雷公藤甲素对嘌呤霉素模型足细胞病变的影响

目的：研究雷公藤甲素对非免疫因素介导的、单纯足细胞病变模型——嘌呤霉素氨基核苷（PAN）肾病模型的疗效及其对足细胞病变的影响。方法：采用PAN单次颈静脉注射法建立PAN肾病模型。大鼠分为正常对照组，模型组，雷公藤甲素预防组和治疗组。分别在1天、3天、5天、10天、14天和21天收集血尿标本，并处死大鼠留取肾组织标本。检测24h尿蛋白排泄量、血生化指标，行肾组织光镜和电镜观察肾小球病变和足突超微结构。采用定量学方法测定足突宽度。免疫荧光染色观察足细胞裂孔膜分子Nephrin和Podocin表达和分布变化。结果：雷公藤甲素无论是预防还是治疗性用药均能明显改善PAN肾病大鼠的肾病综合征状况，明显减少尿蛋白，加快血清白蛋白回升和血脂水平恢复。与此同时，雷公藤甲素预防组和治疗组大鼠在各观察点足突融合程度和范围均比PAN肾病大鼠明显减轻，至第14天仅见少数足突融合，第21天足突形态已基本恢复正常。雷公藤甲素预防性和治疗性用药均能够增加足细胞裂孔膜分子Nephrin和Podocin表达，促进其分布异常的修复。在第10天，Nephrin和Podocin不仅表达较PAN肾病大鼠明显增多，而且大部分血管袢已开始呈现连续的线状分布，以Podocin更为明显；两者的表达和分布在第14天已基本恢复，至第21天已完全恢复正常。结论：雷公藤甲素对PAN导致的足细胞损伤模型具有明显的预防和治疗作用，表现为减少蛋白尿，改善足突融合，恢复足细胞相关蛋白的表达及其分布，逆转足细胞病变。     

雷公藤甲素干预足细胞病变的体外观察

目的：雷公藤甲素对Heymann肾炎和嘌呤霉素肾病大鼠的疗效及其对足细胞病变的影响提示，雷公藤甲素有可能直接作用于足细胞，从而改善其病变状况。本研究借助小鼠足细胞系，体外观察了雷公藤甲素对足细胞损伤的保护和修复作用，并对其作用机制进行了研究。方法：体外采用氨基核苷嘌呤霉素（puromycin aminonucleoside，PAN）致足细胞损伤模型。观察雷公藤甲素对足细胞损伤的保护作用研究中，雷公藤甲素与足细胞预孵育30min后，再加入含PAN的培养基，继续作用24h；观察雷公藤甲素对足细胞损伤的修复作用研究中，PAN作用足细胞24h，造成足细胞明显损伤后，再加入含或不含雷公藤甲素的培养基，继续培养3天。免疫荧光法和流式细胞仪分析足细胞骨架相关蛋白F-actin和Synaptopodin的变化，并进一步观察了细胞内调节骨架装配的Rho／ROCK信号通路的活性，即采用Western Blot检测ROCK-Ⅰ底物——肌球蛋白磷酸酶结合亚单位（MBS）磷酸化水平，以及Rho／ROCK信号通路选择性阻断剂Y-27632对雷公藤甲素作用的影响。同时采用免疫荧光法和流式细胞仪分析足细胞裂孔膜相关分子Nephrin和Podocin在足细胞的分布及表达量的变化。结果：正常分化足细胞F—actin呈丝状结构，密度大，丝强劲有力，沿细胞极性分布；Synaptopodin呈颗粒状沿细胞骨架分布。裂孔膜蛋白Nephrin沿足细胞膜和细胞骨架分布，Podocin呈线状均匀分布于胞浆内，PAN作用24h后，细胞足突回缩，F—actin几乎完全解聚，Synaptopodin表达消失。Nephrin和Podocin表达减弱，正常丝状结构消失。而经过雷公藤甲素的预处理，PAN诱导的足细胞损伤明显减弱，足细胞未表现出上述骨架结构的改变，Synaptopodin表达没有明显减弱。同时我们的结果显示，在PAN造成足细胞明显损伤后再加入雷公藤甲素，足细胞损伤能够得到一定修复，细胞内重新出现极性分布的微丝，同时，Synaptopodin的表达也得以修复。Rho／ROCK信号通路研究显示，100μg／ml PAN明显降低Rho／ROCK通路活性。雷公藤甲素能有效遏制MBS磷酸化水平的降低，维持足细胞Rho／ROCK通路的活性状态。Rho／ROCK信号通路选择性抑制剂Y-27632可阻断雷公藤对足细胞骨架结构的保护作用。此外，对裂孔膜蛋白Nephrin，Podocin的研究表明，不论是在预防组和治疗组，PAN对Nephrin和Podocin的损伤可在一定程度上被雷公藤甲素预防和修复。结论：雷公藤甲素可稳定足细胞的细胞骨架，拮抗PAN对足细胞的损伤。在足细胞损伤已经发生后，雷公藤甲素可逆转足细胞的损伤，修复足细胞骨架结构和相关分子的表达。雷公藤甲素的上述作用与细胞内Rho／ROCK信号通路密切相关。雷公藤甲素对足细胞的影响可能是其降低肾小球肾炎患者尿蛋白的重要机制之一。     

低蛋白合并α-酮酸饮食对被动型Heymann肾炎大鼠肾小球足细胞Nephrin表达的影响

目的 观察低蛋白合并α-酮酸饮食对被动型Heymann肾炎大鼠肾小球足细胞Nephrin表达的影响.方法 将40只SD大鼠分为对照组、模型组(PHN组)、低蛋白饮食组(LPD组)和低蛋白合并α-酮酸饮食组(LK组),对照组经尾静脉注射1 mL/100 g生理盐水,其他三组经尾静脉注射1 mL/100 g新西兰大耳兔抗FX1A血清.对照组、PHN组饮食蛋白占饲料质量的10％,LPD组饮食蛋白占饲料质量的5％,LK组饮食蛋白占饲料质量的5％(其中α-酮酸提供1％的蛋白).4周后检测各组24 h尿蛋白定量、血清肌酐、TG、TC及血清白蛋白,激光共聚焦显微镜免疫荧光检查大鼠肾小球足细胞Nephrin表达情况.结果 激光共聚焦显微镜显示,PHN组、LPD组肾小球内Nephrin荧光强度较对照组明显减弱,且部分节段有缺失;LK组肾小球内Nephrin荧光强度较对照组减弱.结论 低蛋白合并α-酮酸饮食对被动型Heymann肾炎大鼠具有肾脏保护作用.     

雷公藤甲素对2型糖尿病大鼠肾组织足细胞Nephrin、Podocin蛋白表达的影响及机制

目的 观察雷公藤甲素对2型糖尿病(T2DM)大鼠肾组织足细胞Nephrin、Podocin蛋白表达的影响及其机制探讨.方法 SPF级雄性8周龄Wistar大鼠50只,体重(200±20)g,按随机数字表法分为2组:对照组10只、模型组40只.模型组高脂高糖喂养8周联合小剂量链脲佐菌素(STZ)30mg/kg建立T2DM模型鼠,正常组大鼠喂养常规饲料.将造模成功的T2DM大鼠(28只)随机分成2组:糖尿病组(14只)和雷公藤甲素治疗组(14只),雷公藤甲素治疗8周后,检测大鼠生化指标、肾重/体重和尿白蛋白.利用光镜、电镜观察肾脏病理改变.采用实时定量PCR、免疫组化及Western blot法检测肾组织Nephrin及Podocin蛋白、骨桥蛋白、转化生长因子-β1(TGF-β1)及单核/巨噬细胞表面特异性标志抗原(ED-1)的mRNA和蛋白表达分布.采用单因素方差分析法进行统计学分析.结果 糖尿病大鼠尿白蛋白明显高于对照组(F=181.51,P＜0.01),治疗组尿白蛋白明显低于DM组(F=181.51,P＜0.01).与对照组比较,糖尿病大鼠肾组织Nephrin(F=36.82,P＜0.05)和Podocin(F=32.57,P＜0.05)蛋白表达下调,Nephrin(F=88.45,P＜0.01)、Podocin(F=55.43,P＜0.01)mRNA表达下调;雷公藤甲素组干预8周后Nephrin[(1.82±0.06)和(1.63±0.06),P＜0.05]和Podocin[(1.80±0.06)和(1.60±0.06),P＜0.05]蛋白质表达上调,肾脏组织Nephrin[(0.73±0.12)和(0.19±0.08),P＜0.01]和Podocin[(0.60±0.12)和(0.26±0.07),P＜0.01]mRNA表达上调.与对照组比较,T2DM大鼠肾组织骨桥蛋白(F=40.06,P＜0.05)和TGF-β1的(F=28.84,P＜0.05)蛋白质表达上调,肾组织骨桥蛋白(F=177.46,P＜0.01)和TGF-β1(F=161.27,P＜0.01)mRNA表达上调,雷公藤甲素治疗后肾组织骨桥蛋白[(1.27±0.03)和(1.39±0.05),P＜0.05]和TGF-β1[(1.23±0.03)和(1.44±0.02),P＜0.05]的蛋白表达下调,肾组织骨桥蛋白[(2.05±0.16)和(3.26±0.26),P＜0.01]和TGF-β1[(4.0±0.70)和(6.5±0.71),P＜0.01]mRNA表达下调.结论 雷公藤甲素对T2DM大鼠足细胞有保护作用,其机制可能与其?     

雷公藤甲素干预C5b-9诱导足细胞损伤的体外研究

目的:体外观察雷公藤甲素对膜攻击复合物C5b-9介导的足细胞损伤的影响,探讨雷公藤甲素治疗膜性肾病的疗效机制. 方法:以纯化的C5b6及C7～C9体外组装C5b-9,建立足细胞亚溶破模型.免疫荧光染色分析C5b-9对足细胞骨架相关蛋白F-actin表达和分布的影响;在观察雷公藤甲素对C5b-9导致的足细胞损伤的治疗机制研究中,免疫荧光观察和流式细胞仪定量分析雷公藤甲素对C5b-9在足细胞膜上组装和活性的影响.并进一步在C5b-9组装完成后加入雷公藤甲素,观察雷公藤甲素对C5b-9诱导的足细胞内活性氧(ROS)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响.流式细胞仪分析荧光探针CM-H2DCFDA标记的细胞内ROS,MAPK信号通路的活性采用Western blot检测p-38,ERK 1/2和JNK MAPK磷酸化水平,以及MAPK信号通路选择性阻断剂SB202190,U0126和SP600125对C5b-9作用的影响. 结果:免疫荧光和LDH释放试验显示C5b-9在足细胞膜组装成功,亚溶解剂量C5b-9对足细胞膜完整性没有明显影响,但可呈时间依赖性的破坏足细胞骨架结构,表现为细胞骨架的极性消失,排列紊乱,部分足细胞F-actin的丝状结构完全消失.C5b-9可诱导足细胞内ROS的明显增加,激活p-38 MAPK信号通路,但C5b-9对ERK MAPK和JNK MAPK信号通路没有明显的影响.抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、p-38 MAPK通路特异性抑制剂SB202190均能够拮抗C5b-9对足细胞的损伤,而ERK MAPK和JNK MAPK通路抑制剂U0126和sp600125对C5b-9诱导的足细胞损伤没有明显的保护作用.雷公藤甲素(10ng/ml)对C5b-9复合物在足细胞膜上组装量和活性没有明显的影响.当C5b-9在足细胞膜上组装完成后加入雷公藤甲素,雷公藤甲素对C5b-9诱导的细胞内ROS的产生没有明显的抑制作用,但能够有效遏制p-38 MAPK信号通路的活化,p-38 MAPK的磷酸化水平显著降低. 结论:雷公藤甲素的疗效机制除了免疫抑制和抗炎作用外,还可通过抑制C5b-9激活的细胞内p-38 MAPK信号通路发挥直接的足细胞保护作用.雷公藤甲素对足细胞的上述作用可能部分参与了其对膜性肾病的疗效.     

依普利酮对急性肾病大鼠尿蛋白含量及肾小球足细胞标记蛋白表达的影响

目的：观察依普利酮对急性肾病大鼠尿蛋白含量及肾小球足细胞标记蛋白表达的影响,探讨其肾脏保护机制。方法采用随机数字表法将32只SD大鼠分为对照组（C组）、模型组（M组）和干预组（E组）,后两组均单次腹腔注射嘌呤霉素氨基核苷（ PAN）制备急性肾病模型,C组注射等体积生理盐水。造模后第3天开始,E组予依普利酮灌胃,余两组给予等量蒸馏水灌胃,均连续2周。期间每天测定24 h尿蛋白定量;实验结束后麻醉大鼠,自心脏抽取血液检测血清白蛋白（Alb）、总胆固醇（TC）及尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）;大鼠左心室灌注生理盐水,留取肾组织于光镜和电镜下观察形态学改变,实时定量PCR法和Western blotting法检测Nephrin蛋白和mRNA,免疫荧光法检测Podocin、Podocalyxin蛋白表达。结果实验第7～14天,M组和E组24 h尿蛋白定量均高于C组,但E组低于M组（P均＜0．05）;M组和E组血清Alb均显著低于C组,TC、BUN、Cr均高于C组（P均＜0．05）。光镜下M组和E组符合微小病变肾病（ MCD）病理表现;电镜下M组足突广泛融合、消失,局部基底膜裸露,E组较之超微结构改善、仍有足突融合。 M组、E组的Podocin及Podocalyxin 蛋白、Nephrin蛋白及mRNA表达均明显低于C组,尤以M组为著（ P均＜0．05）。结论依普利酮能够明显减少PAN肾病大鼠的尿蛋白,可能机制为上调足细胞标记蛋白表达和活性。     

雷公藤甲素治疗db／db糖尿病小鼠的疗效观察

目的:利用db/db小鼠验证雷公藤甲素对糖尿病肾脏损伤的治疗作用,探讨雷公藤甲素防治糖尿病肾病的机制. 方法:9周龄的db/db和db/m小鼠分为五组:(1)db/m正常对照组;(2)dh/dh糖尿病对照组;(3)缬沙坦治疗纽;(4)雷公藤甲素低剂最治疗组;(5)雷公藤甲素高剂繁治疗组.于4周、8周及12周测定各组24h尿白蛋白、血生化和体重.光镜观察肾小球病变,电镜观察足突改变,并作定量分析.免疫病理观察足细胞裂孔膜蛋白nephrin,足细胞损伤标志物desmin,炎症反应标志物单核细胞趋化蛋白1(MCP-1),氧化应激标志物4羟壬烯醛(4-HNE)的表达. 结果:db/db小鼠经雷公藤甲素治疗后蛋白尿下降,肾小球肥大和足细胞损伤减轻,肾组织炎症和氧化应激状态改善,同时高血脂和肥胖减轻.该作用随治疗时间延长,效果更加明显,且高剂量疗效优于低剂量.雷公藤甲素降低蛋白尿、改善肾小球肥大的作用与缬沙坦相似,但降低肾组织炎症和氧化应激的作用雷公藤甲素比缬沙坦更强. 结论:雷公藤甲索能明显降低dh/db小鼠尿蛋白的排泄,减轻肾组织炎症反应,改善肾脏组织病变,对糖尿病肾脏损伤具有显著且更全面的治疗作用.     

大鼠加速型抗肾小球基膜肾炎的研制

将正常兔ＩｇＧ与完全弗氏佐刑预免疫大鼠８天后注射亚致肾炎剂量的兔抗大鼠肾小球基膜（ＧＢＭ）血清，结果大鼠尿蛋白量在注射该血清后第一天即明显升高，第三天达高峰，在第２１天时，血清肌酐显著升高。肾脏组织学检查：免疫荧光见第一天即有大鼠ＩｇＧ，Ｃ３和兔ＩｇＧ沿ＧＢＭ呈典型线状沉用，光镜见第一天肾小球内细胞数目明显增加，内皮细胞肿胀，肾小球内见中性粒细胞浸润，第七、第１４、第２１天时肾小球毛细血管丛系膜区增宽，系膜细胞增生，间质可见炎症细胞浸润，ＰＡＳＭ染色可见到ＧＢＭ增厚，电镜见ＧＢＭ内有电子致密物线状沉积，上皮足突融合，内在窗孔消失，微血栓形成阻塞管腔、间质有细胞浸润和纤维化。     

冬虫夏草对DN大鼠肾足细胞的保护作用观察

目的观察冬虫夏草对糖尿病肾病（DN）大鼠肾足细胞的保护作用,并探讨其机制。方法将60只SD大鼠随机分为正常对照组（A组）、DN模型组（B组）、冬虫夏草治疗组（C组）,各20只。B、C组建立DN模型,C组给给予冬虫夏草菌粉5g／（kg·d）每日灌胃。8周后观察24h尿白蛋白排泄量（UAER）,肾小球、肾小管形态学变化,足细胞超微结构变化,以及肾皮质中Nephfin和Podocin蛋白分布情况。结果与A组比较,B、C组24hUAER明显增高（P均〈0．01）,肾小球、小管间质及足细胞病变明显,肾组织中Nephrin和Podocin分布减少（P均〈0．01）。与B组比较,C组24hUAER明显减少,肾小球、小管间质及足细胞病变明显减轻（P均〈0．01）,肾组织中Nephrin和Podocin蛋白分布有明显增加（P均〈0．01）。结论冬虫夏草具有保护及修复DN大鼠肾足细胞的作用,其机制可能与其上调肾组织中Nephrin和Podocin蛋白表达有关。     

肥胖大鼠尿液Podocin检测及意义

目的探讨检测高脂饮食诱导的肥胖大鼠尿液Podocin的变化。方法实验大鼠分为正常对照组(Con组)和肥胖组(Ob组)。在造模14 w时,分别用光学显微镜、电子显微镜方法观察肾脏形态变化,用免疫组织化学方法,检测肥胖大鼠肾小球足细胞Podocin的表达,用ELISA方法检测尿Podocin蛋白。结果 (1)0 w时Ob组与Con组比较性别、体重、身长、尾长,Lee指数等无差异,14 w时Ob组体重、身长,Lee指数明显高于Con组(P0.05)。(2)14 w时Ob组与Con组比较血肌酐(Cre)、血尿素氮(BUN)无差异(P0.05)。(3)Ob组在14 w时尿Podocin排泄明显多于Con组。(4)光镜下Ob组大鼠肾小球变化不明显。电镜下Ob组大鼠肾脏肾小球足细胞呈粗大状,足突轻度微绒毛化。(5)免疫组化染色Ob组大鼠肾小球足细胞Podocin的蛋白表达比Con组减少。结论肥胖大鼠肾小球足细胞Podocin的蛋白表达减少,但尿液Podocin排泄增多,有望成为肥胖导致肾损害的标志物。