淡色库蚊细胞色素P450抗性相关基因克隆与初步鉴定

[目的 ]探讨淡色库蚊细胞色素P45 0与溴氰菊酯抗药性的关系。 [方法 ]采用一对昆虫细胞色素P45 0简并引物 ,以反转录 聚合酶链反应从淡色库蚊扩增特异片段 ,T/A直接克隆法筛选阳性克隆 ,对新序列进行cDNA芯片和逆Northern分析。 [结果 ]从淡色库蚊对溴氰菊酯敏感品系和抗性品系获得 112个阳性克隆 ,其中 2 4个阳性克隆测序后显示为细胞色素P45 0新序列 ,由GenBank登录上网 ;经国际细胞色素P45 0命名委员会鉴定分别属CYP4家族CYP4C、CYP4D、CYP4H和CYP4J等 4个亚家族 ;2 4个CYP4cDNA片段中 ,来自敏感品系的 2个片段(NYDS3和NYDS5 )和来自抗性品系的 4个片段 (NYDR6、NYDR9、NYDR15和NYDR17)在两品系间存在差别 ,cDNA芯片信号亮度值均是抗性品系大于敏感品系 ,倍数在 3 .1～ 9.7范围内 ;NYDR17仅与抗性探针杂交 ;逆Northern再鉴定 ,获得了与cDNA芯片一致的结果。 [结论 ]淡色库蚊CYP4与溴氰菊酯抗性相关 ;在淡色库蚊溴氰菊酯抗性机理中 ,可能存在P45 0基因点突变而导致的特异表达。     

对溴氰菊酯抗性和敏感淡色库蚊不同发育阶段的抗生水平

对室内选育的淡色库蚊用浸渍法测定了Ⅱ龄，Ⅲ龄和Ⅳ龄和幼虫，用接触筒法了早期，中期和晚期成虫。并观察了增效醚，磷酸三苯酯和杀虫脒与溴氰菊酯混用后的增效效果。结果表明：１．淡色库蚊各发育阶段对溴氰菊酯的抗性水平，在敏感品系由高至低依次为中期，晚期，早期成虫，Ⅳ龄，Ⅲ龄和Ⅱ龄幼龄，在抗性品系为早期，中期，晚期成虫，Ⅳ龄，Ⅲ龄和Ⅱ龄幼。２．ＰＢ和杀虫脒均有明显增效作用，提示抗性可能与氧化代谢增强和靶标部位     

淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4家族新成员基因克隆及序列分析

目的获取淡色库蚊CYP4家族新基因。方法根据CYP4氨基酸保守序列设计一对简并引物，采用RT-PCR的方法，从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系四龄幼虫总RNA中扩增出与设计相符的基因片段。利用T／A克隆方法，将获得的基因片段克隆入pGEM-Teasy载体，经PCR鉴定重组成功，测序并进行比对。结果共克隆出36个阳性克隆，将其中9个随机挑取的阳性克隆测序及同源性分析，表明为CYP4家族中9个新的cDNA序列，由GeneBank登录上网；经国际细胞色素P450命名委员会鉴定，属CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。为进一步研究细胞色素P450的多样性及其与抗药性的关系打下基础。结论克隆9个淡色库蚊基因部分序列，被鉴定属于CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。     

淡色库蚊细胞色素P450抗性相关基因克隆与初 …

「目的」探讨淡色库蚊细胞色素Ｐ４５０与溴氰菊酯抗药性的关系。「方法」采用一对昆虫细胞色素Ｐ４５０简并引物,以反转录－聚合酶链反应从淡色库蚊扩增特异片段、Ｔ／Ａ直接克隆法筛选阳性克隆,对新序列进行ｃＤＮＡ芯片和逆Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析。「结果」从淡色库蚊对溴氰菊酯敏感品系和抗性品系获得１１２个阳性克隆,其中２４个阳性克隆测序后显示为细胞色素Ｐ４５０新序列,由ＧｅｎＢａｎｋ登录上网;经国际细胞色素Ｐ４５     

用核酸探针检测淡色库蚊溴氰菊酯抗性

目的　用淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关胰蛋白酶核酸探针检测淡色库蚊溴氰菊酯抗性。方法　用逆Northern鉴定抗药性品系和敏感品系中胰蛋白酶的表达差异 ,用随机引物法标记鉴定后的胰蛋白酶cDNA片段为探针Northernblot检测淡色库蚊的抗药性。结果　逆Northern显示胰蛋白酶在抗药性品系中的表达量是敏感品系的 4 33倍。以其为探针Northernblot检测显示 ,胰蛋白酶基因在抗药性品系中高表达 ,抗药性品系中胰蛋白酶的表达量是敏感品系的 3 90倍。结论　作为一种新的抗药性检测的分子生物学方法 ,胰蛋白酶核酸探针可用于区分抗药性品系和敏感品系     

山东省淡色库蚊对杀虫剂的抗药性

目的 检测山东省各地淡色库蚊对常用化学杀虫剂的抗性状况，探讨抗性治理对策。方法 采用世界卫生组织生物测定方法，测定蚊幼虫的LC50确定抗性水平，计算抗性系数。结果 对山东省10个地区近10年的淡色库蚊抗性测定表明，各地淡色库蚊对常用杀虫剂均产生了一定的抗性，对DDVP的抗性最高达2l|18倍，对马拉硫磷的抗性高达5．39倍，对溴氟菊酯的抗性高达42倍。各地抗性水平有逐年增高的趋势。结论 山东各地淡色库蚊对常用杀虫剂均产生了一定的抗性，急需研究实施抗性治理对策。     

淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4家族新成员基因克隆及序列分析

目的　获取淡色库蚊CYP4家族新基因。　方法　根据CYP4氨基酸保守序列设计一对简并引物 ,采用RT PCR的方法 ,从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系四龄幼虫总RNA中扩增出与设计相符的基因片段。利用T/A克隆方法 ,将获得的基因片段克隆入 pGEM Teasy载体 ,经PCR鉴定重组成功 ,测序并进行比对。　 结果　共克隆出 3 6个阳性克隆 ,将其中 9个随机挑取的阳性克隆测序及同源性分析 ,表明为CYP4家族中 9个新的cDNA序列 ,由GeneBank登录上网 ;经国际细胞色素P45 0命名委员会鉴定 ,属CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。为进一步研究细胞色素P45 0的多样性及其与抗药性的关系打下基础。　结论　克隆 9个淡色库蚊基因部分序列 ,被鉴定属于CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。     

山东省部分地区淡色库蚊对常用杀虫剂混用的敏感性检测

目的 为了延缓和克服蚊虫抗性的发生和发展，更好地选用卫生杀虫剂控制蚊虫，测定山东省部分地区现场淡色库蚊对常用杀虫剂混用的敏感性。方法 采用WHO生物测试法，计算LC50、回归方程、增效系数。结果 DDVP 三氯杀虫酯、残杀威 三氯杀虫酯复配共毒系数分别在123．24～212．40和171．80～335．80之间，显示出较好的增效作用。DDVP 残杀威复配效果较差。结论 当淡色库蚊产生抗药性后，采用有机磷或氨基甲酸酯类杀虫剂与有机氯类杀虫剂混用的方法，能取得较好效果。     

对溴氰菊酯抗性和敏感淡色库蚊不同发育阶段的抗性水平

对室内选育的淡色库蚊（对溴氰菊酯抗性品系和敏感品系）用浸渍法测定了Ⅱ龄、Ⅲ龄和Ⅳ龄幼虫，用接触筒法测定了早期、中期和晚期成虫；并观察了增效醚（ＰＢ）、磷酸三苯酯（ＴＰＰ）和杀虫脒与溴氰菊酯混用后的增效效果。结果表明：（１）淡色库蚊各发育阶段对溴氰菊酯的抗性水平，在敏感品系由高至低依次为中期、晚期、早期成虫、Ⅳ龄、Ⅲ龄和Ⅱ龄幼虫；在抗性品系则为早期、中期、晚期成虫、Ⅳ龄、Ⅲ龄和Ⅱ龄幼虫。（２）ＰＢ和杀虫脒均有明显增效作用，提示抗性可能与氧化代谢增强和靶标部位不敏感有关。其中似乎幼虫阶段以氧化代谢增强为主要抗性机制；在成虫阶段，氧化代谢增强和靶标部位不敏感性均在抗性中起重要作用     

用RAPD-PCR鉴定抗溴氰菊酯淡色库蚊

用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ法对淡色库蚊抗溴氰菊酯品系和敏感品系的基因组ＤＮＡ进行了分析鉴别。结果表明：不同引物扩增出的产物数量不等，明显可分辨的带一般在４～１３条之间，带的大小在０．５～５．１ｋｂ之间；２２个引物在两品系中各扩增出１７０条可分辨带，绝大部分条带在两品系间是共同的；Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ７个引物的扩增产物在两者间共显示差异带２１条（２，３，７，４，１，１和３条），其中抗性品系特异带１２条（１，２，５，２，１，０和１条）；敏感品系特异带９条（１，１，２，２，０，１和２条）。这些特异片段可望作为抗性的分子标志用于抗性品系的鉴定以及进一步研究     

微山湖区韩庄镇淡色库蚊抗药性现状监测报告

采用WHO生物测试法,测定了微山湖区韩庄镇淡色库蚊幼虫对常用杀虫剂的抗性水平。结果显示韩庄镇淡色库蚊幼虫对残杀威、DDVP、三氯杀虫酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯等5种常用杀虫剂的LC50分别为0.4741、1.4012、0.2420、0.0034和0.0041mg·L-1,以菊酯类杀虫剂抗性最高。     

淡色库蚊氨肽酶N基因的克隆及生物信息学分析

目的 克隆淡色库蚊Bt毒素受体氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)基因,并对基因及编码蛋白进行生物信息学分析.方法 提取淡色库蚊RNA,通过RT-PCR扩增氨肽酶N基因的全长cDNA序列,纯化PCR产物连接至pMD19-T载体,阳性重组质粒经PCR鉴定后进行基因测序.生物信息学分析APN基因的序列同源性及编码蛋白的结构特征.结果 该基因cDNA序列全长为1 383 bp(含终止密码子),编码460个氨基酸,与致倦库蚊XM_001862270.1序列的同源性为100%.预测蛋白质分子量为52.9 kDa,等电点为4.98.前21个氨基酸为N-末端的信号肽,存在2个N-糖基化位点( 93NLT95和¹⁶⁹NVS¹⁷¹).具有肽酶家族M1的序列特征,锌结合位点HEXXH和谷氨酸锌化氨肽酶的保守结构GAMEN.结论 成功克隆了淡色库蚊氨肽酶N基因并对APN蛋白进行生物信息学分析,为进一步探讨淡色库蚊APN的功能及Bt毒素作用机制奠定了基础.     

冰冻储存对淡色库蚊成虫乙酰胆碱酯酶活性的影响

-20℃冰冻0、7、14、21和28d的残杀威抗性品系和敏感品系淡色库蚊3d龄雌成虫AChE活性均无显著变化。表明-20℃冰冻不影响淡色库蚊AChE活性。因此可将现场采集的蚊虫带回实验室冻存后集中测定AChE。     

沃尔巴克氏体与淡色库蚊溴氰菊酯抗性关系初步研究

目的 目的 探讨沃尔巴克氏体与淡色库蚊溴氰菊酯抗性间的相关性。 方法 方法 以PCR鉴定本实验室饲养的淡色库 蚊体内的沃尔巴克氏体, 采用实时定量PCR技术 （qRT?PCR） 测定并比较淡色库蚊溴氰菊酯抗性和敏感品系中沃尔巴克 氏体表达差异。 结果 结果 本实验室饲养的淡色库蚊体内含有沃尔巴克氏体。淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系卵、 一龄蚊、 二 龄蚊、 三龄蚊、 四龄蚊、 雌蚊、 雄蚊体内沃尔巴克氏体表达水平分别是敏感品系的18.42、 3.69、 4.43、 3.96、 6.31、 1.55、 3.76 倍, 差异均有统计学意义 （P均< 0.05）, 而抗性品系和敏感品系蛹中沃尔巴克氏体表达水平差异无统计学意义 （P > 0.05）。南京江心洲溴氰菊酯抗性雌蚊体内沃尔巴克氏体表达水平是敏感雌蚊的2.64倍。 结论 结论 沃尔巴克氏体可能与 淡色库蚊对溴氰菊酯产生抗性有关。     

淡色库蚊对常用杀虫剂长期选育的抗性水平及交互抗性

目的了解淡色库蚊对3种常用化学杀虫剂长期选育的抗性状况及5种杀虫剂的交互抗性,为合理有效地进行蚊虫化学防治提供依据。方法采用WHO生物测定方法,测定淡色库蚊对3种杀虫剂长期选育的抗性水平。结果经过42代选育,淡色库蚊对敌敌畏（DDVP）、残杀威和氯氰菊酯的抗性指数分别最高达12．17、11．78和534．31倍。结论经过长期选育,发现淡色库蚊对3种常用化学杀虫剂均产生不同程度的抗药性及交互抗性,提示应采取适当措施克服或延缓蚊虫抗药性的产生和发展。     

山东济宁市淡色库蚊抗药性的测定及杀虫剂配方的筛选

目的为了延缓和克服蚊虫抗性的发生和发展,更好地选用卫生杀虫剂控制蚊虫,测定了常用杀虫剂复配对采自济宁市部分地区现场淡色库蚊幼虫的敏感性及增效作用。方法采用WHO生物测试法,计算LC50、回归方程、增效系数。结果DDVP+三氯杀虫酯、残杀威+三氯杀虫酯复配共毒系数分别为123.24～212.40和171.80～335.80,显示出较好的增效作用。DDVP+残杀威复配效果较差。结论当淡色库蚊产生抗药性后,采用有机磷或氨基甲酸酯类杀虫剂与有机氯类杀虫剂混用的方法,能取得较好效果。     

淡色库蚊氯菊酯抗性品系和敏感品系的生物学特性

目的　比较淡色库蚊氯菊酯抗性品系和敏感品系生物学特性的差异。　方法　在实验室观察淡色库蚊氯菊酯抗性品系及敏感品系的吸血、繁殖和发育等生物学特性 ,构建实验种群生命表。　结果　淡色库蚊氯菊酯抗性品系吸血率低于敏感品系 ,卵、幼虫和蛹的发育历期及成虫寿命均长于敏感品系 ,卵期死亡率高于敏感品系。以上各项 ,两种品系间差异均具有显著性意义 (P <0.01)。抗性品系相对于敏感品系的适合度为 0.58。　结论　淡色库蚊氯菊酯抗性品系表现出对生长发育和繁殖的不利性。     

淡色库蚊抗DDVP品系抗性发展及交互抗性

目的探讨淡色库蚊DDVP抗性品系对4种化学杀虫剂的抗性发展及交互抗性，为合理使用杀虫剂提供依据。方法采用WHO标准生物测试法。结果经过43代的选育，抗DDVP品系的抗性达12．17倍，在21代时，对DDVP、残杀威、氯氰菊酯、溴氰菊酯的抗性倍数分别是6．55、4．16、43．27、0．70倍；到第30代时，分别是8．17、4．74、52．48、0．75倍；到39代时，对DDVP的抗性为10．37倍，对残杀威、氯氰菊酯的抗性分别为6．96倍、160．43倍。结论长期使用一种杀虫剂易产生抗性，亦对其他杀虫剂产生交互抗性，用药时应注意种类的选择。     

淡色库蚊rDNA-ITS2基因的克隆分析

目的克隆并鉴定淡色库蚊核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)基因并应用于现场孽生蚊媒的种属鉴定,从而为孽生现场的蚊媒预警提供分子生物学依据。方法设计淡色库蚊诊断性引物分别对淡色库蚊实验室标准株及从现场采集的蚊虫的rDNA-ITS2序列进行PCR扩增,PCR产物纯化后连接到pGEM-Teasy载体上并转化到DH5α菌中,然后对其进行DNA序列测定及分析。结果成功克隆了淡色库蚊的rDNA-ITS2基因。序列分析结果表明,实验中所克隆到的淡色库蚊的rDNA-ITS2序列与GenBank所登录的淡色库蚊的rDNA-ITS2序列同源性均为98%以上,同时发现孽生现场存在淡色库蚊。结论rDNA-ITS2序列在淡色库蚊中具有种属特异性,可为孽生现场的蚊媒预警提供分子生物学依据。