Legumain对肿瘤细胞侵润力和血管内皮细胞管腔形成的作用

目的探讨肿瘤组织中过度表达的一种天冬酰胺肽链内切酶Legumain在肿瘤细胞侵润性生长和血管内皮导管形成中的作用及相关机制。方法采用体外细胞培养的方法,观察在缺氧条件下人乳腺癌细胞MDA MB231和人静脉血管内皮细胞HUVEC中Legumain的蛋白表达量;观察Legumain对MDA MB231细胞的侵润能力的影响以及人工合成的Legumain抑制物(asparaginly endopepidase inhibitor,AEPI)对人静脉血管内皮细胞HUVEC小管腔形成能力的影响;用免疫组织化学的方法观察Legumain与整合素(Integrin)β1的结合情况。结果Western-blot的结果表明,在缺氧条件下,体外培养的人乳腺癌细胞MDA MB231和人静脉血管内皮细胞HUVEC的Legumain蛋白表达量增加。应用免疫荧光双染色法对缺氧条件下培养的MDA MB231细胞进行染色,与正常条件下培养的细胞相比,缺氧条件下培养的MDA MB231细胞体积增大,胞浆内含有大量绿色的Legumain,成点状分布,并有部分Legumain分布在迁移中的细胞表面前缘,与红色的整合素β1重叠,呈现为黄色。在血管内...     

体外共培养体系中胆管癌细胞对人脐静脉内皮细胞b-FGF和VEGF表达的影响

目的 探讨体外共培养体系中胆管癌细胞(QBC939)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 建立胆管癌QBC939细胞与HUVEC体外共培养体系,采用CCK-8法检测共培养不同时相HUVEC的增殖;ELISA检测共培养上清液中b-FGF含量;qRT-PCR和Western blot检测共培养不同时相点HUVEC细胞VEGF mRNA和蛋白质的表达.结果 共培养后12、24、48 h和72 h,HUVEC增殖较对照组显著增高(P＜0.01).与0h组比较,共培养12、24、48 h上清液中b-FGF含量显著增高(P＜0.05).共培养12 h时VEGF mRNA表达显著增加,并持续至72 h(P＜0.01),VEGF蛋白表达在共培养12h后显著增高,24、48、72 h时与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 人胆管癌QBC939细胞可促进血管内皮细胞增殖、增加b-FGF分泌和VEGF表达.b-FGF和VEGF表达增加与肿瘤血管新生,以及肿瘤的生长和转移可能具有相关性.     

miR-210促进小鼠BMMSCs血管内皮生长因子的表达和分泌

目的 通过体内与体外的手段验证miR-210能够有效的促进骨髓间充质干细胞(BMMSCs)血管内皮生长因子(VEGF)的表达和分泌.方法 构建慢病毒载体,分别转染BMMSCs和人脐静脉内皮细胞(HUVEC),Lenti-miR-210/BMMSCs和Lenti-LacZ/BMMSCs培养第7天RT-PCR法检测VEGF表达,第14天Western blot法检测VEGF表达,PKH26荧光染色Lenti-miR-210/HUVEC和Lenti-LacZ/HUVEC,Matrigel成管实验24 h,荧光显微镜观察成管效果;agomir-210和agomir-NC分别与BMMSCs复合HyStem-HP凝胶缓释系统裸鼠皮下注射7d后取标本CD31免疫荧光染色.结果 miR-210慢病毒载体转染BMMSCs,第7天RT-PCR和第14天Western blot法检测VEGF表达,明显高于Lenti-LacZ/BMMSCs(P ＜0.05);Matrigel成管实验24 h结果显示:LentimiR-210/HUVEC组与Lenti-LacZ/HUVEC组相比,端端接触明显且管状结构完整;agomir-210和agomir-NC与BMMSCs复合HyStem-HP凝胶缓释系统裸鼠皮下注射7d后标本CD31免疫荧光染色结果:agomir-210组CD31阳性细胞含量明显高于agomir-NC组.结论 通过体内与体外的检测,miR-210过表达能够有效促进BMMSCs血管内皮生长因子的表达和分泌.     

糖基化白蛋白促内皮细胞小管样结构形成及其机制

目的 观察糖基化牛血清白蛋白(advanced glycated bovine serum albumin, AGE-BSA)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)小管样结构(tubule like structure,TLS)形成的影响并探讨其可能机制.方法 实验设实验组、实验对照组和空白对照组.实验组设25、50、100 μg/ml 3个AGE-BSA浓度;同时设置相同浓度的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)作为实验对照组;内皮细胞完全培养基作为空白对照组.各组设24、48、72 h 3个时相点,采用三维胶TLS形成实验和ELISA方法分别检测不同浓度AGE-BSA作用下HUVEC在Ⅰ型胶原中形成TLS的长度以及HUVEC自分泌血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的浓度.结果 在24～72 h内,浓度为25～100 μg/ml的AGE-BSA比相同浓度的BSA使HUVEC培养上清中VEGF的量和在胶原中分化形成TLS的长度均明显增加(P＜0.05).结论 AGE-BSA可通过刺激VEGF自分泌促进内皮细胞TLS形成,提示糖基化终末产物可能参与糖尿病视网膜血管生成.     

以体外共培养进行乳腺癌细胞株MDA-MB-231对正常内皮细胞作用研究

目的探讨乳腺癌细胞对正常内皮细胞的作用影响。方法建立了乳腺癌细胞株MDA—MB-231与正常内皮细胞的体外共培养体系，对以上述体系共培养后的正常内皮细胞进行形态学观察，血管新生观察和基因表达分析。结果经共培养后的内皮细胞的细胞形态和超微结构均与同期培养的正常内皮细胞对照明显不同且有血管管型形成，ESM、IGFBP-3、av83、VE-C、及Tie-2基因均明显表达上调。结论经与MDA—MB-231共培养后的内皮细胞有明显的趋瘤特征和血管新生能力，推测活体内乳腺癌组织中的新生血管内皮细胞性质与行为可能与正常内皮细胞不同。     

汉坦病毒感染对β3整合素及血管内皮生长因子受体2的作用

目的探讨汉坦病毒(HV)感染后β3整合素与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的变化及其对内皮功能的影响。方法本研究以体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为对象,应用黏附试验、Transwell技术及流式细胞技术,观察HV感染后HUVEC黏附和迁移能力的变化,分析β3整合素与VEGFR2在其中的作用及二者表达数量的变化。结果 HV明显抑制HUVEC黏附和迁移能力(P<0.05)。VEGF促进内皮细胞的黏附和迁移的能力可被β3整合素拮抗剂或HV感染所阻断(P<0.05),VEGF促进β3整合素表达的作用也可被HV抑制(P<0.05)。HV可以促进β3整合素及VEGFR2的表达(P<0.05),且二者呈密切正相关(r=0.846)。结论 HV感染对β3整合素、VEGFR2的功能及表达数量的影响可能是其致病机制之一。     

胆固醇致内皮细胞损伤对平滑肌细胞增殖和迁移的促进作用

目的观察胆固醇损伤人血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)后能否影响血管平滑肌(vascular smooth muscle,VSMC)的增殖与迁移。方法用12.5、25.0、50.0 mg/L 3个浓度的胆固醇作用体外培养的HUVEC 24 h后,再用培养内皮细胞的培养基继续培养VSMC 24 h,CCK-8、划痕实验检测VSMC增殖与迁移;用12.5、25.0、50.0 mg/L的胆固醇作用共培养的HUVEC、VSMC 24 h,用Transwell检测VSMC迁移。结果 25.0、50.0 mg/L胆固醇作用HUVEC后的培养基与对照组相比(1.37±0.01),明显促进VSMC增殖(1.53±0.06)、(1.54±0.10)(P<0.05);12.5、25.0、50.0 mg/L胆固醇作用HUVEC后的培养基与对照组相比(33.24±0.43)均能促进VSMC细胞迁移[(269.10±3.78)、(272.79±4.69)、(458.69±4.78),P<0.01]。胆固醇作用共培养的HUVEC、VSMC 24 h后,促进VSMC迁移[(175.00±4.63)、(182.00±4.13)、(207.00±5.59)],与对照组相比(101.00±2.33)差异明显(P<0.01)。结论胆固醇诱导HUVEC损伤后能够促进VSMC增殖与迁移。     

shRNA-CXCR4作用于CXCR4基因对乳腺癌血管生成潜力的影响

目的 研究shRNA-CXCR4作用于CXCR4基因对人乳腺癌细胞株诱导血管内皮细胞形成管腔能力的影响.方法 通过质粒shRNA-CXCR4沉默CXCR4基因后,RT-PCR、Western-blot检测3株人乳腺癌细胞的CXCR4 mRNA及其蛋白的表达;应用人乳腺癌细胞株与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)双室联合培养技术,观察人乳腺癌细胞株通过shRNA-CXCR4作用于CXCR4基因后诱导HUVEC形成管腔能力的影响.结果 质粒shRNA-CXCR4作用于3株人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-435S、MCF-7后能明显抑制其CXCR4基因的mRNA及蛋白表达水平:对乳腺癌细胞诱导的人脐静脉血管内皮细胞HUVEC形成管腔样结构的能力有显著的抑制作用(P<0.05).结论 shRNA-CXCR4作用于CXCR4基因后能明显抑制人乳腺癌细胞诱导管腔形成能力.     

JAG1影响血管生成并促进三阴性乳腺癌细胞的迁移、侵袭和粘附

目的 探究JAG1对三阴性乳腺癌（TNBC）恶性表型的影响,并研究乳腺癌微环境血管生成的机制。方法 体外培养人TNBC细胞231和231B,Q-PCR实验检测Notch相关分子的表达水平。动物实验将雌性裸鼠分为231组和231B组,5只/组,乳腺脂肪垫分别注射231和231B细胞1×106/只。4~6周取肿瘤组织进行免疫组化和免疫荧光实验。使用JAG1重组蛋白处理231细胞和DAPT处理231B细胞,实验分4组：231空白对照组;rJAG1处理231组;231B空白对照组;DAPT处理231B组。用CCK-8法、Hoechst 33258染色实验、划痕愈合实验、Transwell小室实验和内皮细胞粘附实验检测TNBC的生物学特性变化。使用Western blot检测231和231B生物学特性相关蛋白的水平。接下来体外培养血管内皮细胞HUVEC,TNBC条件培养基处理HUVEC,实验分5组：（1）HUVEC阴性对照组;（2）231空白条件培养基处理组;（3）rJAG1处理231的条件培养基处理组;（4）231B空白条件培养基处理组;（5）DAPT处理231B的条件培养基处理组。CCK-8实验和基质胶成管实验分别检测HUVEC的增殖与成管能力。结果 与231细胞相比,231B表达更高的JAG1（P<0.05）。231B肿瘤表达更高的VEGFA和CD31。与231空白组相比,rJAG1处理组中231细胞的迁移、侵袭和粘附能力明显受到促进（P<0.05）。Twist1和Snail的蛋白水平均增加（均P<0.01）,抗凋亡蛋白Bcl-2表达量增加（P<0.05）,而DAPT明显抑制231B的相关现象和指标。JAG1过表达的条件培养基增加了HUVEC的细胞数以及成管数量（P<0.05）。结论 JAG1可能影响TNBC的恶性表型,并促进微环境的血管生成。     

诱导正常血管内皮细胞具备肿瘤血管特性的研究

[目的]探讨用肿瘤细胞培养上清液诱导的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)是否具备肿瘤血管内皮细胞的特性,旨在寻找一种简便的方法,解决肿瘤血管内皮细胞不易获得的难题.[方法]HUVEC用含不同浓度人肝癌细胞株HepG2培养上清的条件培养液培养,3-(4,5-二甲基噻唑)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2氢-四唑盐法(MTS)检测其增殖率,免疫细胞化学法结合图像定量分析测量血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)的变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤内皮标记物1和8(TEM1、TEM8)的mRNA表达.[结果]含体积分数10%、20%、40%HepG2培养上清的条件培养液培养,HUVEC增殖率分别为71%、89%、109%.HUVEC用含体积分数50%HepG2培养上清液的条件培养液培养后,VEGFR2平均光密度值明显高于对照组(P＜0.05),且TEM1及TEM8呈阳性表达,而对照组不表达.[结论]HepG2上清液促进HUVEC增殖,增殖后的HUVEC具备肿瘤血管内皮细胞的特性.     

芦可替尼通过骨髓源性外泌体抑制原发性骨髓纤维化的血管新生

【目的】研究骨髓源性外泌体能否通过血管新生的机制促进原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis,PMF）的发生发展及芦可替尼能否在外泌体层面通过抑制血管新生从而抑制PMF的发生发展。【方法】采集初诊PMF患者（初诊组）、芦可替尼治疗后的PMF患者（RuT组）和ITP患者（对照组）骨髓液并提取外泌体。Western blot方法检测外泌体中促血管新生相关细胞因子的蛋白表达;CCK8法检测人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells ,HUVECs）的增殖能力;流式细胞术检测HUVECs细胞周期;划痕实验和Transwell 小室侵袭实验检测HUVECs血管新生能力;QT-PCR 和Western blot检测HUVECs细胞侵袭增殖相关因子mRNA及蛋白表达水平。【结果】1、与对照组相比,初诊组及RuT组外泌体中的VEGF、VEGFR1、HIF-1a、COX-2的蛋白表达水平更高（初诊组P值均< 0.01,RUT组除VEGFR1的P > 0.05外,余均< 0.05）,初诊组上述因子表达水平较RuT组更高（P < 0.01）。2、与对照组相比,初诊组、RuT组的外泌体可以诱导HUVECs增殖、迁移能力改善,差异均有统计学意义（初诊组P < 0.01,RUT组P < 0.05）,侵袭能力更强（初诊组P < 0.01,RUT组P < 0.01）。初诊组与RuT组相比,HUVECs增殖效果、迁移能力、侵袭能力改善更佳（P < 0.01）。3、与对照组相比,初诊组、RuT组的HUVECs合成期（S期）细胞比例更大,且初诊组S期细胞较RuT组比例更大。4、与对照组相比,初诊组、RuT组的HUVECs的MMP-2、MMP-9、FAK、PCNA的mRNA表达水平更高（初诊组均P < 0.01;RUT组FAK为P > 0.05,余均P < 0.01）,初诊组较RuT组的mRNA表达水平更高（P < 0.01）。5、与对照组相比,初诊组、RuT组的HUVECs的MMP-2、MMP-9、FAK、PCNA的蛋白表达水平更高（初诊组均P < 0.01,RUT组除FAK为P > 0.05外,余均P < 0.01或P < 0.05）,初诊组较RuT组蛋白表达水平更高（P < 0.01）。【结论】骨髓源性外泌体可通过血管新生机制促进PMF的发生发展,芦可替尼在外泌体层面能够抑制血管新生从而抑制PMF的发生发展。     

非小细胞肺癌细胞外泌体源性FZD10促进体外血管生成

目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）细胞外泌体源性FZD10在血管生成中的作用及其机制。方法 采用超速离心法分离外泌体,并利用Western blot和RT-qPCR技术分析NSCLC细胞（95D和H1299）、正常人支气管上皮细胞（BEAS-2B）及其外泌体中FZD10的表达;通过转染FZD10-siRNA敲低FZD10表达,用FZD10未敲低和敲低的NSCLC细胞外泌体分别处理HUVEC细胞,利用体外血管生成实验观察其成管能力,采用ELISA和RT-qPCR技术分析血管生成相关因子VEGFA和Ang-1的表达;进一步利用Western blot分析外泌体源性FZD10对信号通路PI3K、Erk1/2和YAP/TAZ激活的影响。结果 同BEAS-2B细胞及其外泌体相比较,FZD10在95D和H1299细胞及其外泌体中高表达（P<0.01）;95D和H1299细胞来源的外泌体可促进HUVEC的微管形成及VEGFA、Ang-1的蛋白分泌、m RNA的表达（P<0.01）,但在95D和H1299细胞敲低FZD10后这些效果受到抑制。FZD10的敲低可抑制PI3K、Erk1/2信...     

EBV 阳性人鼻咽癌细胞外泌体促进淋巴管新生与鼻咽癌淋巴结转移

目的 探讨EB病毒（EBV）阳性鼻咽癌细胞外泌体对淋巴管新生与鼻咽癌淋巴结转移的影响。方法 利用超速离心获得细胞外泌体,对外泌体进行Western blot与纳米颗粒追踪分析（NTA）鉴定。利用Dio染料吞噬实验,验证外泌体可以被淋巴管内皮细胞摄取。离体条件下,分别利用等体积培养基以及20 μg/mL 鼻咽上皮细胞（NP69）、HK1-EBV、C666-1细胞外泌体和除去外泌体的HK1-EBV与C666-1上清蛋白预处理淋巴管内皮细胞,检测淋巴管内皮细胞成管与迁移情况;在体实验,首先建立裸鼠腘窝淋巴结转移模型,负瘤裸鼠被随机分成4组,3只/组。对照组：腘窝处注射生理盐水（30 μL）;NP69外泌体组：10 μg/30 μL NP69外泌体;HK1-EBV除去外泌体上清组：10 μg/30 μL HK1-EBV除去外泌体上清蛋白;HK1-EBV外泌体组：10 μg/30 μL HK1-EBV外泌体。每2 d注射1次,共4次。结果 超速离心获得外泌体富含外泌体特异性蛋白,同时NTA鉴定表明其粒径范围正常;鼻咽癌细胞与NP69外泌体可以被淋巴管内皮细胞摄取;HK1-EBV与C666-1外泌体较空白对照组与NP69外泌体可显著促进淋巴管内皮细胞成管与迁移（P<0.05）,HK1-EBV与C666-1外泌体组与对应除去外泌体上清蛋白组间无显著性差异（P>0.05）;腘窝淋巴结转移实验发现：HK1-EBV外泌体较空白对照组、NP69外泌体以及除去外泌体的HK1-EBV上清蛋白可显著促进鼻咽癌细胞淋巴结转移以及局部淋巴管新生（P<0.05）。结论 EBV阳性鼻咽癌细胞外泌体能促进鼻咽癌淋巴管新生与淋巴结转移。     

胆管细胞癌来源的外泌体通过内质网应激破坏血管内皮细胞紧密连接实现转移

目的：探讨胆管细胞癌分泌的外泌体对血管内皮细胞紧密连接的影响及其可能的机制。方法：使用超速离心法分离胆管细胞癌CCLP细胞系外泌体并作用于人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,Western blot、免疫荧光检测内皮细胞的紧密连接。BALB/c裸鼠随机分为PBS组、exoCCLP组及exoHIBEC组并分别尾静脉注射PBS、exoCCLP或exoHIBEC后尾静脉注射FITC-右旋糖酐或CCLP,收集肺及肝脏观察组织内的FITC-右旋糖酐渗漏或肺组织内的肿瘤转移灶。Western blot及PCR检测CCLP外泌体处理的内皮细胞内质网应激相关基因及蛋白水平。予小干扰RNA抑制血管内皮细胞PERK、ATF6或IRE1α,并进一步接受CCLP外泌体作用,观察紧密连接蛋白变化。结果：①CCLP外泌体在体外明显下调HUVEC的紧密连接蛋白水平,增加血管内皮层体外的通透性,并在体内增加裸鼠肺部及肝脏血管的通透性。②经CCLP外泌体预处理后的裸鼠其肺部的肿瘤转移灶数量明显增加,内皮细胞内质网应激相关的基因及蛋白水平均明显增加,予小干扰RNA下调HUVEC的PERK及IRE1α水平能够逆转CCLP外泌体下调的HUVEC紧密连接蛋白而ATF6的敲低并无此作用。结论：胆管细胞癌来源的外泌体能够抑制血管内皮细胞的紧密连接蛋白并增加血管的通透性,从而实现肿瘤转移。这种作用部分是通过引起血管内皮细胞内质网应激实现的     

MiRNA-142-5p在大鼠角膜新生血管中的作用及机制研究

目的 观察microRNA-142-5p(miRNA-142-5p)对大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization,CorNV)的作用及其与VEGF/PI3 K/AKT通路的关联情况.方法 角膜缝线法诱导SD大鼠右眼CorNV作为实验组,左眼作为对照组.取缝线后第7天的角膜进行实时荧光定量聚合酶反应(Real-time PCR,RT-PCR)检测miRNA-142-5p以及VEGF mRNA的表达水平.将miRNA-142-5pmimic转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),RT-PCR检测miRNA-142-5p的表达量来验证转染是否成功.并通过RT-PCR和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HUVECs中VEGF及PI3 K/AKT mRNA和蛋白的表达量.分别用Transwell、CCK-8法及Matrigel胶管腔形成实验检测HUVECs的迁徙、增殖及管腔形成能力.结果 成功建立CorNV模型.RT-PCR结果显示7d组miRNA-142-5p(6.799±1.683)和VEGF(3.297±0.334)的表达量较正常角膜组(normal)显著升高(P＜0.01).转染miRNA-142-5p mimic后的miRNA-142-5p的表达量显著高于空白对照及阴性对照组(P＜0.01).Transwell、CCK-8及Matrigel胶管腔形成实验结果示miRNA-142-5p提高了HUVECs的迁徙、增殖及管腔形成能力(P＜0.01).转染miRNA-142-5p mimic后HUVECs中VEGF及PI3 K/AKT的mRNA及相应蛋白的表达均明显上升(P＜0.05).结论 CorNV中miRNA-142-5p及VEGF的表达明显上调,过表达miRNA-142-5p可以显著提高HUVECs中VEGF及PI3 K/AKT通路各主要成员mRNA和蛋白的表达水平,进而促进HUVECs的迁徙、增殖及管腔形成能力.表明miRNA-142-5p可通过PI3K/AKT通路参与CorNV的调控.     

穿心莲内酯抑制肿瘤细胞分泌物诱导的血管新生

目的：探讨穿心莲内酯(andrographolide,Andro)对人脐带静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)成管能力的影响。方法：将不同体积浓度的Andro溶液作用于HUVECs,采用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测细胞存活率。采用半数致死量(IC50)的Andro溶液作用于HUVECs,采用Matrigel胶使 HUVECs成管,通过计算成管率来评估Andro溶液对HUVECs成管能力的影响。此外,将A549细胞分泌物与Andro溶液 同时处理HUVECs,检测其成管情况。采用Western印迹检测Andro溶液对基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)表达水平的影响。结果：Andro溶液可抑制HUVECs的增殖,且呈浓度依赖性;Andro溶液对HUVECs的IC50为 20 μmol/L。选取20 μmol/L的Andro溶液作用于HUVECs 24 h,发现Andro溶液显著抑制HUVECs的成管能力。另外, A549细胞分泌物促进HUVECs成管作用,而Andro溶液拮抗肿瘤细胞分泌物对HUVECs成管的促进作用,降低MMP-9的表 达。结论：Andro能够抑制HUVECs成管,而且能够拮抗肿瘤细胞分泌物对HUVECs成管的促进作用,从而抑制血管新生。     

5-脱氧杂氮胞苷修饰的肝癌细胞来源胞外体对淋巴细胞增殖功能的影响

目的研究经5-脱氧杂氮胞苷(5-Aza-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理的肝癌细胞HepG2分泌的胞外体(exosomes)对免疫细胞增殖能力的影响。方法采用离心超滤等方法将经5-Aza-CdR处理和未处理过的肝癌细胞系HepG2细胞分泌的exosomes分离和纯化。Ficoll淋巴细胞分层液分离外周血单个核细胞(PMBC);将实验分为exosomes实验组(加药组)、exosomes对照组(未加药组)、加药exosomes提取后上清组、未加药exosomes提取后上清组、空白对照组。H3-TdR掺入法检测PBMC细胞增殖状况。结果 exosomes对照组及其上清液对淋巴细胞增殖功能有明显的抑制作用,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05);而exosomes及其上清液实验组对淋巴细胞增殖功能的影响明显减弱,与exosomes和上清液对照组比较存在显著的统计学差异(P<0.05),而与空白对照组无统计学上的差异(P>0.05)。结论经5-Aza-CdR修饰的exosomes及其上清液显著改善HepG2来源的exosomes对淋巴增殖功能的抑制作用。     

胰高血糖素样肽1对内皮祖细胞 增殖分化能力的影响及其机制

目的：探讨胰高血糖素样肽1（GLP-1）对体外培养的人外周血内皮祖细胞（EPCs）增殖分化能力的影响及可能的作用机制。方法：采用密度梯度离心法分离获得人外周血单个核细胞,培养7 d 后,收集贴壁细胞。贴壁细胞用不含FBS的M199培养液培养24 h后,分成4组：对照组和GLP-1各浓度组(1,10,20 nmol/L GLP-1共3组),分别用含0.2%BSA,1,10,20 nmol/L GLP-1的M199培养液培养72 h。倒置相差显微镜下观察EPCs生长情况,MTT法检测EPCs的增殖能力;RT-PCR技术检测EPCs中KDR, Flt-1, VE-cadherin, 内皮型一氧化氮合酶（eNOS） mRNA的表达, ELISA法测定细胞上清液内皮细胞生长因子（VEGF）浓度,SP法检测细胞VEGF蛋白表达。同时用100 ng/mL VEGF mAb对10 nmol/L GLP-1培养的EPCs进行干预。结果：与对照组比较,GLP-1各浓度组EPCs增殖明显（P＜0.05或P＜0.01）,EPCs中KDR, Flt-1, VE-cadherin, eNOS mRNA表达增强, 细胞上清液中VEGF浓度显著升高、细胞VEGF蛋白表达增强（P＜0.05 或 P＜0.01）。VEGF mAb（100 ng/mL）下调GLP-1培养的EPCs增殖能力,细胞KDR, Flt-1, VE-cadherin, eNOS mRNA表达下降。结论：GLP-1对体外培养的人外周血EPCs的增殖和分化能力具有一定的促进作用,上调VEGF自分泌是其可能的作用机制之一。     

前列腺素E2对大鼠巨噬细胞株NR8383 合成血管内皮生长因子促进人脐静脉血管内皮细胞成管、迁移 的影响

目的探究前列腺素E2（PGE2）对大鼠巨噬细胞株NR8383细胞合成血管内皮生长因子（VEGF）的调控作用以及对人脐静 脉内皮细胞（HUVEC）趋化成管的影响。方法分别采用0.1 nmol/L PGE2、1 nmol/L PGE2、1 nmol/L PGE2+10 nmol/L EP2受体抑 制剂AH6809+10 nmol/L EP4受体抑制剂AH23848 处理的NR8383 细胞作为各实验组,选择未经PGE2以及其特异性受体抑制 剂处理的NR8383 细胞作为对照组,采用Western blot 和qPCR方法检测各组NR8383细胞内VEGF蛋白以及mRNA的表达水 平;收集以上各处理组的细胞培养上清液分别刺激HUVECs,运用TRANSWELL 小室、Matrigel 胶细胞成管实验等实验方法, 观察PGE2调控巨噬细胞对HUVEC 迁移效应和成管能力的影响。结果随着NR8383 细胞培养液中加入PGE2浓度增高,其 VEGF蛋白表达和VEGF mRNA的表达水平显著升高（P<0.05）;0.1 nmol/L、1 nmol/L PGE2处理过的NR8383细胞培养上清液 可以显著增加HUVEC细胞形成的小管面积,形成小管面积随着PGE2处理浓度的增加而增加（P<0.05）;HUVECs的迁移运动也 随着PGE2处理浓度的升高不同程度的增强,HUVECs趋化的数量显著升高（P<0.05）;研究发现PGE2特异性的EP2/EP4 受体拮 抗剂AH6809/AH23848,可以显著抑制PGE2 增强NR8383 细胞内VEGF mRNAs 表达的作用并且也显著抑制PGE2 增强 NR8383细胞促进HUVECs成管和趋化能力的效应（P<0.05）。结论PGE2可以通过作用NR8383细胞表面对应的EP2/EP4受体 调控VEGF的合成,促进HUVEC趋化和成管效应。     

肾癌ACHN细胞exosome对自身细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨肾癌ACHN细胞来源的exosome对肾癌ACHN细胞自身增殖和凋亡的影响及机制。方法用超滤和蔗糖重水
密度梯度超速离心法分离纯化肾癌ACHN细胞分泌的exosome;采用CCK-8法评价exosome对肾癌ACHN细胞增殖的影响;
Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡的变化;RT-PCR和Western blotting检测CyclinD1、caspase-3mRNA和蛋
白的表达;Western blotting检测p-Akt、p-ERK1/2的变化。结果成功使用超滤和蔗糖重水密度梯度超速离心法分离纯化肾癌
ACHN细胞分泌的exosome。exosome可促进肾癌ACHN细胞增殖,抑制其凋亡;在此过程中,CyclinD1mRNA和蛋白的表达
均上调,而caspase-3mRNA表达无明显变化,caspase-3蛋白表达下调;同时p-Akt和p-ERK1/2的表达也上调。结论exosome
可促进肾癌ACHN细胞生长和增殖,抑制细胞凋亡。筛除肾癌微环境中的exosome或抑制其功能,可能成为肾癌治疗的有效新
方法。