小鼠NGF基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建小鼠 β NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法 :用基因重组技术 ,将小鼠 β NGF的成熟cDNA序列及其前导序列 ,克隆到真核表达载体 pcDNA3.1+中 ,用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENETM6方法 ,转染NIH 3T3细胞。转染后 72h ,用G4 18筛选阳性克隆并培养至 2 0d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Westernblot分析并观察该上清中NGF对PC12细胞突起生长的作用。结果 :β NGF基因在NIH 3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论 :重组真核表达载体 pcDNA3.1+/NGF构建成功 ,NGF蛋白在NIH 3T3细胞中表达 ,并具有良好的生物学活性 ,为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础     

人β—NGF基因在COS—7细胞中的表达及其生物学活性的研究

目的 研究人β-神经生长因子（β-NGF）cDNA在真核细胞中的表达及其表达产物的活性。方法 将质粒pGEM-β-NGF进行酶切并回收β-NGFcDNA片段,构建重组真核表达载体pcDNA3-β-NGF。利用脂质体Lipofectamine方法转染COS-7细胞,对阳性克隆COS-7细胞的mRNA和培养上清分别进行Northern blot分析和观察对PC12细胞突起生长的作用,结果 β-NGF基因在COS-7细胞中获得表达,阳性克隆COS-7细胞培养上清能够促进PC12细胞突起生长,结论 目的基因在COS-7细胞中成功表达β-NGF蛋白,并具有良好的生物学活性。     

神经生长因子基因重组逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的构建神经生长因子(NGF)基因重组逆转录病毒表达载体,研究NGF在神经干细胞(NSC)中的表达情况。方法从大鼠海马组织提取总RNA,利用RT-PCR的方法获得编码大鼠β-NGF的基因片段,应用基因重组技术,将大鼠β-NGF基因片段克隆到逆转录病毒表达载体pLEGFP-N1中,通过脂质体Lipofectamine2000转染包装细胞PT67,经G418筛选后,收集阳性克隆病毒上清,用于感染神经干细胞(NSC),观察该NSC表达的NGF对PC12细胞突起生长的作用。结果限制性内切酶酶切分析鉴定表明为正确重组子,β-NGF基因在NSC中获得表达,该NSC的培养上清液可以促进PC12细胞突起生长。结论重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-NGF构建成功,β-NGF基因可在NSC中表达并具有生物学活性。     

BALB/c小鼠I-Adαβ链编码基因真核双顺反子载体的构建及表达

目的：为了获取BALB／c小鼠I-A^d α、β链编码基因，构建真核双顺反子表达载体并在NIH3T3细胞中表达，建立BALB／c小鼠MHC-Ⅱ抗原递呈细胞研究模型。方法：采用Trizol提取BALB／c小鼠脾细胞总RNA，RT-PCR获取I-A^d αβ链cDNA，连接pGEMT载体测序，正确后亚克隆至plRES真核双顺反子表达载体；用Lipofectamine2000转染NIH3T3细胞，G418筛选转染克隆株。RT-PCR鉴定外源基因在mRNA水平的表达；流式细胞术（FCM）鉴定外源基因在蛋白质水平的表达以及在细胞表面展示的水平。结果：建立了BALB／c小鼠I-A^d αβ链编码基因真核双顺反子表达载体plRES-I-A^d αβ；plRES-I-A^d αβ转染NIH3T3细胞，在G418筛选下可获得高达72％的转染细胞；转染细胞总RNA RT-PCR显示外源基因在mRNA水平得到表达；FCM显示外源基因编码的蛋白高水平表达并定位于细胞表面。结论：为进一步研究BALB／c小鼠MHC-Ⅱ抗原递呈的分子机制奠定了基础。     

β-catenin基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的构建β-catenin真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法提取工具细胞NIH3T3的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增β-catenin基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞NIH3T3细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。最后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-β-catenin在NIH3T3细胞内的定位。结果β-catenin基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为2346 bp,并测序成功。Western blot检测到了GFP-β-catenin融合蛋白表达,分子量约为115kDa。pEGFP-β-catenin在工具细胞NIH3T3细胞中主要定位于细胞膜和细胞质。结论成功构建了β-catenin基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-β-catenin蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞膜和细胞质。     

植烷酸氧化酶真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的构建小鼠植烷酸氧化酶（Phyh）真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到Phyh编码序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;使用细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-Phyh在NIH3T3细胞中的表达及蛋白定位进行分析。结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-Phyh真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中。结论成功构建了带HA标签的小鼠Phyh真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究Phyh的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

人衰变加速因子DAF基因真核表达系统的构建

目的：构建含人补体调节蛋白衰变加速因子DAF分子的cDNA编码区的真核重组表达载体pcDNA3-DAF,转染NIH3T3细胞,建立稳定表达人DAF的NIH3T3细胞模型。方法：将人DAF分子的cDNA编码区克隆到真核表达载体pcDNA3,经酶切和测序鉴定后用磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NIH3T3细胞株。用PCR检测人DAF基因在NIH3T3细胞基因组中的整合;用RT-PCR、Westernblot实验和间接免疫荧光技术分别从RNA水平和蛋白质水平检测人补体调节蛋白分子DAF在细胞株中的表达。结果：成功构建了pcDNA3-DAF重组真核表达载体,并建立了稳定转染的NIH3T3细胞株,成功地表达了目的基因。PCR检测连续传代30次的NIH3T3pcDNA3-DAF细胞,结果显示人DAF基因仍稳定整合在异源细胞的染色体上,并未随着传代而丢失,为稳定的转染细胞株。结论：真核表达载体构建和稳定转染NIH3T3细胞株的建立为进一步研究人DAF功能和多种补体调节蛋白的协同作用奠定基础。     

真核表达载体pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的构建及其在NIH 3T3细胞株中的表达

目的: 构建pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的重组真核表达载体，并在NIH 3T3细胞株中表达。方法: 采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/IgGFc/CD80的真核表达载体pLNCX质粒上，转染NIH 3T3细胞株，经G418筛选细胞，用RT-PCR、流式细胞术检测目的基因表达情况。结果: 经菌落PCR、酶切及一次测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的成功构建；经RT-PCR法，能够从转染的NIH 3T3细胞中扩增出1条与目的基因大小一致的DNA片段，流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白。结论: 重组表达载体pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的构建，并在NIH 3T3细胞株中的成功表达，为该重组质粒转染原代T淋巴细胞从而制备CD20靶向性嵌合锚定T细胞奠定了基础。     

β-神经生长因子基因克隆和诱导表达及其对PC12细胞的诱导分化作用

目的构建β-神经生长因子(β-NGF)慢病毒表达载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,应用Tet-on 3G四环素诱导表达系统,探讨β-NGF在人胚肾(HEK293FT)细胞中的过表达情况,及其对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞分化的影响。方法从SD大鼠脑组织提取总RNA,反转录成c DNA,利用分子生物学技术,克隆鼠β-NGF基因完整编码区,将β-NGF基因定向插入载体p LVX-TRE3G-IRES中。将重组载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和载体p LVX-Tet3G分别转染空白HEK293FT细胞,制备收获慢病毒,共转染HEK293FT细胞,同时用不同剂量强力霉素(Dox)诱导NGF表达(分为未转染组、0、100、500和1000μg/L Dox诱导表达组)。48h后收集细胞,免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞内β-NGF表达情况。同时收集培养上清,1.ELISA检测各组上清内β-NGF的分泌量;2.制作条件培养基,加入PC12细胞培养基中进行诱导培养,观察PC12细胞诱导分化情况。结果双酶切和测序鉴定重组质粒p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF序列和方向正确;β-NGF在转染细胞内被诱导表达,随着Dox剂量增加,表达量增强;β-NGF在培养基的上清内表达,表达量随Dox剂量增加而增多。诱导表达的条件培养基可诱导PC12细胞形态改变,表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)蛋白。结论成功重组慢病毒载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,转染后β-NGF基因能够在HEK293FT细胞中表达和分泌,且该蛋白具有诱导PC12细胞向神经元样细胞分化的能力;运用Tet-On 3G四环素诱导表达系统,可成功诱导表达获得不同剂量β-NGF蛋白。     

登革2型病毒NGC株E基因在NIH3T3细胞中的表达及初步鉴定

目的　构建登革 2型病毒E基因的真核表达载体 ,实现登革病毒E蛋白的真核表达。方法　采用逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR)扩增登革 2型病毒 (NGC株 )包膜糖蛋白E基因全长片段 ,克隆入真核表达载体pcDNA3的Pcmv启动子下游 ,构建重组真核表达质粒pcDNA3 E ,用脂质体转染法转染NIH3T3细胞 ,表达产物以免疫荧光、SDS PAGE和蛋白质印迹进行分析检测。结果　成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3 E ,通过脂质体转染法导入NIH3T3细胞 ,免疫荧光、SDS PAGE和蛋白质印迹分析检测表明 ,E基因在NIH3T3细胞实现了真核表达 ,产物相对分子质量 (Mr)为 6 0× 10 3。结论登革病毒E基因真核表达载体的构建及E基因的真核表达为研究登革病毒E蛋白的结构与功能、研制登革病毒诊断试剂及核酸疫苗奠定了基础     

HSP70基因的克隆与表达

目的 构建HSP70真核表达质粒以用于肾脏缺血预适应中HSP70作用及机制研究。方法用肝癌细胞系HepG2,用RT-PCR方法扩增HSP70cDNA,并利用T载体作为过渡,将HSP70基因克隆到真核表达载体pAAV-MCS中。重组质粒转染NIH3T3细胞,Western-blot法鉴定重组质粒HSP70／pAAV-MCS能在哺乳动物细胞中正确表达。结果RT-PCR方法正确地扩增出了全长HSP70基因。限制性内切酶酶切和测序结果证实HSP70基因克隆完全正确。重组质粒转染哺乳动物细胞系NIH3T3后,ECL-Western-blottimg法证实了目的基因能在其中正确表达。结论成功地克隆真核表达重组质粒HSP70／pAAV-MCS,为下一步研究HSP70在肾脏缺血预适应的作用及其机制打下基础。     

人神经营养素-3基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建含有人NT-3基因真核表达载体pcDNA3．1-NT-3。方法：采用PCR技术，扩增编码神经营养素-3基因，克隆到PMD18-T载体上，再亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1的Hind Ⅲ和BamHI位点。结果：重组真核表达载体pcDNA3．1-NT-3经酶切鉴定证明NT-3基因正向插入真核表达载体中，碱基序列的测定证明重组质粒中含有人的NT-3基因序列。结论：构建的真核表达载体携有人NT-3cDNA序列，并且含有巨细胞病毒强启动子、ploy(A)加尾信号和neo标志基因，可能具有转染多种哺乳类细胞通用性，可用于NT-3基因的真核表达及基因治疗的研究。     

NIH3T3细胞核内过表达的M-CSF对细胞运动的影响

目的构建M-CSF细胞核内定位表达载体pCMV/M-CSF,探讨核内M-CSF对NIH3T3细胞运动的影响。方法采用PCR的方法扩增人M-CSF活性片段,将其插入核内真核表达载体pCMV/myc/nuc,构建重组体pCMV/M-CSF,经脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418筛选后,用免疫细胞化学及Western blot鉴定其在真核细胞中的表达及定位分布,用细胞划痕实验测定M-CSF进入细胞核后对细胞运动能力的影响。结果限制性双酶切及DNA测序分析结果显示插入pCMV/M-CSF的片段为1400bp左右,与预期M-CSF分子大小相当。Western blot结果显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞能稳定表达M-CSF蛋白;免疫细胞化学结果显示表达的M-CSF定位于NIH3T3细胞核。细胞划痕实验显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞有较强的运动能力。结论成功构建M-CSF核内定位表达载体pCMV/M-CSF,核内M-CSF可加强NIH3T3细胞运动。     

小鼠凋亡相关新基因PNAS-4真核表达载体的构建、表达及体外抗肿瘤作用

目的：对小鼠凋亡相关新基因PNAS-4（mPNAS-4）进行克隆，构建其真核表达载体，并在小鼠Lewis肺癌细胞系LL2中转染表达；探讨mPNAS-4基因转染LL2细胞过表达所诱导的体外肿瘤细胞凋亡情况。方法：用RT-PCR从小鼠肝脏组织中克隆mPNAS-4编码区cDNA，构建重组真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4；用脂质体将pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞；用RT—PCR检测转染细胞中mPNAS-4的过表达情况；通过MTT、流式细胞术（FCM）及DNA Ladder分别检测转染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从小鼠肝脏组织中克隆到mPNAS-4全长cDNA并成功构建其真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4，转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞可使其mRNA表达明显上调。mPNAS-4过表达能抑制LL2细胞增殖并诱导其凋亡。结论：mPNAS-4过表达对小鼠Lewis肺癌LL2细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用。     

小鼠β_2m反义核酸重组荧光蛋白表达载体的构建及表达研究

本研究应用分子生物学技术 ,构建小鼠 β2 m反义核酸重组荧光蛋白表达载体pEGFP β2 mAN ,经过酶切、PCR鉴定 ,以及序列分析证实克隆的正确性。然后用脂质体转染NIH3T3细胞 ,经过RT PCR及Westernblot检测 ,观察重组质粒对细胞β2 mmRNA和蛋白表达的影响 ,同时在荧光显微镜下直接观察细胞转染的结果。结果证明pEGFP β2 mAN已成功导入NIH3T3细胞中 ,且有效表达 ,在荧光显微镜下可见梭形绿色荧光细胞 ;与同步转染的小鼠 β2 m正、反义核酸表达载体pcDNA3 β2 mSN、pcDNA3 β2 mAN的转染结果一起进行分析 ,转染pcDNA3 β2 mSN细胞的 β2 mmRNA和蛋白表达水平升高 ,而转染pcD NA3 β2 mAN和pEGFP β2 mAN的细胞 β2 mmRNA和蛋白表达水平降低。小鼠 β2 m反义核酸重组荧光蛋白表达载体pEGFP β2 mAN的转染结果显示 :它不但可以降低NIH3T3细胞 β2 m基因的表达 ,而且为观察脂质体转染效果提供了直观、即时的方法     

人β-神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的构建人β-神经生长因子基因(β-NGF)的真核细胞表达载体,为运用进行基因治疗和细胞移植的研究奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人脑肿瘤旁组织的mRNA中扩增人β-神经生长因子的基因片段,将目的基因、真核表达载体pcDNA3同时经HindⅢ和Apa双酶切、纯化、连接、转化及筛选而构建重组载体pcDNA3-β-NGF;经酶切和测序对重组体进行分析和进一步鉴定。结果RT-PCR产物琼脂糖电泳结果显示：在预期位置有阳性条带。重组载体经酶切、测序等分析插入的基因片段为表达β-NGF的基因。结论人β-NGF基因重组真核细胞表达载体pcDNA3-β-NGF构建成功,为进一步开展β-NGF基因治疗脑部疾患、脊髓损伤修复等研究奠定基础。     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

hCAP基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建hCAP真核表达载体并检测融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞CV-1的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hCAP基因的cDNA全长,并将其克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组载体进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot。最后利用激光共聚焦显微镜观察pEGFP-hCAP在NIH3T3成纤维细胞内的定位。结果:hCAP基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为3 879 bp,测序证实成功。Western blot检测GFP-hCAP融合蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为169 000。pEG-FP-hCAP在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-hCAP,融合蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。     

趋化因子受体CCR5反义RNA在真核细胞中的表达

目的 构建趋化因子受体CCR5反义RNA真核表达载体并获取重组假病毒颗粒以用于抗HIV-1研究，方法 用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞（PBMCs)中获得趋化因子受体CCR5翻译起始区的基因片段，并以正、反两个方面定向插入到真核表达载体pLXSN上，重组载体用脂质体转染剂（lipofectAMINE)转染PA317包装细胞，抗-G418克隆的细胞上清经逆转录后用荧光定量PCR（FQ-PCR）测定假病毒滴度，进一步感染NIH/3T3细胞。结果 CCR5正、反义RNA的真核表达载体。经PA317细胞包装形成的假病毒颗粒已成功地感染NIH/3T3细胞，目的基因在该细胞中得到整合与表达。结论 从PBMCs中获得的趋化因子受体CCR5基因片段通过逆转录病毒载体可转移至真核细胞中并得到表达，为进一步研究CCR5反义RNA的抗HIV-1作用奠定了基础。