不同人羊膜间充质干细胞冻存液冻存细胞效果比较

目的:筛选冻存人羊膜间充质干细胞效果较好的冻存液.方法:①不同配方的细胞冻存液对细胞冻存效果的影响.人羊膜问充质干细胞培养至第三代后分为10组,分别加入以下10种不同组成的冻存液.A组:70%DMEM/F12+20%胎牛血清+10%DMSO;B组:60%DMEM/F12+30%胎牛血清+10%DMSO;C组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%DMSO;D组:90%胎牛血清+10%DMSO;E组:70%DMEM/F12+20%胎牛血清+10%甘油;F组:60%DMEM/F12+30%胎牛血清+10%甘油;G组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%甘油;H:90%胎牛血清+10%甘油;I组:90%DMEM/F12+10%DMSO;J组:90%DMEM/F12+10%甘油.调整细胞密度为5×106mL-1,放入程序降温盒中,入-80℃低温冰箱保存.1个月后复苏,MTT法筛选出吸光光度值较高的一种冻存液.②相同血清含量细胞冻存液对细胞冻存效果的影响.含体积分数为50%胎牛血清的细胞冻存液分3组保存细胞.K组:45%DMEM/F12+50%胎牛血清+5%DMSO;L组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%DMSO;M组:35%DMEM/F12+50%胎牛血清+15%DMSO;复苏冻存的细胞后.将细胞按冻存前的数量调整至5×1O5mL-1,台盼蓝染色后,计算细胞的成活率.在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况.结果及结论:配方为45%DMEM/F12+50%胎牛血清+5%DMSO的冻存液冻存复苏人羊膜间充质干细胞后细胞的成活率最高(P<0.05);冻存复苏后细胞的生长状况较好.     

不同转染法用于第三代慢病毒包装系统包装效率的比较

目的 比较分别经磷酸钙转染法和脂质体转染法建立的第三代慢病毒包装系统的包装效率.方法 制备并纯化完整的重组慢病毒三质粒系统：转移质粒（PXZ171）、包装质粒（△NRF）以及包膜蛋白质粒（VSV-G）.分别用磷酸钙法和脂质体法将三质粒共转染包装细胞293T,72 h后收集病毒上清,批量快速测定法测定病毒滴度并进行比较.结果 磷酸钙转染法所产病毒滴度约达到脂质体转染法的1/10.结论 磷酸钙转染法获取的病毒滴度稍低,但价格相对便宜,病毒产量亦可满足实验要求.比较适合在普通实验室中开展.     

LILRB2过表达慢病毒载体以及THP-1-LILRB2稳转细胞株的构建

目的 采用慢病毒载体(lentivirus, LV)感染并探究其在人髓系白血病单核细胞(human myeloid leukemia mononuclear cells, THP-1)中的最佳感染条件,之后病毒包装白细胞免疫球蛋白样受体B2(leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2, LILRB2)的过表达病毒载体并感染THP-1细胞,最终嘌呤霉素筛选出经mRNA和蛋白水平均成功验证LILRB2过表达效果的THP-1稳定转染细胞株,为研究LILRB2在单核细胞中的作用提供前提条件。方法 LILRB2过表达慢病毒载体以pLV-SFFV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro为慢病毒骨架载体,通过Xba I与BamH I位点插入经聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增的LILRB2基因片段构建而成。待筛选阳性克隆与测序鉴定后,病毒感染预实验确定感染复数(multiplicity of infection, MOI);以293T细胞包装病毒,浓缩后获得的原液进...     

不同冻存液对人羊膜间充质干细胞-80 ℃冻存与复苏效果的影响

目的:观察不同冻存液对人羊膜间充质干细胞冻存复苏后的存活率及再培养情况的影响,并探索简单有效的冻存与复苏方法.方法:将含有血清培养基短期体外培养的人羊膜间充质干细胞分为4组,分别加入不同冻存液(体积分数):A组10%二甲基亚砜 40%胎牛血清 50%DMEM/F12,B组10%二甲基亚砜 90%胎牛血清,C组5%二甲基亚砜 4.5%羟乙基淀粉 20%胎牛血清 70.5%DMEM/F12,D组10%胎牛血清 90%DMEM/F12.以相同方法冻存并复苏细胞,比较4组细胞回收率及再培养情况.结果:A、C 2组细胞复苏后回收率高于另外2组(P均<0.05),且于复苏后再培养24 h内出现较多贴壁细胞.结论:以5%二甲基亚砜 4.5%羟乙基淀粉 20%胎牛血清 70.5%DMEM/F12作冻存液冻存羊膜间充质干细胞效果好.     

慢病毒转染人骨髓间质干细胞研究

目的:分离培养人骨髓来源间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法:采取全骨髓贴壁培养法分离培养人骨髓MSCs。利用脂质体法进行慢病毒感染人骨髓MSCs。结果:分离培养出人骨髓来源的MSCs,并用携带绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的慢病毒成功感染人骨髓MSCs。结论:获得人骨髓MSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰,为间质干细胞基因工程和组织工程研究奠定了基础。     

IGF-Ⅱ基因RNAi慢病毒载体构建与稳定转染细胞株建立

目的构建人的IGF-Ⅱ基因RNA干扰慢病毒载体并建立人肾上腺皮质瘤细胞株SW-13稳定转染细胞株。方法根据人的IGF-Ⅱ基因序列,设计3条针对IGF-Ⅱ-shRNA序列,分别构建pLLU2G-shIGF-Ⅱ3个慢病毒载体。筛选出最有效沉默靶基因的shRNA后,将携带目的序列的慢病毒载体转染到293FT细胞中,感染人肾上腺皮质瘤细胞株SW-13,建立稳定转染细胞株。结果设计的针对IGF-Ⅱ的序列中第3条的抑制效果最好,下调80%。以此目的序列构建稳定转染细胞株,对IGF-ⅡmRNA抑制率达95%。结论成功构建表达人肾上腺皮质瘤IGF-Ⅱ-shRNA的慢病毒载体,它能有效沉默IGF-Ⅱ基因在人肾上腺皮质瘤细胞株SW-13中的表达并建立稳定转染细胞株。     

淋巴细胞不同转染方法比较

目的:用病毒转染和非病毒转染方法将质粒载体转染进淋巴细胞,比较各种方法转染淋巴细胞的效率,确定适合淋巴细胞最佳转染方法。方法:分别用脂质体转染法,电穿孔转染法,慢病毒感染法,核转染法将构建好的酪氨酸羟化酶(TH)基因干扰质粒转染小鼠淋巴细胞,24小时后经荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达水平,确定转染率。结果:核转染法转染TH基因干扰质粒进入淋巴细胞的效率明显高于其他转染和感染方法,24小时后通过观察EGFP的表达确定转染效率可达50%~60%。结论:核转染方法是转染免疫细胞的有效手段,是体外分子生物学方法研究免疫功能的理想手段。     

IL-2依赖细胞株的冻存方法

小鼠细胞毒T-淋巴细胞(CTLL-2)的生长增殖必须特异地依赖白细胞间素Ⅱ(IL-2),许多实验室常以该细胞增殖的程度作为检测IL-2活性的指标。但是CTLL-细胞株对生长环境的要求相当严格,用常规方法难以在液氮中冻存。有的实验室虽冻存成功,但复     

慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞研究

目的分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal stemcells,BMSCs）并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法利用密度梯度离心法分离、纯化、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞。以脂质体法进行慢病毒感染大鼠BMSCs。结果分离培养出大鼠BMSCs,并用携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒成功感染大鼠BMSCs。结论获得大鼠BMSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰,为骨髓间充质干细胞基因治疗研究奠定了基础。     

CD151基因RNAi慢病毒载体构建与稳转细胞株建立

目的构建人的CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立A549-CD151i稳定细胞株。方法根据人的CD151基因序列,设计三对RNAi序列,筛选出有效序列,利用此有效序列,合成相对应的Oligo DNA,退火后形成黏性末端的DNA双链,与双酶切后的pshRNA—Lentivector载体连接得到LV—CD151i慢病毒载体,转化TOP10感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,并进行测序鉴定。用LV—CD151i和包装质粒共转染慢病毒包装用293T细胞,生产慢病毒并检测获得的病毒滴度。利用所获得的慢病毒感染A549细胞,筛选稳定转染细胞株。结果测序证实,成功构建CD151RNAi的慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为5×10^8ifu,并利用此病毒悬液,成功感染A549细胞,筛选到稳定表达细胞株。结论成功构建人CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立稳定的A549-CD151i细胞株。     

腺病毒介导慢病毒载体的细胞转染

目的 尝试利用腺病毒介导慢病毒载体的细胞感染以提高转染效率。方法 以多聚赖氨酸粘合腺病毒和慢病毒载体形成复合体后感染Hela细胞，测定慢病毒载体目的基因表达的变化并用激光共聚焦扫描显微镜观察慢病毒载体的细胞摄人情况，进一步了解抗腺病毒衣壳球部的抗体能否干扰这种变化以证明腺病毒是否参与此介导作用。结果携带大肠埃希菌半乳糖苷酶(pgalactosidase，pgal)基因的慢病毒载体Lenti^-VSVG对Hela细胞的感染率非常低，通过多聚赖氨酸与腺病毒(AdenoPL)形成复合体后感染率显著上升并呈剂量依赖性。激光共聚焦扫描显微镜显示Lenti^-VSVG被细胞摄取的数量在和腺病毒粘合后显著增加。抗腺病毒衣壳球部抗体能抑制直至阻断Lenti^-VSVG／AdenoPI。复合体两者各自携带基因(分别是β-gal和荧光素酶／绿色荧光蛋白融合蛋白)的表达。结论 通过多聚赖氨酸的物理连接，腺病毒能介导慢病毒载体的细胞摄入从而提高转染效率。     

大鼠FasL基因重组慢病毒载体介导大鼠肾脏转染的实验研究

目的:使用FasL重组慢病毒载体通过大鼠肾动脉转染SD大鼠肾脏,观察转染后目的基因表达,为进一步进行移植实验奠定基础。方法:SD大鼠30只随机均分为实验组和对照组,实验组大鼠经肾动脉注入10 ng FasL重组慢病毒载体,对照组注入10 ng空白慢病毒载体,于转染后第3、7、15、25、40天分别采集标本,HE和IHC染色,观察组织形态、测定灰度值,并进行统计学分析。结果:各时段HE染色未见细胞形态改变及炎细胞浸润。IHC染色示转染后表达高峰出现于转染后第15天组。15天组与空白对照组差异有统计学意义(P0.05)。结论:大鼠FasL基因重组慢病毒载体成功转染大鼠肾脏并表达目的基因。     

不同冻存方法对脐血造血细胞的影响

目的 探讨不同冻存方法对脐血造血细胞的影响。方法 冻存前后脐血单个核细胞通过台盼蓝拒染率、对K562杀伤活性及总集落形成数来进行检测。结果 控制冻存保护剂浓度和程序性降温可减小对脐血造血细胞的损害。结论 该研究可为脐血建库提供一种较好的冻存方法。     

二甲基亚砜与甘油两种冻存保护液对细胞保护作用的比较

本文对二甲基亚砜与甘油两种冻存保护液保护细胞作用进行了比较观察。结果发现，对耐药的肿瘤细胞株进行冻存时，在冻存液中加入１０－１５％甘油为保护液其细胞存活率明显高于用二甲基亚砜为保护液。同时加入保护液与未加保护液冻存的细胞其存活率具有高生差异。     

慢病毒介导大鼠卵巢基因转染的实验研究 *

目的 研究活体大鼠卵巢中慢病毒载体介导的基因转染及表达情况。方法 慢病毒载体(携带GFP的Bcl-2-HIV-I)注射大鼠卵巢实质,分别于注射后1、3、7、14、28天处死大鼠（每个时间点实验组n=2,对照组n=2,空白对照组n=2）,通过 Western-blot 电泳检测报告基因的表达。结果 实验组大鼠可见Bcl-2基因的表达,明显高于对照组和空白对照组Bcl-2基因的表达。 结论 慢病毒能有效的将外源基因导入活体大鼠卵巢而无明显毒副作用。     

冻存血与新鲜血的DNA抽提效果的比较研究

目的探讨一种简单便捷、可用于PCR扩增的人体外周血标本冷冻保存的方法。方法外周血标本冷藏于普通冰箱冷冻室2-4周,采用常规方法,提取28例新鲜血标本及31例冻存血标本的DNA,经2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶分析软件半定量分析,比较冻存血和新鲜血的DNA抽提效果。采用PCR方法扩增抽提DNA标本的ABCB4基因外显子6,研究冻存血中提取的DNA能否用于PCR实验。结果新鲜血组的光强度值为24948.98±10246.97,冻存血组DNA标本的光强度值为22917.65±11545.63,两组间无显著性差异(P>0.05)。所有冻存血中提取的DNA标本,经PCR扩增均有目标带。结论简易冷冻保存的外周血标本中提取的DNA质量与新鲜血无明显差别。冻存血的DNA标本可以用于PCR实验。     

慢病毒转染脐血CD34+造血干细胞方法的优化

目的 探讨慢病毒载体系统转染人脐血CD34+造血干细胞优化的转染方法.方法 采用第二代、第三代慢病毒载体系统,通过改变病毒浓度、感染体积、感染复数(MOI)值、感染方式、感染时间和感染后培养基等各方面条件,将表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒pTRIPdU3-RNAiTALh-EF1a-GFP转染CD34+干细胞,于37℃、5％ CO2的孵箱中培养14 d后,在光学显微镜下进行集落计数和分类,并与未转染的CD34+干细胞进行比较,从而筛选出优化的转染方法.结果 三质粒系统的第二代慢病毒载体转染率高于四质粒系统的第三代慢病毒载体.优化的转染条件为:新鲜分选的CD34+细胞于当日(0 d),在含病毒滴度107TU、Polybrene 2 μg/mL的optiMEM培养液中,细胞和病毒混合液于平底12孔板孔中,200×g离心1h,离心后继续共培养8h,再换新的病毒液200×g离心1h,共培养8h.按照含细胞因子的液体培养基:半固体培养基=1∶1的比例配置转染后培养基,继续培养,可以获得较高感染率.感染病毒后的CD34+干细胞培养14 d后,与未感染的CD34+细胞相似,可以形成各类血细胞集落.结论 优化的慢病毒转染方法可以有效感染CD34+造血干细胞,而不影响干细胞的分化功能.     

胃肠道肿瘤冻存组织原代细胞培养的实验研究

目的探讨冻存胃肠道肿瘤组织复苏后原代细胞培养的可行性方法。方法采用胎牛血清、RPMI Medium 1640培养液、二甲基亚砜（DMSO）配制冻存液,复苏以此冻存液冷冻保存的8例胃肠道肿瘤组织并行原代细胞培养,另复苏2例未加冻存液直接冻存的胃肠肿瘤组织为对照组。结果8例冻存液保存的胃肠道肿瘤组织原代细胞培养均获成功,成功率为100%。对照组2例未加冻存液冻存的肿瘤组织培养失败。结论 复苏应用冻存液冻存的胃肠道肿瘤组织进行原代细胞培养可获得成功,细胞生长时间与冻存时间及肿瘤细胞恶性程度有关,采用高浓度血清冷冻保存效果较好。     

含人干细胞白血病基因慢病毒载体转染Cajal样间质细胞的效果研究

目的 观察携带增强绿色荧光蛋白（GFP）的含人干细胞白血病（SCL）基因慢病毒载体转染体外培养的豚鼠膀胱Cajal样间质细胞（ICC）的效果。方法 2014年10月-2015年8月,选取普通级成年健康豚鼠16只。构建含人SCL基因的慢病毒载体,并标定病毒滴度;采用随机数字表法选取健康豚鼠4只,采用颈椎脱臼方法将其杀死,体外培养豚鼠膀胱ICC。设置不同感染复数（MOI）（0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0）,利用含人SCL基因的慢病毒载体转染ICC,在激光共聚焦显微镜下观察ICC生长状态并计算转染效率,确定最佳MOI。采用随机数字表法将ICC分为正常对照组、空白质粒对照组与慢病毒转染组,其中正常对照组加入1%磷酸盐缓冲液（PBS）,空白质粒对照组加入空慢病毒,慢病毒转染组按最佳MOI加入含人SCL基因的慢病毒载体,计算各组转染效率,确定最佳转染时间。采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测SCL mRNA表达情况。上述实验均独立重复4次。结果 经测定,病毒滴度为5×108 TU/ml。倒置显微镜下发现一些特征性梭形细胞,其两侧有显著外凸分枝,细胞核较大,其外形规则,有序地实现细胞贴壁,而其他未贴壁细胞则呈现与ICC不一样的形态,胞体多为椭圆形,细胞两极无突起,整体形状扁平。激光共聚焦显微镜下可以发现酪氨酸蛋白激酶生长因子受体（c-kit）受体成功表达,证实培养的细胞是膀胱ICC。观察各组ICC生长状态,当MOI为0.5、1.0、5.0、10.0时,细胞生长状态较好,无细胞死亡,当MOI为50.0、100.0时,可见部分细胞死亡,细胞活性降低;MOI为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为0.5时（P＜0.05）;MOI为5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为1.0时（P＜0.05）;MOI为10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为5.0时（P＜0.05）;MOI为50.0、100.0时的转染效率高于MOI为10.0时（P＜0.05）;综合ICC生长状态及转染效率,确定含人SCL基因慢病毒载体转染ICC的最佳MOI为10.0。正常对照组、空白质粒对照组ICC中无GFP表达;慢病毒转染组转染3 d时ICC中GFP表达强度高于转染2 d、转染5 d时,确定含人SCL基因慢病毒载体转染ICC的最佳转染时间为3 d。慢病毒转染组中扩增产物大小与目的片段大小1 036 bp一致,而正常对照组及空白质粒对照组均未见特异性条带表达,表明SCL基因成功导入ICC。结论 利用含人SCL基因慢病毒载体能高效转染体外培养的ICC,并成功介导SCL基因在ICC中的表达,为下一步研究利用SCL基因进行体内转染实验奠定基础。     

程控冻存对NK细胞杀伤作用影响的研究

以~3H-TdR释放法和效靶细胞结合试验检测程控冻存前后单个核细胞(MNC_(?))中NK细胞杀伤活性。结果当效靶细胞比例为20∶1、60∶1、100∶1时,程控冻存后即刻、冻存7天和冻存30天的MNC(?)中NK细胞杀伤活性与冻存前无显著性差异,冻存复苏后早期效靶细胞结合率降低,在预培养12小时左右恢复至冻存前水平。以间接免疫荧光法检测冻存前后MNC_(?)中heullb、leul9阳性细胞亚群百分率无显著差异。