小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

人截断型转化生长因子β受体Ⅱ真核表达载体的构建和表达

目的构建无细胞内段基因的人转化生长因子βⅡ型受体（△TβRⅡ）的真核表达载体pEGFP／△TβRⅡ，转染L02细胞以表达融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，并检测其生物学活性。方法以质粒H2-3FF为模板，用PCR方法扩增得到人转化生长因子βⅡ型受体（TpRⅡ）胞外段和跨膜段的cDNA，将该cDNA克隆到真核表达载体pEGFP-N2上，构建成pEGFP／△TβRⅡ重组质粒。经双酶切和核酸测序鉴定，将该重组质粒转染L02细胞，用倒置荧光显微镜观察融合蛋白EGFP的表达，并检测其生物学活性。结果L02细胞转染pEGFP／△TβRⅡ重组质粒后，在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP的表达，所表达的蛋白能显著减轻TGF-β1对L02细胞G1～S期的阻滞作用。结论成功构建了pEGFP／△TβRⅡ重组质粒，并表达了有活性的融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，为进一步探讨其生物学效应奠定了基础。     

人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达

目的：构建人肠三叶因子（hITF）重组真核表达载体,并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法：通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段,将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr,得到重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr;经脂质体介导转染CHO/dhfr-细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO/dhfr-细胞系;用RT-PCR及ELISA法检测hITF的表达。结果：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并在CHO/dhfr-细胞中分泌表达hITF蛋白,为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。     

鼠bcl-XL基因在CHO细胞中的表达

目的：构建携带鼠bcl-XL基因的真核表达载体，并将其在CHO细胞中表达。方法：用反转录PCR获取鼠bcl-XL全长cDNA序列，将其克隆进pEGFP重组融合表达质粒，脂质体法转染CHO细胞，荧光检测目的蛋白表达。结果：成功获得了鼠bcl-XL cDNA，构建了编码鼠bcl-XL的真核融合表达载体pEGFP-bcl-XL，转染CHO细胞后观察到融合蛋白表达。结论：鼠bcl-XL基因的克隆及融合表达，为进一步在高密度、大规模细胞培养中利用bcl-XL具有重要意义。     

人可溶性转化生长因子βⅡ型受体真核表达载体的构建及表达

目的:构建人转化生长因子βⅡ型受体胞外区(sTGFβRⅡ)基因的真核表达载体,转染真核细胞CHO以表达sTGFβRⅡ蛋白,并检测其生物学活性.方法:以TGFβRⅡ的重组质粒为模板,用PCR方法扩增得到人TGFβRⅡ胞外区(1-159位氨基酸)的cDNA,将该cDNA重组到真核表达载体pCDNA3.1/myc-his(-)B(pCDNA)的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点上,构建成pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒.经双酶切和核酸测序鉴定,将该重组质粒转染CHO细胞,用Western blotting法检测sTGFβRⅡ的表达,并测定其生物学活性.结果:CHO细胞转染pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒后,其培养上清经 Western blotting分析,显示有特异性的蛋白条带,所表达的蛋白能明显抑制TGFβ1对貂肺上皮细胞的增殖抑制作用.结论:成功克隆了sTGFβRⅡ基因,并获得有生物学活性的sTGFβRⅡ蛋白.     

绿色荧光蛋白-小鼠纤维介素蛋白融合基因表达载体的构建和表达

目的：构建绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠纤维介素蛋白(mfgl2)的融合蛋白表达载体，在仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，为mfgl2的RNA干扰体外研究提供简便的判断手段。方法：用PCR从mfgl2cDNA文库中扩增出mfgl2cDNA片段，插入到GFP表达载体pEGFP—N2中GFP基因序列的上游，构建成GFP—mfgl2融合基因表达载体pEGFP—mfgl2，将该载体转染到CHO细胞后24—48h，通过荧光显微镜观察并摄片。结果：扩增出长约1．3kb的基因片段，经双酶切鉴定和测序鉴定无误；重组载体转染CHO细胞后，在荧光显微镜下可观察到GFP的表达。结论：成功构建了pEGFP．mfgl2融合基因表达载体；重组载体可在CHO细胞中表达出GFP—mfgl2融合蛋白，为下一步进行mfgl2RNA干扰研究提供了简便的判断手段。     

大鼠转化生长因子βⅡ型受体胞外区与γ干扰素融合蛋白真核表达载体的构建

目的:在哺乳动物细胞中表达有生物学活性的大鼠转化生长因子βⅡ型受体胞外区与γ干扰素(rsTGFβRⅡ-IFNγ)融合蛋白.方法:提取大鼠肝脏mRNA,用RT-PCR方法分别扩增sTGFβRⅡ和IFNγ基因并克隆至同一真核表达载体pSecTag2A,构建pSecTag2A/rsTGFβRⅡ-IFNγ重组体,以脂质体转染至CHO细胞,用ELISA及Western印迹法检测rsTGFβRⅡ-IFNγ表达,并检测该融合蛋白的生物学活性.结果:转染pSecTag2A/rsTGFβRⅡ-IFNγ的CHO细胞培养上清表达rsTGFβRⅡ-IFNγ融合蛋白,该融合蛋白具有明显的抗病毒活性,能拮抗TGFβ1对CCL-64细胞的增殖抑制作用,能抑制TGFβ1诱导的体外培养的HSC活化.结论:本实验构建的pSecTag2A/rsTGFβRⅡ-IFNγ表达质粒能在哺乳动物细胞中表达具有生物学活性的rsTGFβRⅡ-IFNγ融合蛋白.     

分泌型人IL-1β表达载体的构建及在H7402细胞中的表达

目的构建经典途径分泌型人白细胞介素1β(shIL-1β)重组表达载体,检测其在H7402肝癌细胞中的表达。方法采用SOE方法将人红细胞生成素(EPO)信号肽序列和编码人白细胞介素(hIL-1β)成熟蛋白的基因序列拼接形成融合基因,与pIRES2-EGFP质粒重组构建shIL-1β真核表达载体pIRES2-EGFP-shIL-1β,利用jetPEI方法将其稳定转染H7402细胞(H7402／shIL-1β),荧光显微镜及RT-PCR检测融合基因的表达水平,间接ELISA方法测定培养上清hIL-1β分泌水平。结果荧光显微镜下观察可见H7402／shIL-1β细胞发出明亮绿色荧光,RT-PCR检测显示pIRES2-EGFP-shIL-1β能够在H7402细胞中稳定表达融合基因mRNA,同时细胞培养上清中hIL-1β表达水平明显上升。结论成功构建了经典途径分泌的hIL-1β重组表达载体,该载体可在H7402细胞中稳定分泌生物活性的hIL-1β。     

pEGFP-C1-PEX真核表达载体的构建及其在大鼠骨髓间质干细胞中的表达

目的构建pEGFP-C1-PEX真核表达载体并转染大鼠骨髓间质干细胞(MSCs),观察其在MSCs内的表达。方法用RT-PCR法从大鼠C6胶质瘤细胞中扩增出带有XhoI、BamHI酶切位点的PEX基因片段,将PEX基因片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEG-FP-C1上,通过脂质体将pEGFP-C1-PEX转染入大鼠MSCs。结果pEGFP-C1-PEX真核表达载体构建成功,荧光显微镜下观察,pEGFP-C1-PEX表达载体转染到MSCs24h后可见PEX融合蛋白表达。结论pEGFP-C1-PEX真核表达载体能够在大鼠MSCs中表达PEX融合蛋白。     

丙型肝炎病毒核心区截短型基因真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的：建立截短的丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的真核表达载体，并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中瞬时表达：方法：应用多聚酶链反应（PCR），以HCV-H株全长cDNA序列为模板，扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段，克隆人真核表达载体pcDNA3．1（-），并通过脂质体转染至CHO细胞。结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1-Ct，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT-PCR证实pcDNA3．1-Ct在CHO细胞中表达截短型的C蛋白。结论：成功构建羧基端部分缺失的HCVC区基因的真核表达载体，瞬时转染CHO细胞，为进一步基因免疫和构建多表位卡介苗（BCG）活载体疫苗奠定基础。     

VEGF—C真核表达载体的构建和体外表达

目的：构建血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因的真核表达栽体，检测其在真核细胞CHO中的表达。方法：根据人VEGF—C cDNA的序列，设计合成一对特异性引物，用RT—PCR法克隆乳腺癌细胞MCF-7VEGF—C基因的cDNA，回收PCR产物连接于克隆载体。扩增，质粒提取，酶切鉴定并进行基因序列鉴定。酶切回收VEGF—C cDNA全长的基因片段，与真核表达栽体pcDNA3．1(-)连接重组质粒进行酶切鉴定。采用脂质体转染法将构建的pcDNA3．1(-)，VEGF-C转染至CHO细胞中，G418加压筛选培养。最后用Westerm—blotting法检测细胞培养上清以及裂解细胞中的VEGF-C蛋白。结果：基因测序证实RT-PCR产物包含VEGF-C cDNA全长。重组peDNA3．1(-)中含 有VEGF—C cDNA全长序列，Westem—blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF-C蛋白存在。结论：成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。     

bFGF荧光真核表达载体构建及表达

目的 构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的荧光真核表达载体，以便进一步转染成骨细胞，研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法 应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C3，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果 ①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性。②荧光显微镜下观察GFP的表达情况，观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光；免疫组化检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结论 成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP-C3-bFGF，并在3T3细胞中表达了bFGF。     

mTOR反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的反义RNA真核表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSNC）功能的影响。方法：提取人VSMC总RNA，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增mTOR基因cDNA序列，经pGEM-T载体克隆后双酶切，将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1，构建mTOR基因反义RNA真核表达载体。转染VSMC，采用Western blot法检验反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：经RT-PCR获得664bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为mTOR基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR，测序证明序列正确后转染VSMC，证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达，VSMC的分裂、增殖过程受阻。结论：已经成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体。     

重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α的分泌型真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的稳定表达。方法以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法合成人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/tumstatin。利用PCR从pGEM-T/tumstatin和PBV220-TNF-α载体中分别扩增出sig-tumstatin-linker和linker-TNF片段,将其克隆得到sig-tumstatin-linker-TNF片段,sig-tumstatin-linker-TNF片段经酶切后,插入经同样酶切pIRESneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的sig-tumstatin-linker-TNF基因片段及重组载体进行验证。将重组sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体转染到CHO-K1对其表达状况进行检测。结果所获得的sig-tumstatin-linker-TNF片段(1.32kb)序列与报道的序列完全一致。酶切鉴定的结果表明含肿瘤抑素基因的重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF表达载体构建成功。转染重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF的CHO-K1表达了肿瘤抑素融合蛋白tumstatin-linker-TNF。从生长曲线结果来看,转染pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体和转染pIRESneo3的CHO-K1比未转染的CHO-K1细胞的生长速度要慢。结论成功地构建了重组人肿瘤抑素融合蛋白的真核表达载体,并获得能稳定表达人肿瘤抑素融合蛋白的CHO-K1。     

真核表达载体pEGFP-N2/AT2R的构建及其在原代血管平滑肌细胞的表达

目的体外构建携带血管紧张素Ⅱ2型受体(ANGⅡType 2 Receptor,AT2R)基因的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,并观察其在大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中的表达。方法以pUHD-10.3/AT2R质粒为模板,PCR扩增AT2R基因的全长cDNA序列,再将其克隆入载体pEGFP-N2,构建其真核表达载体pEGFP-N2/AT2R。以基因转染技术,将AT2R导入原代VSMCs。倒置荧光显微镜观测转染后VSMCs生长变化及AT2R在其中的表达等情况。图像分析技术检测AT2R在VSMCs中的转染效率。Western blot检测转染AT2R基因的VSMCs表达其编码蛋白。RT-PCR法对AT2R基因修饰的VSMCs进行鉴定。结果成功构建AT2R基因的真核表达载体pEGFP-N2/AT2R,该真核载体能携带AT2R基因转染并有效表达于VSMCs,其转染效率约40%,RT-PCR及Western blot均可检测到AT2RmRNA及蛋白在血管平滑肌细胞中高表达。结论成功地将克隆到的AT2R基因克隆入pEGFP-N2载体中,并实现了AT2R基因在原代VSMCs的表达。     

人TβRⅡ-ⅠgG1Fc融合基因重组腺病毒载体的构建

目的构建含有人TGF-βRⅡ型受体胞外区及ⅠgG1Fc段融合基因的腺病毒载体，并进行初步的功能活性鉴定。方法RT-PCR扩增人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IgG1Fc段基因。通过Overlap PCR融合为目的基因hTTβRⅡ-ⅠgG1Fc；克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒．线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌．同源重组构建腺病毒质粒；将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞，并扩增、纯化、RT-PCR鉴定；ELISA初步检测重组腺病毒的功能活性。结果目的基因经酶切分析、测序鉴定正确；RT—PCR及ELISA表明重组腺病毒能表达hTβRⅡ-ⅠgG1Fc，中和HLF分泌的TGF-β1。结论成功构建了含融合基因hTβRⅡ-ⅠgG1Fc的腺病毒载体，体外实验证实表达的蛋白具有中和TGF-β1的作用，为进一步研究放射性肺纤维化的基因治疗提供实验依据。     

杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白的表达分析

目的 研究杜氏盐藻(Dunaliella salina)核基质结合区结合蛋白(matrix attachment region binding protein,MBP)基因随盐藻的生长表达变化情况及真核表达.方法 利用实时荧光定量PCR检测盐藻中MBP基因的表达变化,构建MBP的cDNA全长序列及N端和C端序列的含有组氨酸标签的真核表达载体,转染CHO细胞,筛选稳定转染株,Western blotting检测融合蛋白表达情况.结果 盐藻的MBP基因表达随生长周期变化,MBP及其N端和C端的融合蛋白成功在CHO细胞表达.结论 MBP可能参与盐藻增殖过程中RNA的加工,并为下一步分离真核表达的MBP,研究其功能提供了实验基础.     

大鼠Pdcd4基因真核载体的构建与表达

目的 构建大鼠程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4, Pdcd4)基因真核表达载体,为进一步研究该基因的功能提供条件。方法 提取E3大鼠肺组织总RNA,RT-PCR扩增大鼠Pdcd4基因全长cDNA;经过双酶切、连接等反应,构建pEGFP-C1-Pdcd4重组表达载体。将该载体转染大鼠巨噬细胞系NR8383细胞,通过RT-qPCR与Western blot法检测NR8383细胞Pdcd4基因的表达。结果 RT-PCR扩增的大鼠Pdcd4全长cDNA为1410bp;pEGFP-C1-Pdcd4重组真核表达载体中插入片段与NCBI GenBank文库中大鼠Pdcd4 cDNA的序列完全一致;倒置荧光显微镜下观察转染后NR8383细胞中绿色荧光蛋白的表达确定转染成功;RT-qPCR与Western blot法检测NR8383细胞中Pdcd4基因的表达水平明显上调。结论 成功构建pEGFP-C1-Pdcd4重组真核表达载体,为进一步研究Pdcd4基因的作用机制奠定基础。     

TGF-β1真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建人转化生长因子-β1（TGF-β1）的真核表达载体,并检测其融合蛋白在真核细胞COS-7中的表达,为阐明TGF-β1在肝纤维化发生、发展中的作用以及建立相应的基因沉寂治疗途径奠定基础.方法：从人的肝脏组织中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得人TGF-β1基因,将其克隆到真核荧光表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒pEGFP-N1-TGF-β1,转染真核表达细胞COS-7中,通过荧光显微镜检测其表达,RT-PCR和Western Blot检测TGF-β1基因在真核细胞中的表达.结果：通过RT-PCR方法克隆人TGF-β1基因为1173bp,与目的基因片段大小相一致; 测序结果显示,于531位有1个碱基突变：T→C,为无义突变.通过RT-PCR和Western Blot检测到TGF-β1基因的表达,其融合蛋白分子质量约为52ku（绿色荧光蛋白分子质量约为27ku）,说明重组质粒在COS-7细胞内正常表达.结论：成功的构建了真核表达质粒pEGFP-N1-TGF-β1,并在真核细胞COS-7中表达,为进一步研究其在肝纤维化的基因治疗中奠定了基础.