人离体子宫在位内膜细胞的原代培养方法探讨

目的：比较不同的消化酶对人离体子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养的异同，为研究人体子宫内膜细胞生长、分化及药物作用机制提供一个较理想的实验方法。方法：将人离体子宫内膜细胞随机分为胰酶组、胶原酶组、胰酶组和胶原酶联合消化组进行消化分离和体外培养，用倒置相差显微镜观察细胞的生长状况及形态特点。结果：3组的培养成功率分别为53．33％、73．33％、86．67％。联合消化组较胰酶组培养成功高（氏0．05）。3种不同方法消化分离后的子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞贴壁、生长状况无明显差异（B〉0．05）。结论：采用胰酶与胶原酶联合消化法进行子宫内膜细胞消化分离和体外培养，较单用胰酶法细胞培养的成功率高，比单用胶原酶缩短了消化时间．具有降低培养成本的优点。     

子宫内膜异位症在位子宫内膜间质及腺上皮细胞高纯度分离培养技术的改进

目的对子宫内膜异位症(EMs)患者在位子宫内膜间质及腺上皮细胞进行高纯度分离、培养,改进子宫内膜细胞常规培养方法。方法通过酶解、过滤及贴壁纯化,分离和培养7例EMs组及5例正常组在位子宫内膜间质及腺上皮细胞,其中延长EMs组子宫内膜细胞消化时间及缩短其后的贴壁等待时间。结果 12例子宫内膜标本中10例培养成功,原代培养的间质细胞纯度率可达97%以上,原代培养的腺上皮细胞纯度率约95%。改良分离方法后获得的EMs组和正常组的间质及腺上皮细胞纯度及活性均提高。结论 EMs在位子宫内膜分离过程中延长消化时间及缩短贴壁时间,可作为对子宫内膜常规培养方法的改进。     

人离体子宫在位内膜细胞的原代培养方法探讨

目的:比较不同的消化酶对人离体子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养的异同,为研究人体子宫内膜细胞生长、分化及药物作用机制提供一个较理想的实验方法。方法:将人离体子宫内膜细胞随机分为胰酶组、胶原酶组、胰酶组和胶原酶联合消化组进行消化分离和体外培养,用倒置相差显微镜观察细胞的生长状况及形态特点。结果:3组的培养成功率分别为53.33%、73.33%、86.67%。联合消化组较胰酶组培养成功高(P<0.05)。3种不同方法消化分离后的子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞贴壁、生长状况无明显差异(P>0.05)。结论:采用胰酶与胶原酶联合消化法进行子宫内膜细胞消化分离和体外培养,较单用胰酶法细胞培养的成功率高,比单用胶原酶缩短了消化时间,具有降低培养成本的优点。     

人在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养

目的:探讨在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养方法,为研究子宫内膜异位症的发病机制提供体外细胞模型.方法:通过消化、过滤、沉降等方法,分离培养正常对照子宫内膜以及子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,模拟人体内雌激素水平研究促进细胞生长的方法,光学显微镜观察离体细胞形态.结果:正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达91.7%(11/12),子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞成功率为93.8%(15/16),子宫内膜异位症异位子宫内膜细胞成功率为75.0%(12/16).间质细胞传代2次后,生长缓慢,经雌激素作用后,生长明显改善;腺上皮细胞不能传代,经雌激素作用后,生长改善不明显.结论:体外分离培养的人子宫内膜细胞比子宫内膜异位动物模型更接近于人体的特点,在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养可作为研究子宫内膜异位症的体外细胞模型之一.     

人子宫内膜异位症在位内膜间质细胞原代培养方法探讨

目的 探讨子宫内膜异位症在位内膜间质细胞原代培养的最优方法.方法 40例子宫内膜异位症患者(增殖期和分泌期内膜各20例)的在位内膜组织随机分为4组,分别采用胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶消化,随机选择离心分离或筛网分离间质细胞,行细胞免疫组织化学染色(SP法)鉴定.结果 增殖期与分泌期内膜间质细胞培养成功率差异无统计学意义(χ2=3.68,P＞0.05).胰蛋白酶组的细胞培养成功率与其他3种胶原酶组的细胞培养成功率间差异有统计学意义(P＜0.05),3种胶原酶细胞培养成功率间差异无统计学意义(P＞ 0.05);I型胶原酶酶解所得间质细胞的单层汇聚时间[(5.0±0.8)d] 最短(P＜0.05);I型胶原酶和胰蛋白酶的细胞消化时间差异无统计学意义(P＞0.05),但短于Ⅱ型和Ⅳ型胶原酶(P＜0.05);筛网分离法与离心分离法在细胞培养成功率和细胞纯度上差异无统计学意义(P＞0.05),但前者的细胞单层汇聚时间[(6.0±0.3)d]短于后者[(6.5±0.4)d](P＜0.05).结论 月经周期不影响细胞培养成功率;采用I型胶原酶消化子宫内膜、筛网分离间质细胞是子宫内膜异位症在位内膜间质细胞培养的最好方法.     

原代人子宫内膜细胞分离及培养鉴定

目的：探究原代人子宫内膜细胞分离及培养的简易方法,并对其纯度及生物活性进行鉴定。方法采用胶原酶消化人子宫内膜组织,经2次筛网过滤、离心及贴壁纯化技术,分离、纯化培养人子宫内膜间质细胞（ESC ）和腺上皮细胞（EEC ）,用细胞角蛋白（cytokeratin）和波形蛋白（vimentin）免疫细胞化学染色法和免疫荧光方法对所分离的细胞进行鉴定。结果 ESC呈平行生长,细胞呈梭形或多角形,波形蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度达95％以上。EEC呈漩涡状生长,细胞呈多角形或蝌蚪形,细胞角蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度可达90％。结论应用胶原酶消化法及二次筛网过滤法成功分离并培养数量、活力和纯度高的子宫内膜细胞,可操作性强,可供具备基本细胞培养条件的实验室进行推广。     

人子宫内膜异位症异位及在位内膜间质细胞分离与培养

目的：建立子宫内膜异位症（EMs）异位、在位内膜间质细胞的体外细胞模型,实时观察间质细胞形态变化。方法胶原酶消化异位、在位内膜组织,二次筛网过滤结合低速离心法分离纯化间质细胞,应用免疫细胞化学染色进行细胞鉴定,并进行传代培养,观察细胞生长状况及细胞形态差异。结果培养成功率91．3％,间质细胞纯度达95％;异位间质细胞9代内、在位及对照组间质细胞11代内,细胞形态及活性并无明显改变。结论子宫内膜间质细胞可为子宫内膜异位症研究提供较好的细胞模型。     

人正常子宫内膜原代腺上皮细胞的优化分离和培养

目的 优化人正常子宫内膜腺上皮细胞分离和原代培养的方法,提供子宫内膜相关疾病研究的体外细胞模型。方法 采用酶消化、筛网过滤、离心的方法体外分离和培养人子宫内膜腺上皮与间质细胞。腺上皮细胞鉴定采用光学显微镜下观察细胞形态;免疫细胞荧光及免疫细胞化学法检测上皮细胞角蛋白(CK)和间质细胞波形蛋白(Vim)的表达。结果 经诊刮获得的18份标本中有17份分离培养成功;细胞形态符合腺上皮细胞特征,CK免疫荧光及免疫化学染色阳性,Vim染色阴性,纯度达90%以上;正常原代人子宫内膜腺上皮细胞不能传代,培养5～6d后细胞逐渐衰老。结论 改良后的原代培养方法取材简单,克服了污染问题,可获得高纯度及足够数量的人正常子宫内膜腺上皮细胞作为体外实验模型。     

子宫内膜异位症原代细胞培养及纤维化相关蛋白检测

目的 检测在位子宫内膜组织、子宫内膜异位症（endometriosis,EMs）异位病灶组织及正常人子宫内膜组织分离提纯子宫内膜间质细胞及相应间质细胞中纤维化相关蛋白表达水平及差异。方法 在严格无菌条件下,刮勺刮取新鲜子宫内膜组织,冰盒运输,采用改良EMs原代细胞培养方法分离培养。并通过细胞爬片免疫组织化学方法,对分离提纯的细胞进行鉴定。蛋白免疫印迹方法检测对比分离提纯的细胞与相应组织纤维化相关蛋白表达的差异。结果 EMs在位内膜组织间质细胞原代分离12例均成功,成功率100%（成功指标：指细胞在培养瓶中贴壁生长并稳定传代）。EMs异位组织分离培养12例成功11例,成功率为91.7%。正常人子宫内膜组织分离9例成功8例,成功率为88.9%。人子宫内膜异位症异位间质细胞（human ectopic endometrial stromal cells,HEcESCs）与人子宫内膜异位症在位间质细胞（human eutopic endometrial stromal cells,HEuESCs）及正常人在位子宫内膜间质细胞（human normal endometrial stromal cells,HEnESCs）普通光镜观察无明显差异。但免疫组织化学、蛋白免疫印迹结果表明：HEcESCs纤维化相关蛋白的表达水平明显高于HEuESCs及HEnESCs两者纤维化相关蛋白表达水平（P<0.01）,而HEuESCs与HEnESCs纤维化相关蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05）,各间质细胞纤维化相关蛋白的表达与其相应组织水平相一致。结论 采用改良EMs间质细胞原代培养方法,可以降低EMs子宫内膜间质细胞培养难度,并保持较高的细胞培养成功率。HEcESCs较HEuESCs及HEnESCs纤维化相关蛋白表达明显增高,即子宫内膜异位症患者,异位病灶在组织水平出现了明确的纤维化。     

人子宫内膜腺上皮细胞原代培养方法的改进

目的改进子宫内膜腺上皮细胞原代培养的方法,以使其可作为功能失调性子宫出血(功血,Dysfunctional Uterine Bleeding,DUB)的体外实验模型之一.方法在取材、培养条件和细胞纯化等方面对子宫内膜腺上皮细胞原代培养的方法作了改进.结果34份标本,23份获得成功.培养时间为4～22d,无1例发生污染.接种后的5～6d为进行实验的最佳时间.结论改进后的子宫内膜腺上皮细胞原代培养法克服了污染问题,增加了可获得的细胞数.子宫内膜腺上皮细胞的分离、培养可作为功血的体外实验模型之一.     

子宫腺肌病异位内膜细胞原代培养及鉴定

目的 探讨子宫腺肌病异位内膜细胞原代培养,为进一步研究子宫腺肌病发病机制提供体外细胞模型. 方法 采用酶解、筛网分离、贴壁法分离异位内膜细胞.采用免疫细胞化学法进行细胞鉴定. 结果 经此法分离培养异位细胞培养成功率可达75.0%,消化得到的异位细胞种类较多,不容易分离提纯,腺细胞占6.5%,间质细胞占13.3%,平滑肌细胞占80.2%. 结论 采用酶解、筛网分离、贴壁法可以获得子宫腺肌病的异位细胞,不能获得纯度较高异位腺细胞,子宫腺肌病异位腺细胞提纯需要进一步探讨.     

子宫内膜间质细胞体外培养模型的建立

目的：探索在位子宫内膜间质细胞体外分离、纯化、培养的方法,从而建立研究子宫内膜异位症（EMs）的体外细胞模型。方法：选择因子宫肌瘤或子宫腺肌症行子宫（次）全切除术的病例38例,术中取其子宫内膜,通过酶解、过滤、贴壁纯化等技术,分离培养子宫内膜间质细胞并进行传代。结果：36例标本获得成功,分离纯化得到的子宫内膜间质细胞经角蛋白、波形蛋白染色证实纯度达95％以上,活性较强,可以有限传代,传代培养的细胞形态特征与原代细胞一致。结论：该方法可以高效简便地分离在位子宫内膜间质细胞,得到的间质细胞产量及纯度高,可以作为 EMs 的体外细胞模型之一。     

人子宫内膜腺上皮细胞的体外分离培养及纯化

[目的]优化子宫内膜腺上皮细胞的分离培养及纯化技术,以获得经济、数量多、活性好、纯度高的子宫内膜腺上皮细胞,为子宫内膜异位症的研究提供可靠的体外模型。[方法]采用复合酶重复消化、80目筛网单次过滤、低速离心、差时贴壁法处理。[结果]经诊断性刮宫获取的19例标本中,18例腺上皮细胞培养成活,1例失败;腺上皮细胞纯度高达94.2%。[结论]复合酶多次消化、80目筛网单次过滤、低速离心、差时贴壁法培养子宫内膜腺上皮细胞,可以获得经济、数量多、活性好、纯度高的细胞。     

小鼠味蕾细胞形态观察与原代培养

目的:分离、培养小鼠味蕾细胞。方法:以小白鼠为研究对象,取其舌部组织,制成石蜡切片,从舌上皮分离出味蕾细胞置于Ⅰ型鼠尾胶原包被的含复合培养基的培养板上进行原代培养。结果:显微镜下培养的味蕾细胞与石蜡切片中味蕾细胞形态相似。结论:通过酶消化法可以进行小鼠味蕾细胞原代培养,并为后续味蕾细胞及苦味物质研究奠定技术基础。     

人子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离纯化和体外培养

目的：建立人子宫正常内膜、内膜异位症在位及异位子宫内膜的基质及腺上皮细胞分离、培养的方法，为进一步研究子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：15例正常子宫内膜、15例在位子宫内膜及10例异位内膜经胶原酶消化、筛网过滤、差时贴壁等技术进行分离、纯化和体外培养，光镜观察，应用鼠抗人波形蛋白抗体、鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜标本分离、培养均成功；5例异位内膜标本获得成功．基质细胞和腺上皮细胞纯度均可达95％以上，并均可传代。结论：采用酶解、筛网分离及贴壁能获得纯度较高的基质与腺上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于研究子宫内膜异位症的发病机制．为临床实验提供重要的理论依据．     

孕酮对离体在位及异位子宫内膜细胞巨噬细胞移动抑制因子分泌的影响

目的:探讨孕酮对离体在位及异位子宫内膜细胞巨噬细胞移动抑制因子(MIF)分泌的影响。方法:采用 ELISA方法,检测10μmol/L、0.1μmol/L孕酮作用24h后,体外培养的在位及异位子宫内膜细胞上清液中MIF水 平。结果:与空白组比较,高、低浓度孕酮作用24h后的在位及异位子宫内膜细胞MIF分泌量减少;异位内膜组的 下降程度大于在位内膜组(P<0.01);高浓度孕酮作用强于低浓度孕酮组(P<0.05)。结论:孕酮对子宫内膜细胞 分泌MIF具有明显抑制作用,对异位内膜分泌能力的抑制作用更为显著。     

孕酮对异位子宫内膜间质细胞MMP-2和MMP-9表达的影响

目的：研究孕酮对体外培养异位内膜间质细胞分泌MMP-2和MMP-9的影响。方法：采用明胶酶谱分析法测定17例卵巢内异症患者异位内膜、12例内异症患者在位内膜和14例正常对照组在位内膜体外培养的间质细胞上清中MMP-2,MMP-9的水平,并予不同浓度的孕酮对15例异位内膜细胞进行干预,测定干预后的MMP-2,MMP-9水平。结果：异位内膜间质细胞分泌的MMP-2,MMP-9高于子宫内膜异位症在位内膜间质细胞和对照组间质细胞（分别P<0.01,P<0.05）。浓度为10-9mol/L孕酮可以明显抑制异位内膜间质细胞MMP-2和MMP-9的分泌。大于10-7mol/L浓度孕酮几乎可以完全抑制异位内膜间质细胞分泌MMP-9,但不能完全抑制MMP-2的分泌。结论：孕激素可以抑制异位内膜间质细胞MMP-2,MMP-9的分泌,尤其是抑制MMP-9的作用较强。