反复冻融与超高压处理制备脱细胞组织工程血管支架的实验研究

目的 观察不同浓度核酸酶对经反复冻溶加超高压处理后兔股动脉的脱细胞效果.方法 无菌条件下采取新鲜兔股动脉,去血管外膜后将材料分为未处理组、冻融组、超高压处理组、冻融+超高压处理,后三组分别于-80℃冷冻2 h、37℃水浴复温15 min,上述冻融过程反复进行3次.5000大气压超高压(4℃)处理20min将供体来源细胞压碎,结合不同浓度核酸酶进行消化,脱去残留细胞碎片形成脱细胞血管支架.通过组织学和超微结构观察,对不同浓度核酸酶脱细胞效果进行评价,测定反复冻融加超高压处理对血管材料生物力学特性的影响.结果 组织学显示,经反复冻溶加超高压处理后的血管材料,可在较短的时间内被较低浓度核酸酶除去血管支架内的供体细胞成分,脱细胞支架的主要生物力学性能指标与正常血管相比,无明显改变.结论 反复冻溶加超高压脱细胞方法可以明显缩短脱细胞血管基质的制备周期,为脱细胞组织工程血管支架的快速高效制备提供一种新的思路和方法.     

超高压脱细胞组织工程血管支架的实验研究

目的 采用新的更安全的抗原去除技术-超高压脱细胞方法处理同种异体血管,观察该方法的脱细胞效果以及猪内源性逆转录病毒(PERV)的去除情况.方法 无菌条件下取出猪降主动脉血管,用10 000 atm超高静水压(4 ℃冷方压)将供体来源细胞压碎,结合酶的消化作用,PBS的搅拌洗涤,脱去细胞残片形成血管生物支架.对该支架脱细胞效果进行组织学评估、超微结构观察、检测DNA含量同时检测PERV.结果 组织学显示超高压脱细胞方法可完全除去血管支架内的供体细胞成分,经超高压脱细胞处理后DNA含量显著降低(p＜0.0001)、PERV被成功灭活.结论 超高压脱细胞方法可为我们提供更安全可靠的组织工程血管支架.     

异种血管组织的脱细胞研究

目前,临床上涉及小口径动脉闭塞的血管疾患呈增多的趋势,然而可供选择的移植物却并不多,虽然聚四氟乙烯等材料用于大口径动脉的移植取得了较好效果,但用于小口径动脉移植的远期通畅率却不尽如人意.作为金标准的大隐静脉或自体动脉移植又受到来源、额外手术创伤与经济负担的困扰.组织工程血管的出现有望解决这个难题.以脱细胞的异种血管作为构建组织工程血管用支架目前研究的较为广泛.本文对目前常用的各种脱细胞方法及其相关的问题做一简要综述.     

组织工程血管支架材料最适孔径的研究

目的 筛选组织工程血管支架材料的最适孔径.方法 用生物可降解材料聚β羟基丁酯(PHB)作为支架材料,运用盐析方法制成实心和不同孔径的膜片;将培养的第3代血管平滑肌细胞种植于膜片上,于培养的第1、3、7、11、14天,采用倒置显微镜下观察、苏木素-伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色、扫描电镜检查及噻唑蓝(MTT)比色法检测查明材料上细胞附着和生长情况.结果 倒置显微镜下无法观察附着于材料上的细胞;HE和扫描电镜标本制备过程中细胞丢失多,其不能为材料提供准确的信息;甲苯胺蓝染色可快速观察材料上细胞附着情况;MTT比色法可定量测定材料上的细胞数.经比较发现150～200 μm孔径的PHB膜片上血管平滑肌细胞附着和生长最佳.结论 150～200 μm孔径的PHB膜片最适合血管平滑肌细胞的附着和生长.     

体外组织工程血管支架内皮化的实验研究

目的：研究兔血管内皮细胞种植于组织工程血管支架内腔面的生长状况。方法：（1）将聚羟基乙酸（Plyglycolic acid,PGA)纤维无纺网和胶原纤维相混合，设计构建组织工程血管支架材料。（2）采用酶消化法从兔主动脉中分离培养兔血管内皮细胞并传代，纯化，接种于组织工程血管支架的内腔面，体外培养，并行电镜等观察。结果：该支架具有一定弹性和韧性，内皮细胞在其内表面形成较完整内皮细胞层，生长状况良好。结论：胶原包埋处理的PGA支架可以作为组织工程人工血管研究的较理想支架材料。为组织工程方法构筑具有分层结构的组织工程血管打下实验基础。     

组织工程血管支架材料的研究进展

组织工程学是一多学科交叉领域,综合应用细胞生物学、工程力学等多学科原理,研究用于人体病损组织或器官的修复或替代、改善其生物活性功能的一门科学[1].组织工程血管支架为新生血管的活细胞生长提供必需的支撑支架,便于细胞黏着、生长和新陈代谢.好的血管支架会使构建的血管更接近正常血管的各项性能,并同步于全新血管的生成而植入的支架材料逐步降解[2].     

脱细胞技术在同种异体组织工程支架中的研究进展

1987年,美国科学基金会在华盛顿举行的生物医学小组会上正式提出了组织工程这一概念,并在1988年将其正式定义为:应用生命科学和工程学的原理及其技术,以生物材料为载体,研究开发、设计构建或重建具有生理功能的组织和器官,然后移植到人体,成为具有修复、维持或改善受损组织功能的生物替代物的一门新兴交叉学科.随着研究的进一步深入,人们开始认识到支架材料、种子细胞、生长因子是组织工程的三要素,其中支架材料的构建是关键环节.     

小口径人造血管支架的研究进展

近年来,随着血管疾病增加,对功能动脉置换的需要也日益增加,小口径动脉如膝下动脉、冠状动脉,使用合成材料移植不像大口径动脉移植物那样有较高的成功率。目前,自身静脉仍是主要移植物。然而,由于血管疾病、截肢术或血管以前已被采集,许多病人无适合的血管可使用,组织工程血管的出现为解决这一问题带来了希望。     

利用脱细胞基质预构小口径组织工程血管的实验研究

目的 在犬腹腔内预置脱细胞基质后形成结缔组织管,观察将其作为血管替代物的力学特征及移植于自体股动脉后的组织结构变化.方法 在犬腹腔内埋置长8～12 cm用硅胶棒支撑的制备好的脱细胞基质,3周后将硅胶棒周围形成的管状物作为血管替代物移植于自体股动脉,同时对此管状物作力学、组织学检测及与颈动脉、股静脉的对比分析.在移植术后6个月观察血管通畅情况.光镜、透射及扫描电镜观察替代物的组织结构.结果 ①血管替代物的力学性能弱于正常动脉而强于正常静脉.②组织学观察:形成的管状物内腔有少量的间皮细胞黏附;弹性纤维、胶原纤维结构较完整;纤维网中充满成纤维母细胞.6个月后内皮细胞在替代物内壁覆盖连续,平滑肌细胞与对照组相近.③移植6个月后脱细胞基质组血管全部通畅.结论 ①用脱细胞基质预构的血管替代物力学性能符合血管移植、血运重建的需要.②所形成的血管替代物移植6个月后组织相容性良好,替代物管壁厚度及组织结构已接近正常血管.     

胶原复合支架在血管组织工程中的应用

目的综述胶原与可降解高分子材料复合支架在血管组织工程中的应用,介绍近年来基于胶原材料制备的多层血管支架。方法查阅近年来胶原复合支架作为组织工程血管支架材料的相关文献,并进行综述。结果作为天然血管的结构蛋白之一,胶原因其良好的组织相容性、可降解性以及具有细胞识别信号等特点,广泛应用于血管组织工程。胶原复合高分子材料可制备具生物活性、力学性能良好的血管支架,其中多层血管支架更可在结构和功能上模拟天然血管。结论胶原复合高分子材料是目前血管支架研究的热点,其中多层血管支架已成为研究的新趋势。     

脱细胞脊髓天然支架的制备及形态学观察

[目的]采用化学脱细胞方法去除细胞和髓鞘成分制作细胞外基质支架,为桥接脊髓损伤缺损提供理想的天然神经支架。[方法]取SD大鼠胸段脊髓约2cm,运用冻融 化学萃取(3%脱氧胆酸钠和1KU/mlDNaseI、RNaseA)的组织工程学方法处理大鼠脊髓组织,并对处理后的脊髓支架分别进行组织学检查,了解脱细胞情况及细胞外基质支架形态。[结果]经过脱细胞处理后,光镜下HE染色脊髓横断面呈网状结构,未见细胞成分存留,纵切面上呈互相交错的管状通路;未见轴突、髓鞘和细胞核。髓鞘染色可见髓鞘脱除彻底,未见髓鞘成分。[结论]本实验采用冻融 化学萃取的组织工程学方法可制备出理想的天然脊髓支架,该支架与脊髓三维组织结构具有高度相似性,有望作为脊髓损伤后桥接物和神经组织工程种子细胞的支架,本实验结果显示3%脱氧胆酸钠和1KU/mlDNa-seI、RNaseA进行脱细胞处理两次是较为合适的,能较为彻底去除细胞及髓鞘成分并较为完整地保留细胞外基质的三维结构。     

骨髓间充质干细胞复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤

目的：体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs），复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤，为进一步临床应用奠定基础。方法：将SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后，以生长状态良好的骨髓间充质干细胞接种于制备好的组织工程化脱细胞真皮支架上，进行体外联合培养，构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程皮肤结构。结果：体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好，传代扩增容易，组织工程化脱细胞真皮基质去细胞完全，骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮基质中生长良好，可体外构建组织工程皮肤。结论：利用体外扩增培养的骨髓间充质干细胞及制备的组织工程化脱细胞真皮基质可以体外联合构建组织工程皮肤。     

Chemical modification of acellular fish skin as a promising biological scaffold by carbodiimide cross-linker for wound healing

Biological matrices can be modified with cross-linkers to improve some of their characteristics as scaffolds for tissue engineering. In this study, chemical cross-linker 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) was used with different ratios (5, 10, 20, 30, and 40 mM) to improve properties such as mechanical strength, denaturation temperature, and degradability of the acellular fish skin as a biological scaffold for tissue engineering applications. Morphological analysis showed that the use of cross-linker at low concentrations had no effect on the structure and textiles of the scaffold, while increasing mechanical strength, denaturation temperature, and degradation time. Cytotoxicity and cellular studies showed that the optimal cross-linker concentration did not significantly affect cell viability as well as cell adhesion. In general, utilising the carbodiimide cross-linker with the optimal ratio can improve the characteristics and function of the biological tissues such as acellular fish skin.     

软骨组织工程支架材料研究进展

各种原因引起的关节软骨损伤在临床工作中非常常见,但临床治疗手段有限,组织工程的发展为关节软骨损伤的修复提供了新的途径。在软骨组织工程中支架材料起着重要作用,选择合适的载体是一个首先要解决的问题。本文对目前软骨组织工程支架材料的现状做一综述,指出了当前软骨组织工程所面临的问题,并针对此问题对未来软骨组织工程材料的研究作出了展望。     

新型聚β-羟基丁酯作为血管组织工程支架材料的实验研究

目的：探讨经改性处理后的可降解生物材料聚β-羟基丁酯(PHB)作为血管组织工程支架材料与血管平滑肌细胞的细胞相容性。方法：采用体外培养的免血管平滑肌细胞接种在经胶原包埋处理后的管型PHB支架材料上，用相差显微镜和扫描电镜观察细胞的粘附和生长情况，并行HE染色观察。结果：免血管平滑肌细胞在改性后的管型PHB支架材料上粘附生长良好，扫描电镜下可见细胞生长融合成片状，HE染色示细胞在PHB材料上生长良好。结论：改性后的聚β-羟基丁酯材料与兔血管平滑肌细胞有较好的生物相容性。     

Comparative Evaluation of the Book‐Type Acellular Bone Scaffold and Fibrocartilage Scaffold for Bone‐Tendon Healing

Bone‐tendon (B‐T) healing is a clinical challenge due to its limited regeneration capability. Fibrocartilage regeneration and bone formation at the healing site are two critical factors for B‐T healing. Promoting fibrocartilage regeneration and bone formation by tissue‐engineering may be a promising treatment strategy. In this study, we innovatively fabricated two kinds of acellular scaffolds from bone or fibrocartilage tissues, namely the book‐type the acellular bone scaffold (BABS) and the book‐type acellular fibrocartilage scaffold (BAFS). Histologically, the two scaffolds well preserved the native extracellular matrix (ECM) structure without cellular components. In vitro studies showed BABS is superior in osteogenic inducibility, while BAFS has good chondrogenic inducibility. To comparatively investigate the efficacy on B‐T healing, the BABS or BAFS were, respectively, implanted into a rabbit partial patellectomy model. Macroscopically, a regenerated bone‐tendon insertion (BTI) was bridging the residual patella and patellar‐tendon with no signs of infection and osteoarthritis. Radiologically, more new bone was formed at the healing interface in the BABS group as compared with the BAFS or control (CTL) groups (p < 0.05). Histologically, at postoperative week 16, histological scores were significantly better for regenerated fibrocartilage in the BAFS group or BABS group compared with the CTL group, but the BAFS group showed a significantly larger score than the BABS groups (p < 0.05). Biomechanical evaluation indicated a higher failure load and stiffness were shown in the BAFS group than those in the BABS or CTL groups at week 16 (p < 0.05). This study indicated that the BAFS is a more promising scaffold for B‐T healing in comparison with the BABS. © 2019 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 37:1709–1722, 2019     

MSCs与CD34~+单核细胞共培养联合脱细胞支架植入体内构建兔阴茎海绵体

目的研究将异体骨髓间充质干细胞(MSCs)和CD34~+单核细胞(MNCs)共培养体系种植于脱细胞海绵体支架上在兔体内构建阴茎海绵体组织的可行性。方法分别从兔骨髓与兔外周血中提取并鉴定MSCs与CD34~+MNCs,将两种细胞组分以107/mL的密度种植于制备好的兔阴茎海绵体脱细胞胶原支架上,同时将相同密度的MSCs、CD34~+MNCs分别种植于支架上,培养4天后植入一种兔阴茎海绵体缺损模型中。3个月后对工程化组织进行取材,行HE及Masson三色染色等组织学检测。结果 MSCs和CD34~+MNCs共培养组近白膜处的海绵体保留了正常海绵体结构,而MSCs组、CD34+单核细胞组及空白支架组以疤痕增生为主,尽管较之CD34~+单核细胞组及空白支架组,间充质干细胞组疤痕组织中的血管数目较多(P0.05)。结论我们的研究证明了将MSCs和CD34~+MNCs的共培养体系种植于脱细胞支架上植入兔体内可以构建出一段组织学上与原生海绵体相似的组织;CD34~+MNCs在体内主要通过协同MSCs而非单独发挥其促血管化的生物学效应。     

牛去细胞骨基质的生物相容性研究

目的 研究新型骨修复材料牛去细胞基质骨的生物相容性,为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据.方法 对牛去细胞骨基质进行急性毒性实验、热源实验、溶血实验、兔肌肉内种植实验和兔桡骨骨缺损修复实验研究.结果 牛去细胞骨基质无毒性、无热源性、不引起溶血反应,植入兔肌肉后逐渐发生生物降解并被纤维组织取代,兔骨缺损区植入后可被骨组织取代.结论 牛去细胞骨基质具有良好的生物相容性,是理想的骨支架材料.