3表达增加，提示翼状胬肉可能是一组织增生性疾病，翳状胬肉上皮EGFR、ErbB2及ErbB3的异常表达及其与其上皮下组织相互作用可能是翼状胬肉发病的重要原因之一。     

EGFR信号通路调控人胶质瘤U87细胞侵袭转移的分子机制

目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)信号通路与人胶质瘤细胞(U87细胞)增殖和侵袭转移的关系及调控分子机制。方法表皮生长因子(EGF,100ng/mL)、EGFR抑制剂———AG1478(10μmol/L)单独和联合处理U87细胞,采用MTT法和Transwell小室体外侵袭实验检测U87细胞增殖和体外侵袭能力;明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9的表达水平;Western blot法检测磷酸化EGFR(P-EGFR)、磷酸化AKT(P-AKT)蛋白表达。结果 EGF(100ng/mL)增加P-EGFR和P-AKT蛋白表达,使加药后24h和48h的细胞生长率分别提高了19.25%、22.32%(P<0.05),使12h过膜细胞数由(27±4)个上升到(126±3)个(P<0.05),促进U87细胞的MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05);AG1478(10μmol/L)可以阻断EGF增加P-EGFR和P-AKT蛋白表达的作用(P<0.05),并具有时间依赖性(P<0.05),减弱U87细胞体外侵袭能力(P<0.05),抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表达(P<0.05)。结论 EGFR-PI3K/AKT信号通路参与调节U87细胞增殖和侵袭转移过程,其机制可能是EGFR-PI3K/AKT信号通路活化后,导致MMP-2和MMP-9蛋白的表达增加,对细胞外基质的破坏增强。     

达托利司抑制替莫唑胺耐药恶性胶质瘤细胞增殖的机制研究

目的探讨达托利司（DAC）抑制替莫唑胺（TMZ）耐药恶性胶质瘤细胞增殖的机制。方法采用浓度梯度递增法构建TMZ耐药U251细胞（U251R细胞）,并分为DAC组、DAC干预的表皮生长因子受体（EGFR）低表达组（KD组）、DAC干预的EGFR过表达组（OE组）和对照组。采用钙黄绿素和碘化丙啶双染色法、赫斯特染色法检测细胞死亡比例和凋亡比例。采用Westernblot法检测EGFR、B细胞淋巴瘤（Bcl-2）、切割半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved-Caspase3）蛋白表达水平。采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测EGFRmRNA相对表达水平。结果DAC组和KD组细胞死亡比例、细胞凋亡比例、Cleaved-Caspase3蛋白表达水平均高于对照组,EGFR、Bcl-2蛋白表达水平均低于对照组,OE组细胞死亡比例、细胞凋亡比例、Cleaved-Caspase3蛋白表达水平均低于DAC组,EGFR、Bcl-2蛋白表达水平均高于DAC组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。DAC组和KD组EGFRmRNA相对表达水平均低于对照组,OE组EGFRmRNA相对表达水平均高于DAC组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论DAC能通过下调EGFR抑制TMZ耐药恶性胶质瘤细胞增殖。     

过表达缝隙连接蛋白Cx43与人脑胶质瘤细胞U251侵袭性的研究

目的 通过上调脑胶质瘤细胞U251的Cx43表达水平,检测其对U251侵袭能力的影响,为抑制肿瘤的恶性浸润提供新的治疗途径.方法 通过构建缝隙连接蛋白Cx43真核表达重组质粒,并转染U251细胞,过表达U251细胞缝隙连接蛋白Cx43,RT-PCR及Weston-blot检测Cx43 mRNA及蛋白表达水平变化.用Traswell细胞培养板结合MTT法测定U251细胞侵袭能力的改变.结果 (1)成功构建pCMV-Cx43 cDNA重组质粒.(2)成功转染U251细胞并筛选稳定转染过表达Cx43细胞株.(3)Traswell细胞培养板结合MTT法,检测到过表达Cx43后U251细胞侵袭能力较正常组下降.结论 过表达缝隙连接蛋白Cx43能抑制人脑胶质瘤细胞U251侵袭能力.     

鼻咽癌CNE-2细胞株胰岛素样生长因子-1受体和表皮生长因子受体沉默的放疗增敏机理

目的:评价RNA干扰(RNAi)同时沉默胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)和表皮生长因子受体(EG-FR)后生物学特性变化及对鼻咽癌CNE2细胞株放疗敏感性的改变。方法:构建荧光标记的靶向IGF-1R及EGFR信使RNA真核表达质粒,质粒转染鼻咽癌CNE2细胞株,共聚焦显微镜观察细胞转染结果,行平板克隆实验检测细胞存活分数;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期;Western-blot法检测细胞周期相关蛋白cdk4/6,cyclin D1和c-myc。结果:成功构建真核表达质粒;siRNA-IGF-1R和EGFR组的细胞存活分数显著降低(P<0.05),与对照组相比,凋亡率显著增高(P<0.05),G0/G1期细胞比例明显增多,而S期和G2/M期细胞比例明显减少,细胞周期相关蛋白cdk4/6,cyclin D1和c-myc蛋白表达降低(P<0.05)。结论:RNA同时干扰沉默IGF-1R和EGFR可以引起鼻咽癌细胞周期蛋白表达降低,细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。     

抑制泛素特异性蛋白酶9X表达对胶质瘤U251细胞生长及凋亡的影响

目的:研究抑制泛素特异性蛋白酶(USP)9X对胶质瘤U251细胞生长及凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法:CCK-8法检测抑制USP9X表达对U251细胞生长的影响,流式细胞术检测抑制USP9X对U251细胞凋亡的影响,Western Blot法检测USP9X对U251细胞蛋白水平的调控。结果:抑制USP9X表达对U251细胞生长有显著抑制作用;与对照组相比,实验组U251细胞凋亡率上升,实验组β-catenin蛋白的表达较对照组下调。结论:抑制USP9X表达可以抑制胶质瘤U251细胞的生长,促进细胞凋亡,抑制Wnt/β-catenin信号通路,是一个潜在的治疗胶质瘤的分子靶点。     

中国人脑星形胶质细胞瘤中表皮生长因子受体的表达

目的：研究中国人脑星形胶质细胞瘤中表皮生长因子受体（EGFR）的表达，并探讨其临床意义。方法：应用免疫组化方法（Evision-HRP法）检测人脑星形胶质细胞瘤标本（含配对瘤周组织）以及体外培养的多株人和大鼠胶质瘤细胞系的EGFR表达。结果：人脑星形胶质瘤组织EGFR阳性表达率为70．3％（26／37），明显高于瘤周组织（32．4％，12／37），两者差别非常显著（P＜0．01），病理分级为Ⅲ-Ⅳ级肿瘤标本EGFR阳性表达率为21／25，显著高于I－Ⅱ级者（5／12，P＜0．01）。体外实验显示人脑胶质瘤细胞株U251MG、U87MG以及大鼠脑胶质瘤细胞株C6和EGFR平均表达水平分别为“ ”、“－～＋”、“＋”。结论：中国人脑星形胶质瘤存在EGFR的过度表达，提示EGFR可能是恶性脑胶质瘤细胞的重要标志物。     

miR-638通过靶向调控Notch 4促进神经胶质瘤细胞的侵袭能力

目的 研究微小RNA-638(miR-638)在恶性胶质瘤中的表达,探讨miR-638在胶质瘤细胞侵袭过程中的作用及可能机制.方法 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测正常神经组织、胶质瘤组织、正常胶质细胞株、胶质瘤细胞株中miR-638的表达水平;Transwell实验检测分别转染miR-638模拟物和miR-638抑制物后U251细胞侵袭水平的改变;生物信息学预测和验证miR-638对Notch 4的靶向调控关系;构建Notch 4真核表达重组质粒(pCMV-Notch 4 cDNA)过表达U251细胞中的Notch 4表达水平,并检测U251细胞侵袭水平的改变.结果 miR-638在胶质瘤组织和细胞株中表达上调,而Notch 4在胶质瘤细胞中表达下调,两者表达呈负相关性;过表达miR-638使U251细胞的侵袭细胞数上升(P<0.01),而抑制miR-638表达后U251细胞的侵袭细胞数减少(P<0.01);miR-638在U251细胞中能直接靶向抑制Notch 4的表达,提升Notch 4在U251细胞中的表达能使侵袭细胞数减少(P<0.01).结论 miR-638在胶质瘤中高表达,其可能通过靶向抑制Notch 4的表达促进胶质瘤细胞的侵袭能力.     

siRNA介导表皮生长因子受体基因沉默导致HepG2凋亡

目的：研究含有与EGFR基因序列相同的19nt序列RNAi质粒针对HepG2细胞表皮生长因子受体的RNA干扰效果。方法：用pSIREN-hE转染细胞,其质粒骨架为RNAi-Ready pSIREN-Shuttle Vector,含有可以被U6启动子转录成shRNA的寡核苷酸链,大小为69nt,含有2段19nt的寡核苷酸,用于编码EGFR基因的RNA干扰的siRNA的正义链及反义链,评价该RNAi质粒对人肝细胞癌细胞株（HepG2）EGFR基因的mRNA表达抑制效果及对细胞凋亡的作用。结果：HepG2细胞EGFR基因的mRNA被明显抑制并伴有凋亡增加。结论：含有与EGFR基因序列相同序列RNA质粒对EGFR基因的RNA干扰可能是治疗肝细胞癌的一种有效手段。     

脑胶质瘤细胞中TRAIL受体的表达

目的:研究TRAIL受体（TRAIL-R）在脑胶质瘤细胞中的表达。方法:应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法对43例脑胶质瘤组织标本、6例正常脑组织及U251胶质瘤细胞株的TRAIL-RI-R4的mRNA表达进行检测。结果:43例脑胶质瘤中有32例同时表达TRAIL-R1-B3（74.4％）,未检测到TRAIL-R4的表达;U251细胞株中仅检测到TRAIL-R2、TRAIL-R3的表达。结论:脑胶质瘤细胞中TRAIL-R1～R3普遍表达,“诱骗”受体模式可能受其它因素的影响与调控,TRAIL-R4在脑胶质瘤的细胞凋亡调控中可能不起重要作用。     

YAP通过激活自噬调控脑胶质瘤细胞血管生成拟态的形成

目的:探讨yes相关蛋白(YAP)参与胶质瘤细胞血管生成拟态(VM)调控的可能机制.方法:采用Western blot检测不同人脑胶质瘤细胞系HS683、H4、U118、U87和U251中YAP的表达,筛选出YAP高表达的U251细胞系和YAP低表达的U87细胞系.采用慢病毒感染干扰U251细胞系YAP的表达、上调U8...     

NNRG/ErbB信号通路在神经系统中的研究进展

神经调节蛋白(NRG)是一类细胞间信号转导蛋白,其功能性受体是由ErbB酪氨酸激酶受体组成,属于跨膜酪氨酸激酶的表皮生长因子受体家族成员,包括表皮生长因子受体(也称ErbB1)、ErbB2/人源的ErbB2/neu、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。NRG通过诱导ErbB受体构象变化,使ErbB蛋白形成二聚体,继而激活酪氨酸激酶,引起C-末端的自身酪氨酸磷酸化和反式酪氨酸磷酸化,引起下游信号通路转导从而发挥其生物学作用。     

miR-18b-5p调控WWOX对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的研究miR-18b-5p对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响和潜在的分子机制。方法qRT-PCR检测癌旁组织和胶质瘤组织中miR-18b-5p的表达,MTT法和流式细胞术检测胶质瘤U251细胞增殖和凋亡率,Western blotting检测包含WW域的氧化还原酶基因（WWOX）、Cyclin D1、p21、Bax和Bcl-2蛋白表达,双荧光素酶报告系统验证miR-18b-5p和WWOX的调控关系。结果与癌旁组织相比,胶质瘤组织中miR-18b-5p的表达量升高（P < 0.01）。抑制miR-18b-5p表达可以抑制胶质瘤U251细胞增殖并促进细胞凋亡;miR-18b-5p靶向负调控WWOX的表达;过表达WWOX可抑制U251细胞增殖并诱导细胞凋亡;抑制WWOX表达逆转了抑制miR-18b-5p表达对U251细胞增殖、凋亡的影响（P < 0.01）。结论miR-18b-5p可能通过靶向调控WWOX表达抑制胶质瘤U251细胞增殖并诱导细胞凋亡,miR-18b-5p是胶质瘤潜在的分子靶点。     

脑胶质瘤中PROX1表达与患者预后的关系及其生物学作用

目的 探究同源盒蛋白1(PROX1)的表达水平与脑胶质瘤患者预后的关系及其生物学作用。方法 利用基因表达谱交互分析(GEPIA)数据库进行脑胶质瘤患者中PROX1的表达水平分析和生存分析。选择2015年5月至2021年12月在中国人民解放军空军军医大学第一附属医院神经外科收治的75例脑胶质瘤患者，分别收集患者肿瘤组织标本以及肿瘤旁正常组织标本，采用免疫组化染色检测组织中PROX1表达，根据随访数据进行患者生存分析。将U251细胞分为对照组、si-NC组和si-PROX1组。si-NC组和si-PROX1组U251细胞分别转染si-NC和si-PROX1,对照组U251不做转染处理。通过EdU实验检测U251细胞增殖水平，通过流式细胞术实验检测U251细胞凋亡，通过Transwell实验检测U251细胞迁移和侵袭水平，采用qRT-PCR和Western blot分别检测U251细胞中PROX1、血管内皮生长因子C(VEGFC)和血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)的mRNA和蛋白表达水平。结果 GEPIA数据库分析结果显示，PROX1在胶质母细胞瘤(GBM)组织中高表达。临床组织标本分...