HBV－DNA套式一次PCR方法的建立

应用乙型肝炎病毒ＤＮＡＣ基因区的一对外引物（ＨＢＣ＿１和ＨＢＣ＿２，扩增片段长度为５６６ｂｐ）及一对内引物（ＨＢＣ＿３和ＨＢＣ＿４，扩增片段长度为３０１ｂｐ）对不同稀释度的ＨＢＶ－ＤＮＡ（ａｄｒ亚型）进行套式一次ＰＣＲ扩增，结果表明灵敏度可达到１０ａｇ水平。此方法快速、简便、灵敏、材异，与分子杂交的灵敏度相当。     

PCR直接扩增与套式扩增用于HLA—DR基因分型的研究

人类ＨＬＡ抗原分型在人类学、法医学、疾病易感性及器官组织移植等研究中有重要的意义。在骨髓移植中，进行供者、受者ＨＬＡ配型，选择相合的供体，减少ＧＶＨＤ发生，是移植成功的关键。     

用多重及套式PCR同时检测血清中的HBV和HCV方法的建立

首次应用多重及套式ＰＣＲ技术同时检测人血清中的ＨＢＶ和ＨＣＶ。将抽提的ＨＢＶＤＮＡ和（或）ＨＣＶＲＮＡ在含ＡＭＶ逆转录酶、ＴａｑＤＮＡ多聚酶以及ＨＢＶ和ＨＣＶ外套引物的ＰＣＲ缓冲引物的ＰＣＲ缓冲液中进行逆转录后连续进行ＰＣＲ扩增，以第一轮扩增产物为模板，在含ＨＢＶ和ＨＣＶ内套引物的ＰＣＲ反应体系中进行第二轮扩增，产物经电泳后，以ＤＮＡ分子量标志物或已知片段做参考，出现５２３ｂｐ和（或）２６０ｂｐ产     

PCR直接扩增与套式扩增用于HLA－DR基因分型的研究

人类ＨＬＡ抗原分型在人类学、法医学、疾病易感性及器官组织移植等研究中有重要的意义。在骨髓移植中，进行供者、受者ＨＬＡ配型，选择相合的供体，减少ＧＶＨＤ发生，是移植成功的关键。目前国内主要采用血清学方法进行ＨＬＡ配型。由于方法上的缺点，常有约２０％左右的误差率，因此，基因分型技术的研究与应用势在必行。该研究通过设计合成ＨＬＡ基因序列特异性引物，建立了ＨＬＡ－ＤＲ基因分型的套式扩增和直接扩增ＰＣＲ－ＳＳＰ技术，并在骨髓移植配型中进行了应用。对两种分型技术进行了对比，两种方法各有特点，套式扩增在高度同源的ＤＮＡ序列扩增中有高度的特异性，并具有高度的灵敏性，很少量的ＤＮＡ即可满足ＰＣＲ扩增，但需两次扩增，非同源因素影响增大；直接扩增操作简便，一次扩增完成分型，但结构同源因素对特异性影响大。两种方法经周密设计均有高度的准确性，可常规用于临床骨髓移植配型     

PCR扩增nuc基因快速检测金黄色葡萄球菌

为快速检测标本中金黄色葡萄球菌（以下简称金葡菌）。应用聚合酶链反应（ＰＣＲ），扩增金葡菌ｎｕｃ基因，并与培养法进行比较分析。结果只有金葡菌扩增出一条特异的ＤＮＡ条带，平行对照的其它菌株均为阴性。说明用ＰＣＲ检测金葡菌的方法简便、快速、特异、敏感。     

从半合成噬菌体抗体库筛选抗角蛋白人抗体

目的;从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：经表皮角蛋白为抗原,通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体。用ＥＬＩＳＡ和ＤＮＡ指纹分析对所获抗体进行鉴定。结果：经过４轮筛选,获得２０个能与角蛋白结合的阳性克隆,其中可产生特异性抗蛋白抗体的克隆１８个。经ＤＮＡ指纹分析,判定所获克隆分别包含４个不同的Ｆａｂ段基因。     

人CD34单链抗体基因的构建及序列测定

目的：获得抗人ＣＤ３４单链抗体基因。方法;选用一株分泌抗ＣＤ３４抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株,提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出此抗本的重链可变区和轻链可变区基因,与Ｋａｂａｔ抗体库比国得到其框架区和互补决定区的氨基酸序列,重新合成两引引物去掉保留的分泌信号前导序列并加入适当的限制性内切酶酶切位点,再经ＰＣＲ得到所需要的重链可变区和轻链可变区基因,经一弹性连接肽连接构建成抗人ＣＤ３４的单链抗体（ｓ     

检测人巨细胞病毒的套式PCR法及在妇产科的临床应用

报告了检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）的套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）法，及其在妇产科临床应用的结果。改进了从临床样品中提取ＤＮＡ的方法，优化了套式ＰＣＲ的条件。测得套式ＰＣＲ的扩增倍数为２．９×１０￣９，套式ＰＣＫ／电泳法的灵敏度为４０个ＨＣＭＶ基因组拷贝。临床应用结果表明，孕妇的ＨＣＭＶ感染率很高，母婴间存在ＨＣＭＶ感染的垂直传播关系。胎盘是传播的主要途径，胎盘的屏障功能随妊娠时间的延长而减弱。宫颈分泌物的感染也是母婴间ＨＣＭＶ感染传播的感染源。ＨＣＭＶ感染对胎儿发育的影响，应引起优生优育工作者们的重视。     

HBV—DNA套式一次PCR方法的建立

应用乙型肝炎病毒ＤＮＡ Ｃ基因区的一对外引物（ＨＢＣ１和ＨＢＣ２，护增片段长度为５６６ ｂｐ）及一对内引物（ＨＢＣ３和ＨＢＣ４，护增片段长度为３０１ ｂｐ）对不同稀释度的ＨＢＶ－ＤＮＡ（ａｄｒ亚型）进行套式一次ＰＣＲ扩增，结果表明灵敏度可达到１０ａｇ水平。此方法快速、简便、灵敏、特异，与分子杂交的灵敏度相当。     

用三甲基甘氨酸克服G+C丰富靶基因的PCR扩增困难

为探讨三甲基甘氨酸等有机溶剂对G＋C碱基丰富基因PCR扩增困难的影响，分别用标准PCR和添加有甘油、二甲基亚砜（DMSO）、甲酰胺及三甲基甘氨酸的改进剂PCR对G＋C含量为70％的周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因（ARF）和G＋C含量为90％的胰岛素样生长因子受体Ⅱ（IGFRⅡ）进行扩增。结果显示，应用标准PCR及添加有甘油或甲酰胺的PCR均不能特异性扩出上述两基因；加入10％DMSO虽可扩出ARF基因但同时有非特异性产物；而加入三甲基甘氨酸可特异地扩增出642bp的ARF和540bp的IGFR Ⅱ基因。表明三甲基甘氨酸可消除G＋C丰富DNA区域二级结构对PCR扩增的干扰，明显促进这类基因的PCR扩增。     

PCR介导的大鼠再生肝cDNA文库构建

简介了ＰＣＲ技术介导的ｃＤＮＡ文库构建方法，其基本原理是在第一链ｃＤＮＡ３’端连接多聚Ｇ，进而以ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）和ｏｌｉｇｏ（ｄＣ）为引物，对第一链ｃＤＮＡ进行扩增，这一技术可能在分离亚细胞群特异基因中有重要作用。     

人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性抗核抗体(ANA)Fab片段噬菌体抗体库.方法 从4名ANA滴度大于1∶10 000的自身免疫病患者外周血淋巴细胞中抽提总RNA,用RT-PCR技术扩增免疫球蛋白分子轻链κ、λ基因及重链Fd基因.将轻链基因片段克隆入pComb3Hss载体以构建轻链文库,随后将重链基因载入κ/λ-pComb3Hss载体,形成κ/λ-Fd-pComb3Hss质粒,然后将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue.用辅助噬菌体M13 KO7感染XL1-Blue,随机的重组抗体文库即表达于丝状噬菌体表面.结果 扩增了长度为660bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了库容为2×104的轻链基因抗体库和库容为4×104的人Fab抗体库,获得了噬菌体滴度为2×109CFU/ml的富含人源性抗核抗体Fab片段的噬菌体抗体库.结论 成功构建了人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,为人源性抗核抗体Fab片段的制备以及进一步评价其在肿瘤免疫靶向治疗中的作用奠定了基础.     

大容量天然噬菌体抗体库的建立及多样性初步验证

目的:构建超大容量天然噬菌体抗体库.方法:从正常人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞(>180份),提取RNA,用RT-PCR分别扩增抗体可变区轻重链基因(VH和VL),通过重叠PCR技术将VH和VL连接为单链抗体ScFv形式,克隆插入到pDF噬菌粒载体,转化XL1-Blue细菌得到ScFv初级抗体库,并以高感染复数(MOI≥100)感染Cre 菌株BS1365,利用Cre/LoxP位点特异性重组原理,使VH和VL基因定向同源重组匹配,随后以低感染复数(MOI<1)感染XL1-Blue,获取次级工作库.分别用5种不同抗原进行筛选,所获阳性克隆送测序以获取抗体基因.结果:抗体V区基因得到有效扩增,初级库库容3.6×107,工作库容1.8×1011,5种不同抗原筛选均得到特异性结合噬菌体抗体;测序结果表明,所获取抗体涵盖了不同的基因亚群,进一步证明抗体库具有良好的多样性.结论:经Cre/Loxp定位重组系统成功构建了超大容量天然噬菌体抗体库,初步尝试对5种抗原进行筛选均获成功,提示该抗体库多样性较好,可用于制备人源抗体.     

菌落PCR快速分析抗体库重组率时的假阳性现象

目的　评价菌落PCR法鉴定噬菌体抗体库阳性重组率的可靠性。方法　鼠抗体基因Lc片段、Fd片段经酶切、纯化后 ,依次克隆入pComb3载体上相应的酶切位点 ,电转化XL1 blue菌后建立鼠源性Fab噬菌体抗体库。比较菌落PCR法、质粒PCR法及质粒酶切法鉴定转化菌阳性重组率的一致性。同时用空菌、空载体、空载体菌等作模板为对照PCR ,以排除相关组分的干扰。结果　建立的Lc库的库容为 1.175×10 6CFU ,Fab库的库容为 1.0 2×10 6CFU。 3种方法鉴定的阳性重组率不同 (Lc的重组率依次为 10 0 %、78%、78% ,Fd的重组率依次为 90 %、6 6 %、6 6 % ,Lc与Fd同时插入的重组率依次为 90 %、5 0 %、5 0 % )。菌落PCR法鉴定的重组率偏高 ,存在假阳性现象。对照PCR提示 ,XL1 blue菌本身可能是导致假阳性扩增的原因。结论　用菌落PCR法不能准确鉴定噬菌体抗体库的重组率 ,用质粒PCR法或质粒酶切法鉴定更为可靠     

利用PCR方法获得shRNA抑制内外源性基因的表达

目的探讨PCR法获得的shRNA对外源性基因和内源性基因表达的抑制效果。方法选择绿色荧光蛋白(GFP)和大鼠肾脏系膜细胞高丰度表达的纤维连接蛋白(FN)分别作为外源性和内源性基因的靶基因,设计特异性引物,利用PCR扩增获得shGFPRNA和shFNRNA。前者与pEGFP质粒共转染至293T细胞,48h后进行激光共聚焦检测细胞表达GFP阳性率;后者转染至大鼠系膜细胞(RMC)中,48h后提取总RNA逆转录成cDNA,经realtimeRTPCR检测FN的mRNA表达水平,提取细胞总蛋白进行Westernblot检测FN蛋白表达水平。结果PCR获得的shGFPRNA产物能有效抑制外源性基因GFP的表达,抑制效率可达70%±3.2%;shRNA转染组内源性基因FN的表达水平明显下降,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结论PCR方法可快速简单、廉价地获得shRNA,对内源性或外源性基因进行特异性抑制。     

+10 Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因cDNA文库的构建

目的构建＋10Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因的消减cDNA文库。方法本实验用SD大鼠，分别提取暴露组与对照组的总RNA，并分离纯化mRNA，应用抑制性消减杂交技术分离＋10GI重复暴露大鼠脑差异表达基因eDNA片段并建立消减eDNA文库；利用PCR对随机挑选的75个白色菌落进行插入片段的验证，对其中70个克隆进行eDNA斑点杂交验证。结果所构建的eDNA文库扩增后包含约400个白色克隆和100个兰色克隆，随机挑选75个白色克隆入质粒载体后共获得70个阳性克隆。结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了＋10Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因消减eDNA文库，为进一步筛选和克隆脑损伤相关基因奠定了基础。     

Examination of postmortem animal interference to human remains using cross-species multiplex PCR

Postmortem animal interference may be confused at first sight with injuries of vital origin, thus arousing suspicion of external violence preceding death. A reliable classification of the origin of such doubtful injuries is of crucial importance, a fact that is especially true for the investigation of suspected homicide and/or mammade body mutilation after death. In forensic pathology, the identification of injuries as caused by animals postmortem and the classification of a particular species as responsible for a specific injury pattern under question is usually done by forensic pathologists with vast practical experience and special knowledge of the appearance and morphology of tooth marks of carnivores and rodents, respectively. However, a molecular biological investigation of such wounds could provide genetic evidence that an injury pattern present on a corpse was truly caused postmortem by animal interference and thus support the pathologist's expertise. For this purpose, we developed a panel of small species-specific short-tandem repeat systems (<150 bp) for animals typically involved in postmortem scavenging of human remains, such as dogs and cats as well as wild-living rodents (mice and rats) having possible access to death scenes inside apartments or buildings. A specific and sensitive cross-species multiplex polymerase chain reaction was then established including the species-specific animal markers, thus enabling the genetic identification of wounds caused postmortem by different animals on human remains. This study was presented at the Sixth International Symposium in Advanced Legal Medicine (ISLAM), Hamburg, Germany, September 2006.     

利用T─载体克隆法对人脑源性神经营养因子全长基因PCR产物的克隆

利用Ｔ－载体克隆法完成了含信号肽及前导肽的人脑源性神经营养因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）全长基因ＰＣＲ产物的克隆。序列测定结果表明，所克隆的人ＢＤＮＦ基因从起始密码子ＡＴＧ到终止密码子ＴＡＧ的７７４ｂｐ中，除下游端ＰＣＲ引物因为采用猪的ＰＣＲ引物而有一个碱基改变外，其它序列与国外文献报道序列完全一致。该碱基改变不影响氨基酸序列     

用mRNA差异显示法筛选和鉴定反复高GZ暴露大鼠脑损伤相关基因

目的 筛选和鉴定反复高Ｇｚ暴露大鼠脑损伤相关基因。方法 １６只ＳＤ大鼠随机分为对照组、＋Ｇｚ重复暴露后３０ｍｉｎ、６ｈ和２４ｈ４组,每组４只。对照组大鼠Ｇ值为＋１Ｇｚ,实验组大鼠在动物离心机上经历了３次＋１４Ｇｚ／４５ｓ（两次间间隔３０ｍｉｎ）作用。分别于暴露后３０ｍｉｎ、６ｈ和２４ｈ处死大鼠取脑,提取总ＲＮＡ。取对照组和＋Ｇｚ暴露后６ｈ组大鼠脑总ＲＮＡ,用ｍＲＮＡ差异显示（ＤＤＰＣＲ）的方法,筛选＋Ｇｚ暴露大鼠脑差异表达基因。用３组锚定引物和６组随机引物作不同组合进行ＰＣＲ扩增。用Ｓｌｏｔ ｂｌｏｔ方法分析差异表达基因在对照组和＋Ｇｚ暴露后３０ｍｉｎ、６ｈ和２４ｈ组大鼠脑中表达情况。结果 获得的差异表达片段,经斑点杂交进一步筛选,克隆了３个强阳性片段,并进行序列分析,与Ｇｅｎｅｂａｎｋ等数据库进行同源比较,没