兔骨髓基质细胞体外成骨分化鉴定及与煅烧骨复合培养的实验研究

目的研究兔骨髓基质细胞体外向成骨细胞分化的生物学特性及其与牛煅烧骨体外复合培养的生物相容性.方法将体外培养1周的兔骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化,于1、2、4周时提取RNA,采用RT-PCR技术检测ALP和I型胶原mRNA表达,并对培养2周的细胞行VonKossa染色观察钙结节形成;另制备细胞-煅烧骨复合物,继续培养1、7、14 d后取出,扫描电镜观察及X射线衍射仪检测.结果体外诱导培养2、4周后,兔骨髓基质细胞成功表达ALT和I型胶原,VonKossa染色可见钙结节形成.扫描电镜及X射线衍射分析证实细胞在煅烧骨表面大量贴附成活,14 d后细胞铺满支架表面,合成并分泌胶原纤维及钙盐.结论兔骨髓基质细胞体外可成功向成骨细胞诱导分化,成骨特性表达佳;与牛煅烧骨体外复合培养显示良好的生物相容性.     

地塞米松调节骨髓基质细胞成脂及成骨分化的研究

目的　观察激素对骨髓基质细胞脂肪特异性基因aP2mRNA及成骨基因Ⅰ型胶原mRNA表达的影响。方法　以地塞米松 (1× 10 -7mol/L)作为诱导剂 ,采用完整细胞斑点印迹分子杂交方法检测实验组和对照组中aP2和Ⅰ型胶原mRNA表达。结果　实验组aP2mRNA含量4847.7± 40 6 .4明显高于对照组 15 7.6± 10 .8,其Ⅰ型胶原mRNA含量 44 2 .3± 5 7.8明显低于对照组 5 35 3 .6± 36 4.6。结论　地塞米松能够从基因调控水平诱导骨髓基质细胞向脂肪细胞分化 ,减少其向成骨细胞分化 ,这可能与激素性骨坏死的发病机制有关。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养诱导成骨能力的研究

目的：观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养生长时的生物学特性，及诱导分化为成骨细胞的能力。方法：取成年大鼠2只，处死后分离、培养骨髓基质细胞，第8天时添加矿化液诱导培养，细胞经传代后绘制生长曲线。应用倒置相差显微镜、透射电镜观察其生长特性，并进行甲苯胺蓝染色，Won Kossa染色，碱性磷酸酶染色。结果：培养的大鼠骨髓基质细胞呈成纤维细胞样生长，增殖活跃。经诱导后，细胞碱性磷酸酶活性高，连续培养30天，Von-KaSSR染色显示有局灶状钙盐沉积。结论：MSCs易于分离培养，体外扩增速度快，在矿化条件下，骨髓基质细胞在体外即具有很强的成骨能力，为研究其作为骨组织工程种子细胞植入体内成骨奠定基础。     

骨髓基质细胞体内成骨研究进展

骨髓分为造血和基质两大系统 ,其成骨能力主要来源于骨髓基质干细胞(ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ,ＢＭＳＣ)。ＢＭＳＣ所含的少量多能基质干细胞 ,是多种细胞的前体细胞 ,具有多向分化潜能 ,能够向成骨系细胞、成纤维系细胞、网状细胞、脂肪细胞和内皮细胞等分化[1] 。ＢＭＳＣ在适宜的培养条件下增殖分化为成骨细胞具有较高的碱性磷酸酶活性 ,可分泌骨钙素 ,合成并分泌Ⅰ型胶原等[2 ] 。由于ＢＭＳＣ来源充足、取材方便、使用安全、成骨能力确切、便于临床应用 ,将其作为骨组织工程的种子细胞来源 ,研究其体内成骨作用 ,…     

狗骨髓基质细胞的体外诱导成骨潜能研究

目的：观察狗骨髓基质细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法：采用成年狗双侧髂骨取材进行骨髓基质细胞培养，应用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法观察细胞增殖；以对硝基苯磷酸盐法及骨钙素含量放免测定法测定碱性磷酸酶活性及骨钙素含量；用Von Kossa染色法观察矿化结节；用间接免疫荧光染色法测定Ⅰ型胶原。观察在培养液中添加地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠条件下骨髓基质细胞生长及成骨分化情况。结果：骨髓基质细胞呈成纤维样表现，增殖力强。诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素含量明显增高，Ⅰ型胶原表达增多，10～12d达到高峰，并出现矿化结节。结论：狗骨髓基质细胞在本实验条件下，成骨能力肯定，增殖能力强，可作为骨组织工程的种子细胞。     

成骨诱导的兔骨髓基质干细胞成骨活性的表达及维持

目的观察成骨诱导的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)体内、外环境下成骨活性的表达及维持。方法观察BMSCs在体外成骨诱导培养条件下的成骨分化特性;构建兔BMSCs与活骨组织共培养模型模拟体内“成骨环境”,将成骨诱导的MSCs置于共培养及普通传代培养条件下进行传代培养,观察经成骨诱导的BMSCs在体外及模拟体内的培养条件下细胞的表型维持情况。结果药物成骨诱导培养的BMSCs,其ALP活性及骨钙素均显著高于普通培养组(P<0.05);经过诱导培养的BMSCs,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性。RT-PCR法半定量测定Ⅰ型胶原mRNA,成骨诱导培养的Ⅰ型胶原mRNA表达量明显高于普通传代培养对照组。药物成骨诱导后的细胞在体外普通传代培养传5代后,细胞碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素水平及Ⅰ型胶原表达稳定维持在较高水平,保持其成骨细胞的表型;在共培养条件下,ALP活性、骨钙素水平Ⅰ型胶原表达保持在高水平,且ALP活性、骨钙素水平在大部分时间点均高于普通传代培养。结论药物成骨诱导培养呈现促BMSCs向成骨方向转化的特点,能使ALP、骨钙素及Ⅰ型胶原表达短期内达到高水平;经成骨诱导的BMSCs在体外或模拟的体内传代培养条件下,均能维持成骨表型,保持成骨活力。     

骨髓基质细胞体内外成骨的实验研究

目的：探讨骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cell,BMSc)向成骨细胞转化的条件,利用骨髓基质细胞构建组织工程化骨组织。方法：采用地塞米松、β-甘油磷酸钠诱导体外培养的兔骨髓基,上差异显微镜和碱性磷酸酶检测基向成骨细胞转化的能力。将骨髓基质细胞与生物活性玻璃陶瓷（Bioactive glass ceramic,BGC)复合后植入免自体肌袋内,观察成骨过程。结果：在适当诱导条件下,骨髓基质细胞可向成骨细胞分化,在体内外表现出明显的成骨能力,地塞米松、β-甘油磷酸钠起着重要的作用。结论：骨髓基质细胞是骨组织工程的良好细胞来源,利用组织工程化方法可构建新生骨组织。     

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染对人骨髓基质细胞体外成骨诱导的影响

目的 研究增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染人骨髓基质细胞(MSC)，对其体外诱导后表达成骨表型的影响，探讨EGFP作为骨组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，并转染骨髓基质细胞，G418进行筛选。将转染后稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓基质细胞(MSC-EGFP)进行成骨诱导扩增，以未转染的MSC为对照组，分别检测成骨诱导后碱性磷酸酶(AKP)活性，骨钙蛋白(OCN)含量和成骨细胞转录因子(Cbfal)的表达。结果 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，转染后获得稳定表达绿色荧光蛋白的MSC-GFP，其体外经成骨诱导后，同样能表达成骨特征性表型，AKP，OCN，Cbfal表达和未转染组无明显差别。结论 MSC转染EGFP后，不影响其体外成骨诱导后成骨表型的表达，EGFP可作为骨组织工程种子细胞(MSC)良好的示踪剂。     

小剂量阿司匹林对去势大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]检测不同浓度低剂量阿司匹林对去势后(OVX)大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响.[方法]建立SD大鼠去势模型,全骨髓贴壁法培养骨髓基质干细胞(BMSCs),传代4次后进行成骨诱导,建立对照组和不同浓度阿司匹林组(0.25、0.5、1、2及5mmol/L).于不同的培养时间点,倒置显微镜观察并进行MTT检测细胞增殖生长情况;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测培养细胞上清ALP活性;于诱导7d和21d时分别行细胞碱性磷酸酶染色和茜素红钙化结节染色.[结果]阿司匹林无明显促进BMSCs增殖作用,而大剂量阿司匹林(5 mmol/L)具有抑制BMSCs增殖作用.实验组(0.25、0.5、1、2 mmol/L阿司匹林组)细胞培养上清中ALP浓度较对照组显著增强(P＜0.05);碱性磷酸酶染色(1、2 mmol/L组)阳性表达增强;茜素红染色显示,实验组(0.5、1、2mmol/L组)钙结节数量、钙化面积均高于对照组(P＜0.05).[结论]阿司匹林不能直接促进去势大鼠BMSC增殖活性,但小剂量阿司匹林可显著提高体外培养BMSC成骨活性,增强钙盐沉积,促进钙结节形成.     

酒精诱导鼠骨髓基质细胞成脂分化的实验研究

临床上酒精诱发的股骨头缺血性坏死常死^[1]。动物实验证明酒精可导致股骨头骨髓内脂肪细胞增殖肥大，骨细胞脂肪变性，坏死。但其机制尚不完全精楚，本研究采用细胞体外培养，观察酒精对小鼠骨髓基质细胞（marrow stromal cells,MSCs)的影响，探讨骨坏死时骨髓内脂肪增多的原因，进一步阐明酒精诱发的股骨头坏死的病理学机制。     

人骨髓基质细胞培养及向成骨细胞的诱导分化

目的研究人骨髓基质细胞体外培养及向成骨细胞诱导分化的实验方法。方法采用梯度离心法获得人骨髓基质细胞，细胞纯化后使用分化培养液将骨髓基质细胞向成骨细胞方向诱导分化。通过形态学观察、生化指标检测、细胞染色和矿化结节测定等方法，确定细胞的功能状态和分化程度。结果显微镜观察显示获得的人骨髓基质细胞生长状况良好，生化指标稳定；经分化培养液培养的细胞增殖速度明显减慢，生长状态平稳。细胞在分化培养过程中，上清液中碱性磷酸酶分泌量明显增加，细胞碱性磷酸酶染色明显浓染，随时间呈显著增强趋势；采用常规培养液培养的骨髓基质细胞，在汇合后不能形成明显的矿化结节。用分化培养液培养的人骨髓基质细胞，在14d时开始出现矿化结节，在21d时呈现密集的茜素红染色矿化结节。结论梯度离心法获得的人骨髓基质细胞生长情况良好，功能状态稳定；体外培养的人骨髓基质细胞在一定条件下可以向成骨细胞方向诱导分化，并具有良好的成骨细胞功能特征，可以满足进一步研究的需要。     

音猬因子体外诱导人骨髓基质干细胞转化为神经元样细胞的研究

目的：研究体外使用音猬因子（sonic hedgehog，SHH）诱导人骨髓基质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞（神经干细胞、神经细胞、神经胶质细胞）的可行性。方法：从健康志愿者髂骨抽取骨髓5ml．离心、分离BMSCs。接种于含10％胎牛血清（FBS）的DMEM／F12培养液中，BMSCs体外扩增、纯化到第五代后分别种于含有不同浓度诱导液的24孔板中：A组为空白对照；B组加SHH 700ng/ml，碱性成纤维生长因子8（fibroblast growth factor-8，FGF-8）140ng／ml；C组加SHH500ng/ml，FGF-8100ng／ml；D组加SHH250ng/ml，FGF-8 50ng／ml；E组加SHH125ng／ml，FGF-825ng／ml，诱导BMSCs分化。使用免疫组化及免疫荧光鉴定微管相关蛋白（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、神经元烯醇化酶（NSE）的表达。结果：诱导7d后，部分BMSCs胞体收缩、突起伸出，表现出神经元样细胞的形态。除A组外其余各组免疫组化及免疫荧光染色NSE、MAP-2均为阳性，各组免疫组化及免疫荧光染色均有GFAP阳性细胞存在，且以B组、C组的MAP-2、GFAP、NSE染色阳性细胞数最多。结论：人BMSCs具有较强的自我更新和多向分化潜能，一定浓度的SHH可以在体外有效诱导人BMSCs转化为神经元样细胞。     

成人骨髓基质干细胞的体外培养及初步诱导分化研究

目的:探讨体外培养人骨髓基质干细胞(BMSC)的方法和初步诱导BMSC向神经细胞方向分化的方法。方法:采用正常成人献髓者骨髓,分离扩增BMSC,原代培养后将传1～4代细胞按1×104/ml种于24孔板,绘制生长曲线、贴壁率,观察细胞生长及不同浓度的碱性成纤维生长因子(bFGF)对BMSC的作用。以全反式维甲酸(RA)和bFGF为诱导剂,观察诱导前后BMSC的变化。结果:原代BMSC生长状态良好,传至第5代仍保持干细胞特性,bFGF可明显促进BMSC增殖,且呈剂量依赖关系。RA和bFGF诱导12h,BMSC逐渐向神经样细胞转化,胞体收缩成锥形、三角形或不规则形,细胞伸出细长突起,免疫细胞化学鉴定呈Nestin阴性,NSE阳性,GFAP阳性,且NSE阳性细胞数较GFAP阳性为少。结论:BMSC可在体外稳定扩增,且能保持干细胞特性,RA和bFGF可诱导其分化为神经细胞。     

骨髓间充质干细胞向雪旺细胞分化的体内外实验研究

目的研究骨髓间充质干细胞在体内、外条件下向周围神经雪旺细胞分化的可行性。方法利用SD大鼠间充质干细胞(取自股骨和胫骨)贴壁生长的特性，培养纯化，传代扩增。用复合诱导因子(Beta-mercaptoethanol，retinoic acid，forskolin，basic—FGF，PDGF，heregulin-β)在体外诱导间充质干细胞分化。用免疫细胞化学(P75，S-100，GFAP)鉴定体外的诱导结果。将PKH67标记的间充质干细胞移植人损伤的周围神经动物模型内，术后2周行组织切片免疫荧光染色，激光共聚焦定位移植细胞的去向。结果诱导后的间充质干细胞形态类似雪旺细胞，免疫荧光鉴定骨髓间充质干细胞具有雪旺细胞性质，表达雪旺细胞的表面标志(GFAP，S-100和P75)。周围神经组织切片免疫荧光染色后共聚焦定位的间充质干细胞表达雪旺细胞的表面标志(GFAP，S-100和P75)。结论骨髓间充质干细胞在体内、外都可以分化为具有雪旺细胞性质的细胞，表达GFAP，S-100和P75。骨髓间充质干细胞有可能替代雪旺细胞促进周围神经的再生。     

骨保护素和骨保护素配体在人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中的表达

目的研究骨保护素和骨保护素配体在人骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化过程中的表达情况，探讨其在骨重建过程中的调节作用。方法实验中采用梯度离心法和酶消化法分别获得人骨髓基质细胞和成骨细胞，并将骨髓基质细胞向成骨细胞方向诱导分化。通过形态学观察、生化指标检测、细胞染色和矿化结节测定等方法，确定骨髓基质细胞的功能状态和分化程度。采用RT-PCR和Westem blot方法，检测骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中骨保护素和骨保护素配体的表达情况。结果获得的骨髓基质细胞和成骨细胞生长状态良好，生化指标稳定。骨髓基质细胞分化后，碱性磷酸酶分泌明显增加，可以产生大量的矿化结节，具有成熟成骨细胞的表型特征。RT-PCR和Western blot检测，在骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中，骨保护素在mRNA和蛋白质水平的表达明显升高，而骨保护素配体的表达则逐渐下降。细胞中OPG mRNA表达在第21天时达到最大，约为未分化时水平的2．5倍。而OPGLmRNA表达减少为未分化时1／2；细胞中OPG的蛋白质表达水平提高约为未分化细胞的6倍。统计学分析，P〈0．01，差异有显著性。结论在人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中，骨保护素表达逐渐升高而骨保护素配体表达显著降低，两者比值的逐渐增大，从而发挥促进骨形成，抑制骨吸收的作用，这可能是协调骨重建周期有序进行的重要机制之一。     

生物复合材料体外诱导分化SD大鼠乳鼠骨髓间充质干细胞为成骨细胞分析

目的探讨生物复合材料HA-玻璃涂层/多孔ZrO2体外诱导分化SD大鼠乳鼠骨髓间充质干细胞为成骨细胞的能力,找到骨髓间充质干细胞理想的复合载体及移植后的安全性,为骨缺损的临床快速恢复治疗奠定基础。方法通过生物材料体外诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞,培养至14天、21天,经Gomori钙钴法染色、Von Kossa染色及Ⅰ型胶原免疫组化分析比较诱导前后其碱性磷酸酶、钙结节、Ⅰ型胶原的表达变化;流式细胞技术检测诱导前后细胞CD45、CD44及CD90的表达变化。结果 SD大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导14天,出现了三角形或不规则细胞,细胞之间界限清晰,碱性磷酸酶呈阳性表达;诱导至21天,细胞中出现致密圆形的矿化结节及Ⅰ型胶原呈阳性表达,细胞之间界限模糊;流式技术检测诱导前后细胞表面CD44仍为阳性表达,CD45仍为阴性表达,而CD90由原来的阳性表达转为阴性表达,细胞表达阳性率由99.7%下降为0.29%。结论该生物复合材料将骨髓间充质干细胞成功诱导为成骨细胞,且该材料又能与骨形成很强的化学结合,用作骨缺损的填充材料,为新骨的形成提供支架,发挥骨传导作用。     

骨髓基质细胞转化为神经细胞的研究

目的 探讨骨髓基质细胞体外转化为神经细胞的可能性。方法 骨髓基质细胞原代培养、传代后使用3种不同方法诱导。行大体观察，免疫组织化学，及细胞电生理检查和长期培养研究。结果 骨髓基质细胞体外可诱导为突触明确的神经细胞。诱导率分别为80％、10％和40％；诱导后细胞表面有神经特异性抗原NSE、GFAP表达；同时具有早期神经细胞电流特性。结论 骨髓基质细胞可横向转化为早期神经细胞。     

大鼠雪旺细胞对两种来源的成骨细胞增殖分化影响的研究

目的 研究应用雪旺细胞(SCs)对两种来源的成骨细胞(OB)的增殖与分化的影响,为构建神经化组织工程骨提供体外实验理论依据.方法 通过采用股骨、胫骨髓腔冲洗法获得SD大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),采用胰蛋白酶消化新生鼠颅骨获得OB及采用消化后组织块法获得SCs.将BMSCs在成骨诱导液作用3周,鉴定BMSCs向OB分化.采用96孔共培养板将第2代SCs种植于上室,颅骨来源OB种植下室,共培养为实验组,无SCs干预共培养为对照组.将诱导分化的OB种植于下室,第2代SCs种植于上室,共培养为实验组,无SCs干预共培养为对照组,分别于共培养后1、3、5、7、9d采用甲基噻唑基四唑(MTT)进行增殖比较.采用6孔共培养板,实验组上室种植SCs,下室分别种植颅骨来源及BMSCs来源的OB,不加SCs的两种来源的OB作为对照组,分别共培养后于3、7 d检测两种来源OB的碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、骨形态发生蛋白-2 mRNA表达.结果 SCs对颅骨来源的OB在共培养3、5、7、9 d 4个时间点均有明显促增殖作用,在碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨形态发生蛋白-2mRNA在各个时间段均起到抑制作用.SCs对大鼠BMSCs来源的OB在共培养1、3 d无明显促增殖作用,在5、7、9 d有明显促增殖作用,在成骨培养基的环境里,SCs可促进BMSCs诱导的OB分化.结论 选择BMSCs来源的OB 与 SCs共培养更适合用于构建神经化组织工程骨.     

体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化

目的探讨体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化的实验方法。方法采用BME、b-FGF、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、PDGF依次联合诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,免疫细胞化学鉴定S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率。结果诱导后的猕猴骨髓基质干细胞具有类似雪旺细胞的形态,免疫细胞化学结果显示S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率分别为(66.8±4.6)%、(57.3±5.4)%和(72.4±5.9)%。结论采用BME、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、b-FGF、PDGF依次联合诱导,可使猕猴骨髓基质干细胞在体外向雪旺样细胞分化。     

无血清培养骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化条件的优化

目的：探索无血清培养的骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经细胞诱导分化条件的优化方案,为BMSCs应用于脊髓损伤的临床治疗创造条件.方法：用含2% Utroser G的UltraCULTURE无血清培养体系体外扩增人BMSCs,采用流式细胞仪检测培养细胞的表面标志,再以全反式维甲酸、β-巯基乙醇和神经生长因子为主要成分组成6种诱导液诱导BMSCs向神经细胞分化,镜下观察细胞形态学变化,用抗人β微管蛋白（β-Tubulin）抗体和抗人胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体进行免疫荧光染色鉴定诱导后的神经细胞,通过流式细胞仪检测诱导后细胞的凋亡率.结果：无血清培养的BMSCs在6种诱导条件下均可不同程度地分化为神经样细胞,镜下可见诱导后细胞表现为神经细胞形态特征,免疫荧光染色显示β-Tubulin和GFAP均有阳性表达,诱导后细胞发生不同程度的凋亡,其中全反式维甲酸和神经生长因子组成的复合诱导液的诱导效率较高,诱导后细胞凋亡率较低.结论：全反式维甲酸与神经生长因子联合应用可在体外高效、稳定地诱导无血清培养的BMSCs分化为神经样细胞,是较佳的诱导条件.