柯萨奇病毒A组4型分离株全基因序列分析

目的分析1株柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)毒株的全基因组序列和系统进化特征。方法使用细胞培养法对肠道病毒阳性标本中的病毒进行分离。提取病毒RNA,通过RT-PCR法分段扩增全基因组,经测序、比对和组装后获得CV-A4分离株的全基因组序列。利用MEGA7.0软件分别基于全长VP1序列和全基因组序列构建系统发育树;使用Geneious Prime 2020.1.2软件对全基因组及编码区各区段的核苷酸和氨基酸序列同源性进行分析,并对编码区氨基酸变异情况进行比较分析。结果从人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma, RD)细胞上分离到1株CV-A4分离株,命名为R09220/YN/CHN/2009。基于全长VP1序列的系统进化分析显示,该分离株属于C2基因亚型。在全基因组核苷酸序列上与其同源性最高的是CV-A4毒株CVA4/SZ/CHN/09(核苷酸为95.4%,氨基酸为98.7%)。与C2基因亚型内16株CV-A4代表株的全序列核苷酸相似性为88.4%～95.4%,氨基酸序列相似性为97.5%～98.7%。通过比较C2基因亚型内的23株CV-A4分离株的全基因组氨基酸序列,R09220/YN/CHN/2009共存在23个氨基酸变异位点,其中10个为其独有的变异位点。结论 R09220/YN/CHN/2009为肠道病毒CV-A4,属于C2基因亚型,该亚型在中国大陆流行的CV-A4病毒中占据优势地位。     

恶性疟原虫组氨酸富集蛋白II基因克隆及测序

目的:比较恶性疟原虫不同分离株组氨酸富集蛋白II( HRPII)基因全编码区核苷酸序列。方法: PCR扩增恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)和越南株(VN)的HRPII基因全编码区, 其产物经HindIII和Bam HI双酶切,定向克隆入pUC19, 采用Sanger 双脱氧链末端终止法测序。结果:FCC1/HN 株和VN 株HRPII基因均为1 020bp, 无内含子, 两者仅10 个碱基不同。FCC1/HN 株HRPII与VN 株、IMTM22 株和Itg2 株间氨基酸同源性分别为98.8% 、92.2% 和98.7% ; 4 株虫体均有拷贝数不等的丙氨酸-组氨酸-组氨酸(AHH)和丙氨酸-组氨酸-组氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(AHHAAD) 重复序列, 具有相同的信号肽和糖基化位点。4 个分离株HRPII抗原表位相同,位于易曲性较高的5端非AHH 和AHHAAD 重复区。结论: FCC1/HN 株与VN 株的HRPII高度同源,与IMTM22 株和Itg2 株存在序列差异     

恶性疟原虫组氨酸富集蛋白II基因克隆及测序

目的:比较恶性疟原虫不同分离株组氨酸富集蛋白II( HRPII)基因全编码区核苷酸序列。方法: PCR扩增恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)和越南株(VN)的HRPII基因全编码区, 其产物经HindIII和Bam HI双酶切,定向克隆入pUC19, 采用Sanger 双脱氧链末端终止法测序。结果:FCC1/HN 株和VN 株HRPII基因均为1 020bp, 无内含子, 两者仅10 个碱基不同。FCC1/HN 株HRPII与VN 株、IMTM22 株和Itg2 株间氨基酸同源性分别为98.8% 、92.2% 和98.7% ; 4 株虫体均有拷贝数不等的丙氨酸-组氨酸-组氨酸(AHH)和丙氨酸-组氨酸-组氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(AHHAAD) 重复序列, 具有相同的信号肽和糖基化位点。4 个分离株HRPII抗原表位相同,位于易曲性较高的5端非AHH 和AHHAAD 重复区。结论: FCC1/HN 株与VN 株的HRPII高度同源,与IMTM22 株和Itg2 株存在序列差异     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因11的克隆化研究

目的 为了探索丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用基因芯片技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系H叩G2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV—H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的pBRTN-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A。以pcDNA3．1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术（bioinformatics)，克隆HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PCDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因，命名为NS5AWll，新基因的编码基因序列全长为1257个核苷酸(nt)，编码产物由418个氨基酸残基(aa)。结论 HCVNS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。基因芯片技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为阐明HCVNS5A蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

乙型肝炎病毒基因型研究进展

1988年Okamoto等[1]通过对18株不同血清型乙型肝炎病毒(HBV)DNA进行全序列分析,将HBV分为A、B、C、D四种基因型。目前,根据HBV全基因组核苷酸序列差异≥8%或S基因序列差异≥4%,将HBV分为8个基因型,分别命名为A~H。每种基因型又可分为不同亚型,如A基因型可进一步分为A1(Aa)、A2(Ae)、A3(Ac)亚型;B基因型分为B1(Bj)、B2(Ba)、B3、B4和B5亚型;C基因型分为C1(Cs)、C2(Ce)、C3、C4和C5亚型;D基因型分为D1、D2、D3和D4亚型;F基因型分为F1和F2亚型等[2-6]。一、HBV基因型的地域和种族分布HBV基因型的分布具有明显的种族和…     

人组织型Kallikreins基因家族研究进展

人组织型Kallikreins基因(下称Kallikreins)是由15个编码丝氨酸蛋白酶的基因组成的家族,1986年Watt等从精液中纯化出前列腺特异性抗原(PSA、hK3),1987年Landwall和Lilja报道了几乎完整的PSA酶原前体(Prepro—PSA)序列;接着Schedlich分离到hK2的基因组DNA。至此认为该基因家族由三个成员组成。分别命名为KLK1(编码胰／肾Kallikrein)、KLK2(编码人腺体Kallikrein2)及KLK3(编码前列腺特异性抗原)。     

先天性心脏病相关GATA5基因突变研究

目的:识别先天性心脏病(CHD)相关GATA5基因新突变。方法:收集100例无血缘关系的CHD患者和200名无血缘关系且种族匹配的健康对照者的临床资料和血标本。抽提基因组DNA,通过聚合酶链反应扩增GATA5基因的编码外显子及其剪接位点,采用双脱氧核苷链末端合成终止法对全部扩增片段进行测序。将所测的序列与GenBank数据库中的GATA5基因序列进行比对以发现GATA5基因突变。应用多序列比对软件ClustalW评估突变氨基酸的保守性,应用致病性预测软件MutationTaster预测突变的致病性。结果:在2例CHD患者各发现1个新的GATA5基因杂合错义突变,突变率为2%。其中1个是GATA5基因编码核苷酸序列第395位的鸟嘌呤(guanine,G)变为胸腺嘧啶(thymine,T),即c.395G>T突变;另一个是GATA5基因编码核苷酸序列第991位的胞嘧啶(cytosine,C)变为腺嘌呤(adenine,A),即c.991C>A突变。多序列比对显示2种突变氨基酸在进化上均高度保守。致病性预测显示2种突变均有致病性。结论:本研究发现了CHD相关GATA5基因新突变,有助于揭示CHD新的分子机制。     

HBeAg结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆化

目的:克隆HBeAg结合蛋白未知功能新基因 HBeBP4的剪切体基因HBeBP4A,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其结构及功能．方法:应用PCR技术从HepG2细胞提取的cDNA扩增HBeBP4基因的剪切体基因 HBeBP4A,选用pGEM-Teasy载体进行TA 克隆,通过PCR,限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体 pcDNATM3．1/myc-HisA,通过PCR,限制酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学初步分析其物理化学性质,蛋白质结构和功能．结果:成功扩增出HBeBP4剪切体基因,命名为HBeBP4A．利用生物信息学分析推定其 ORF为1104个核苷酸(nt),编码产物为367个氨基酸残基(aa)．结论:发现了HBeAg结合蛋白4(HBeBP4)基因的剪切体HBeBP4A,构建了pcDNATM3．1／ myc-HisA真核表达载体．     

乙型肝炎病毒基因组高变区界定的初步研究

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组是否存在高保守区或高变区,并探讨前-前-S基因和前-X基因的存在方式. 方法:自GenBank中按血清型搜索符合要求的HBV全基因组序列,并应用Vector 6.0版软件进行核苷酸序列同源性的分析和比较. 结果:GenBank中搜索出28个adr血清型和22个adw血清型HBV病毒株全基因组,比较后发现2种血清型的核苷酸序列总一致率分别为76.6%和73.9%;adr血清型病毒株存有高度变异区和高度变异区,一致率分别为54.5%和92.1%;adw血清型基因组内部含有高度保守区,一致率为85.0%,不含有高度变异区.前-前-S区的存在是较为普遍的现象,而前-X区的编码具有adr血清型特异性特点,在某些病毒基因组中,因为存在A2608→C/T、和C/A2733→T替换突变,导致其前-X基因编码区起始密码子突变,因此部分HBV基因组无前-X基因结构区. 结论:HBV基因组内部可能存在高度保守区,前-前-S区的存在是一个重要的现象,而前-X编码区具有adr血清型特异性的特点.     

日本血吸虫TEGT基因的cDNA克隆和生物信息学分析

目的克隆日本血吸虫新基因TEGT(Sj.TEGT)的全长序列。方法根据编码日本血吸虫大陆株的EST基因片段的序列,设计5’RACE的系列引物,扩增Sj.TEGT的5’端,测序后预测该基因的全长ORF;再以此设计引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增得到Sj.TEGT的全长cDNA。结果从日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA中克隆到1个TEGT相关基因,命名为Sj.TEGT基因。其编码的蛋白的分子质量大约为30ku;对其编码的氨基酸序列的分析显示其编码蛋白有6个跨膜螺旋区。结论Sj.TEGT是一个新基因,有必要对其功能进行深入研究。     

酵母双杂交筛选肝细胞中乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白基因

目的筛选并克隆人肝细胞中与HBsAg中蛋白(MHBs)相互作用肝细胞蛋白的基因,探讨MHBs的生物学功能。方法应用PCR法以HBV adr亚型全序质粒A7为模板扩增MHBs基因,克隆到pGEM-T载体中扩增并测序鉴定,EcoR I和BamH I双酶切后回收连接到酵母表达载体pGBWT- 7中并应用酵母双杂交系统3,构建MHBs诱饵质粒并转化酵母AH109,与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖苷酸上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌氨苄青霉素-LB平板上,选择并测序结果在GenBank中进行生物信息学分析。结果构建MHBs酵母细胞表达载体,配合后筛选出既能在四缺培养基(SD/-Trp-Leu-Ade-His)上培养也能在铺有X-α-半乳糖苷酸的四缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落2个,其中一个克隆为人醛缩酶B、另一个克隆为未知功能基因,新基因命名为MBP1。结论扩增出MHBs基因,用酵母双杂交技术筛选出2个与MHBs相互作用的肝细胞结合蛋白编码基因,为阐明MHBs的生物学功能及HBV损害肝细胞、致癌等方面的作用提供了新线索。     

间日疟原虫环子孢子蛋白基因型的鉴别研究

[目的 ]建立间日疟原虫环子孢子蛋白 (CSP)基因分型法用于地理株的鉴定。[方法 ]Chelex 10 0离子交换法提取滤纸血样中的微量DNA ;套式PCR和等位特异PCR技术、琼脂糖电泳分析法、斑点印迹和Southern印迹 探针杂交技术分别用于判别性片段的扩增、分析和鉴定。[结果 ]用本文描述的套式 等位 特异PCR分型法 ,从一小片滤纸血样提取的微量DNA中 ,扩增出不同长度范围的 3种判别性片段 :6 5 0～ 770bp(间日疟种特异 ) ,15 0～2 30bp(温带族特异 ) ,5 88～ 6 15bp(PV 2型特异 )。用本法检测参考虫株出现的带型和长度与设计的靶序列完全吻合。检测 5 9份国内感染血样 ,42份鉴定为温带族虫株 ,15份为热带族虫株 ,2份为PV 2型虫株。 4份境外感染血样中 ,2个巴基斯坦分离株均为温带族 ,缅甸和老挝各 1株均为热带族虫株。 [结论 ]①本法能同时区分PV 1型 ,PV 2型以及温带族与热带族虫株 ,且较现有 (PCR 探针杂交 )法更为简便、快捷 ;②现场血样初步检测结果显示 :我国存在PV 1型 (温带族与热带族 )虫株和PV 2型虫株 ,也可能存在温带族东南亚组虫株。     

宫颈癌患者HPV基因型分布及HPV52编码基因突变情况分析北大核心CSCD

目的研究本地区宫颈癌患者HPV感染基因型分布特征和HPV52型E6、E7区基因突变情况,为防治宫颈癌提供依据。方法收集本院就诊169例宫颈癌患者样本并进行检测分型。采用PCR热扩增,检测HPV52型E6、E7区基因突变情况。结果169例宫颈癌患者按年龄划分≤30岁、30~40岁、40~50岁、50~60岁、60~70岁和70岁以上分别为3、23、59、58、21和5例。从样本中共计分离出217株HPV病毒,HPV16型105株、HPV18型35株、HPV31型7株、HPV33型9株、HPV35型1株、HPV39型4株、HPV45型1株、HPV51型4株、HPV52型17株、HPV56型3株、HPV58型23株、HPV59型3株、HPV66型3株、HPV68型1株和HPV82型1株。134例患者是单一感染;29例患者双重HPV感染,5例患者三种HPV类型病毒同时感染,1例患者四种HPV类型病毒同时感染。HPV52型E6蛋白编码基因突变情况:单一突变9株,双重突变1株,三重突变1株,四重突变3株。共有14个碱基发生替代,分别为:C114T、C140G、A204G、A232G、G233T、A264T、T272G、G350T、G356A、A379G、T415C、T417A、G425C、G502C和A524G。HPV52型E7蛋白编码基因突变情况:单一突变3株,双重突变3株,三重突变3株,四重突变3株,六重突变1株。共有16个碱基发生替代,具体情况分别为:A577 C、G592 T、A599 G、C611 G、G655 A、G657 A、C662 T、A 690 T、C714 T、T739 A、G742 A、C747 T、C751 T、G 775 A、T 789 A和A 801 G。结论HPV16、18、52、58型是主要基因型,40~60岁是HPV感染高发人群。多数患者携带的HPV52型E6、E7区域的基因存在基因突变,应加强对HPV感染和变异情况监测。     

2013年河南省新布尼亚病毒的分离与S片段基因特征分析

目的 分离2013年河南省新布尼亚病毒分离株,并了解S片段序列特征。方法 采集2013年的发热伴血小板减少综合征急性期血清,用Vero细胞分离新布尼亚病毒,对分离到的毒株采用RT-PCR法扩增病毒S片段基因,并进行同源性分析,构建系统进化树。结果 从采集的64份标本中分离到新布尼亚病毒22株, 新分离的毒株的S片基因序列比对发现,同源性在94.6%～100%之间,其双义编码的两个蛋白质,NSs蛋白的氨基酸的同源性在95.90%～100%之间,N蛋白的氨基酸的同源性在99.50%～100%之间。系统进化树分析发现, 22株病毒株分属于A、B和E三个基因型,其中A型18株,B和E型各2株。结论 2013年河南省新布尼亚病毒以A基因型为主要流行型别。     

20株新生隐球菌生物学特性分析

目的分析20株临床分离于脑脊液、血液、尿液、痰液和支气管灌洗液的隐球菌菌株的生物学特性。方法分别以油菊籽、咖啡酸玉米琼脂、刀豆氨酸-甜菜碱-溴麝香草酚蓝培养基、尿素酶试验、37℃生长试验I、D32生化鉴定板和荚膜形成试验等初步鉴定后,再经大亚基核糖体DNA(LSUrDNA)的D1/D2区域序列分析进一步鉴定菌种。同时进行血清分型和随机扩增DNA多态性研究。结果20株菌皆具有以下特征:①形成荚膜,②37℃3天内生长试验皆为阳性,③咖啡酸玉米琼脂和油菊籽培养基皆可以产生褐色菌落,④尿素酶试验96 h皆呈阳性,⑤CGB培养基未见蓝色菌落生长,⑥ID32鉴定板可以鉴定到属,种的鉴定结果各不相同,⑦大亚基核糖体DNA(LSUrDNA)的D1/D2区域序列分析证实皆为新生隐球菌的新生变种,⑧血清型仅见A和AD二型,以A型为多数(83.33%),⑨20株临床分离株随机扩增DNA多态性分析有一定的生态多样性。结论20株临床分离株皆为新生隐球菌的新生变种,血清型多数为A型,少数AD型,但不同菌株间存在一定的生物多态性。     

囊虫病诊断用抗原编码cDNA的分子克隆

目的 :克隆与分析囊虫病诊断用抗原及其编码基因。方法 :采用基因重组技术 ,构建来源于猪囊尾蚴 m RNA的 c DNA文库。以囊虫病患者、囊虫病病猪的血清为探针从 c DNA文库中筛选出目的克隆。结果 :获得人、猪共同抗原 2个 (分子量分别为 2 8k Da和 18k Da) ,人特异性抗原和猪特异性抗原各 1个 (分子量为 34 k Da、 14k Da)。这些抗原的编码克隆分别命名为λc C1、λc C2、λc H1及 λc P1。c C1c DNA含有编码 2 8k Da的人、猪共同抗原的完整基因 ,全长 10 70 bp,起始密码 ( ATG)从自 2 2 bp,终止密码 ( TGA)结于 74 7bp,长为 74 7bp的开放阅读框架编码由 2 4 9个氨基酸组成的多肽 ,其理论推导分子量为 2 7.36k Da。结论 :以 c C1等融合蛋白为诊断用抗原 ,具有高度的特异性和较理想的敏感性。     

重组HIV毒株正在全球蔓延

法国研究人员Ｐｅｅｔｅｒｓ博士等最近撰文指出 ,一些新的重组艾滋病病毒 (ＨＩＶ)毒株正在不同地区蔓延 ,这为艾滋病(ＡＩＤＳ)疫苗的研制增加了困难。他们对从 1名塞内加尔患者和 1名马里患者体内分离出的毒株进行了基因组序列分析。结果显示 ,这 2株毒株与另外 2株从布基纳法索和马里患者体内分离出的毒株相匹配。所有 4株毒株都包含一种由Ａ、Ｇ、Ｋ和Ｊ亚型ＨＩＶ毒株片段组成的镶嵌式染色体结构 ,根据新的命名法 ,该类毒株被命名为ＣＲＦ0 6 ｃｐｘ。此外 ,在法国和澳大利亚的患者体内也分离到了此类毒株 ,说明其已经在全球传播。Ｐ…     

NS5A-TP5蛋白结合蛋白1的基因克隆化研究

目的 :应用酵母双杂交技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆NS5A TP5蛋白结合蛋白基因1(NBP1)。方法 :应用酵母双杂交系统 3 ,构建NS5A TP5诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y 187进行配合 ,于涂有x α gal营养缺陷型培养基 (SD/Trp Leu His Ade)上筛选生长。 结果 :挑选蓝色克隆 ,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序 ,然后进行生物信息学分析 ,新基因的开放读码框架长度为 2 40个核苷酸 (nt) ,编码产物由 79个氨基酸残基 (aa)组成 ,命名为NBP1,GenBank注册号为AY 45 92 91。结论 :NBP1的筛选与克隆 ,可为进一步研究HCVNS5A TP5蛋白相互作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础     

特发性房颤相关GATA5基因新突变的识别

目的:识别特发性房颤(AF)相关GATA5基因新突变. 方法:收集120例无血缘关系的特发性AF患者和200名无血缘关系且种族匹配的健康对照者的临床资料和血标本.抽提基因组DNA,通过聚合酶链反应扩增AF候选基因GATA5的全部外显子及其两侧的部分内含子,采用双脱氧核苷链末端合成终止法对全部扩增片段进行测序.将所测的序列与GenBank数据库中的GATA5基因序列进行比对,以发现GATA5基因突变.应用多序列比对软件ClustalW评估突变氨基酸的保守性,应用致病性预测软件MutationTaster预测突变的致病性. 结果:在2例AF患者各发现1个新的GATA5基因杂合错义突变,突变率约为1.67％.突变分别为GATA5基因编码核苷酸序列第668位的腺嘌呤(adenine,A)变为胸腺嘧啶(thymine,T),即c.668A＞T突变；第863位的A变为胞嘧啶(cytosine,C),即c.863A＞C突变.多序列比对显示2种突变氨基酸在进化上均高度保守,致病性预测表明2种突变均有致病性. 结论:本研究识别出AF相关GATA5基因新突变,有助于揭示AF发生的分子机制.     

表观健康猪群携带猪链球菌情况流行病学调查

目的了解我国不同地区表观健康猪群携带猪链球菌的情况。方法从我国20个不同地区屠宰场采集248份扁桃体,进行增菌培养后用PCR方法进行猪链球菌种型鉴定并用血清凝集试验复检,最后用多位点序列分型(Multilocus se-quence typing,MLST)系统研究各菌株之间的遗传关系。结果从248份扁桃体中共检出14株猪链球菌(检出率为5.65%),其中3株为猪链球菌2型,2株为猪链球菌7型,1株为猪链球菌9型,8株未定血清型;对6株定型菌株进行毒力因子(mrp、epf、sly、orf2、fbps、gapdh)检测发现5种毒力基因型:A1Cps2+mrp-epf+sly+orf2+fbps+gapdh+、A2Cps2+mrp-epf+sly-orf2-fbps+gapdh-、A3Cps7+mrp+epf-sly-orf2-fbps-gapdh+、A4Cps9+mrp-epf-sly-orf2-fbps+gapdh+、A5Cps7+mrp-epf-sly-orf2+fbps+gapdh+,A1和A2型的分离株为弱毒株,其他型菌株的毒力无法确定;经MLST分析,3株猪链球菌2型属于ST1,1株猪链球菌7型属于ST29,1株猪链球菌9型(CQ15)属于一个国际上未报道过的新ST型,该型被猪链球菌MLST数据库(http://ssuis.mlst.net)收录并编号为ST128。结论不同地区表观健康猪群平均带菌率为5.65%,分离到的猪链球菌2型均为弱毒株。