Real-time PCR分析锰对甘草β-AS基因表达的影响

目的探讨不同浓度的锰处理对甘草β-香树脂醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)基因表达量的影响。方法以一年生甘草移栽苗为试验材料,设置5个锰浓度水平,分别为0,1.81,18.1,36.2和54.3 mg/L,利用Real-time PCR(荧光实时定量PCR)方法对甘草β-AS基因的Ct值进行测定并计算其相对表达量。结果随着锰处理浓度的增加,甘草β-AS基因的相对表达量呈现先升高后下降的趋势,在18.1 mg/L浓度处理时达到最大值为12.43,分别是对照(0 mg/L),36.2 mg/L和54.3 mg/L处理的2.79,1.47,2.88倍,且差异极显著(P<0.01)。结论锰对甘草β-AS基因的表达具有一定的促进作用,适当质量浓度的锰处理能够显著提高甘草β-AS基因的相对表达量。     

不同处理对甘草种子发芽率和出苗率的影响

目的:探索甘草种子萌发和出苗最适宜的处理方式,为甘草育苗和大田播种提供技术依据。方法:通过对甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)种子进行不同处理,比较其发芽率和出苗率变化情况。结果:不同处理方法对甘草种子发芽率有显著性影响,其中机械研磨处理的甘草种子发芽率最高,其次为浓硫酸处理3 h的甘草种子;浓硫酸处理、机械研磨与高温浸种处理的出苗率显著高于对照的出苗率,其中随着浓硫酸处理时间的延长,甘草种子的出苗率呈明显增高而后又下降的趋势。结论:和其他处理相比,机械研磨和硫酸浸种3 h的处理发芽率和出苗率有明显提高,适宜于大面积种植甘草时进行种子处理。     

不同时期外源6-BA处理对甘草有效成分的影响研究

目的:研究外源细胞分裂素6-苄氨基嘌呤(6-BA)处理对甘草中主要药用成分的影响,探究甘草中各化学成分之间的调控网络。方法:以两年生甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.植株为试验材料,分别于甘草生长期的两个不同阶段6月、7月喷施4种不同浓度(15、25、50、100 mg/L)的6-BA,利用HPLC检测7种化学成分(甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、芹糖基甘草苷和芹糖基异甘草苷)的含量,分析外源刺激后甘草中7种成分含量的动态变化。结果:(1)6月份6-BA处理各组,7种成分含量的提高幅度最大值均远大于7月份处理组,其中,6月份100 mg/L的6-BA处理3个月后,其7种成分提高幅度分别比对照高出59.34%、71.14%、57.31%、16.36%、30.17%、80.26%、91.90%;(2)不同浓度处理组影响最大的成分为甘草酸;(3)6-BA处理有抵御自然生长条件下甘草中黄酮类含量降低的作用;(4)6-BA处理虽然对甘草中的化学成分含量有一定影响,但并不改变其化学成分间组成变化。结论:外源6-BA处理可以同时提高甘草中甘草酸含量以及黄酮类物质的积累。     

锰营养对甘草光合特性和抗氧化酶活性的影响

目的探讨不同浓度的锰营养水平对甘草光合特性和抗氧化酶活性的影响。方法以一年生甘草移栽苗为试验材料,采用盆栽蛭石的方法,每周向盆内浇灌不同浓度锰的营养液,锰处理水平分别为0 mg/L、1.81 mg/L、18.1 mg/L和36.2 mg/L,其中1.81 mg/L即正常Hoagland营养液中锰的浓度。采用LI-6400光合仪测定其光合生理指标,色素和抗氧化酶活性的测定则通过植物生理学常规方法进行。结果随着锰处理浓度的增加甘草叶片叶绿素和类胡萝卜素含量逐渐增加,18.1 mg/L处理时均达到最大值,与0 mg/L相比差异显著(P0.05)。在锰浓度18.1 mg/L处理时净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)达到最大值,而胞间CO2浓度(Ci)在1.81 mg/L处理时达到最大值。对抗氧化酶活性的分析结果表明,随着锰处理浓度的增加,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)三种抗氧化酶活性均显著增加。结论缺锰会抑制甘草的各项生理功能,适当浓度的锰处理能够显著提高甘草的光合指标和抗氧化酶活性。     

盐胁迫对甘草不同组分的影响

目的通过分析不同浓度盐胁迫下甘草酸积累量和总糖、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪及灰分量的变化以及它们的相关性,研究盐胁迫对甘草酸积累的影响。方法采用不同质量浓度(3、6、9 mg/mL)NaCl溶液处理一年生盆栽甘草,分别于35、70、105 d取样,测定甘草酸量,总糖、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪及灰分5种组分的量,分析盐胁迫对各组分比例关系的影响及甘草酸量与各组分量的相关性。结果盐胁迫70 d时,6、9 mg/mL盐溶液处理组的甘草酸量显著高于对照(CK);6、9 mg/mL处理组的粗蛋白显著高于CK,而9 mg/mL处理组的总糖显著低于CK。盐胁迫105 d时,9 mg/mL处理组的粗脂肪显著高于CK;盐胁迫70 d和105 d时,9 mg/mL处理组的粗脂肪比例显著高于CK,但总糖比例明显低于CK;盐胁迫70 d和105 d时,甘草酸量与粗脂肪、灰分量呈正相关,与总糖量呈负相关。结论甘草酸的积累与粗蛋白、总糖量、粗脂肪、灰分量的分配密切相关,适当的盐胁迫可以刺激甘草内的糖代谢,加速物质的分解,促进甘草的次生代谢,使甘草酸形成并积累。     

不同软化方法对甘草质量的影响

目的基于HPLC建立甘草指纹图谱及同时测定甘草中6个成分含量的分析方法,并考察4种软化方式(淋润、常压蒸润、70℃减压蒸润与85℃减压蒸润)对甘草质量的影响。方法采用紫外分光光度法,以甘草苷、甘草酸为对照品,测定甘草中总黄酮及总皂苷的含量;基于HPLC同时测定甘草中甘草苷、芒柄花苷、异甘草苷、甘草素、刺甘草查耳酮、甘草酸6个成分的含量,比较了不同软化方法处理后的甘草中指标成分含量的变化;利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对不同软化处理后的甘草样品进行相似度评价,并进行聚类分析。结果总黄酮、总皂苷的结果显示,未加工过的甘草中总黄酮与总皂苷的含量最高,淋润的甘草总黄酮与总皂苷含量偏低。常压蒸润、70℃减压蒸润和85℃减压蒸润这3种处理方法对甘草质量影响不大;含量测定结果显示,不同软化处理后,异甘草苷的含量均显著降低,而不同的软化处理组之间,所有成分含量差异不显著。指纹图谱相似性评价与聚类分析表明,3批甘草不同软化处理方法后的样品与未加工组分别聚为一类,而不同软化处理方法对于甘草整体化学成分组成无显著差异。结论建立的分析方法,能够快速、准确地同时测定甘草中的6种成分,而且尤其需要对软化过程中异甘草苷的含量进行监测。综合生产成本、生产效率及不同指标的质量评价结果,常压蒸润在生产过程中可行性最高。本研究为甘草软化的大生产提供了理论指导,有利于进一步规范甘草饮片的生产流程。     

黄独微型块茎诱导形成中SQS基因表达的qRT-PCR分析

目的对黄独微型块茎鲨烯合酶(SQS)基因的表达量进行分析,旨在为阐明黄独微型块茎不同诱导形成时期皂苷的合成机制提供理论依据。方法以Actin基因为内参基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析技术。通过对不同诱导形成时期的黄独微型块茎进行取样并提取RNA,反转录获得cDNA作模板,利用sybr GreenⅠ成功构建了目的基因SQS和Actin的扩增曲线和熔解曲线。结果定量结果表明,SQS基因在黄独微型块茎诱导形成的初期(第18~36天)。表达量显著增加:在黄独微型块茎诱导形成的中期(第36~72天)SQS基因的表达量显著下降,并趋于稳定;在黄独微型块茎诱导形成的后期(第72~90天)SQS基因的表达量再次显著下降。结论在黄独微型块茎诱导形成的过程中,SQS基因的表达量呈现出"低-高-低-不变-低"的变化趋势,推测SQS是黄独微型块茎诱导形成中皂苷生物合成的关键酶。     

甘草水提物中miRNA对人免疫细胞基因表达的影响

微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类在转录后水平调节基因表达的非编码小分子RNA,其调控基因表达、影响细胞活性的功能已为人们所重视。近年来miRNA的跨界调控成为新的研究方向,为人们更全面地认识和了解miRNA的功能提供了新的视角。植物miRNA由于通常经过了甲基化修饰,因此较为稳定,不易降解。前期研究表明,甘草干燥药材的水煎剂中存在着丰富的小分子RNA,这为了解甘草的作用机制提供了新的思路。在本研究中,利用从甘草水煎剂中提取的小分子RNA以及合成的miRNA模拟物(mimic)作用于分离自健康人的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),然后利用RT-PCR对其模式识别受体(PRR)基因以及部分转录因子、信号分子和细胞因子的基因表达变化进行了分析。结果表明甘草miRNA对人免疫细胞的基因表达具有明显的调节作用,能够显著抑制T细胞分化相关基因的表达,以及炎症和凋亡相关基因的表达。这为进一步更全面地了解甘草的作用机制以及中药新药的研制带来了新的思路。     

不同浓度甘草对小鼠胃肠运动的影响

目的：观察不同浓度甘草对正常小鼠小肠推进及胃排空的影响。方法：SPF级ICR小鼠60只,随机分为对照组和5个浓度甘草组,分别灌胃NaCl溶液和相应浓度的甘草颗粒剂溶液（均含苯酚红2mg/mL）,20min后处死小鼠,观察各组的小肠推进率和胃残留率。结果：甘草小剂量（5、10、15g/kg）对小鼠小肠推进和胃排空有一定程度的抑制作用,甘草大剂量（20、40g/kg）对小鼠小肠推进和胃排空有一定程度的促进作用,其中甘草5、10、40g/kg剂量组小肠推进率与对照组比较差异有统计学意义;甘草5、20、40g/kg剂量组胃残留率与对照组比较差异有统计学意义。结论：甘草对小鼠小肠推进和胃排空有双向调节的作用,在5~15g/kg剂量范围内表现为抑制作用,且随剂量的增大而作用减弱;在20~40g/kg剂量范围内表现为促进作用,且随剂量的增大而作用增强。     

甘草与附子不同比例配伍对甘草黄酮溶出过程的影响

目的观察甘草与附子不同比例配伍对甘草黄酮溶出过程的影响。方法以甘草苷为对照品,利用紫外可见分光光度法建立甘草黄酮的含量测定方法;甘草与附子不同比例配伍后分别在0、5、10、20、30、45、60、75、90 min测定甘草黄酮含量。结果甘草苷在2.20~11.00μg/m L(R=0.9994)之间呈良好的线性关系;甘草与附子不同比例各配伍组,随着时间变化甘草黄酮溶出增加,60 min后含量保持基本稳定,且在同一时间点甘草与附子配伍后合煎比甘草单煎甘草苷的含量降低,不同配伍比例后含量动态变化规律基本一致。结论甘草与附子不同比例配伍影响甘草黄酮的含量,煎煮时间影响黄酮溶出过程,即甘草黄酮的含量与配伍比例和煎煮时间密切相关,实验结果可为附子甘草配伍的进一步深入研究提供参考。     

实时荧光定量PCR检测健脾化瘀方对肝癌细胞ras/MAPK通路相关基因表达的影响

[目的]研究健脾化瘀方对人肝癌细胞ras/MAPK信号通路相关基因表达的影响。[方法]采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR Detecting System,qPCR),比较药物作用后目的、基因表达水平的变化。[结果]ras/MAPK信号传导通路上的七个基因均有所降低,其中sos1和raf1基因表达降低的较为明显,与对照组相比差别有统计学差异。[结论]健脾化瘀方能抑制ras/MAPK信号通路上主要基因的表达,从而起到抑制肝癌细胞的生长,诱导细胞的凋亡。     

甘草 HMGR, SQS1, β-AS 合酶基因 CNVs 检测体系的建立

目的:建立可用于甘草HMGR,SQS1,β-AS合酶基因CNVs测定的稳定可靠的检测体系。方法:利用Real timePCR方法对甘草HMGR,SQS1,β-AS合酶基因CNVs进行测定。结果:在HMGR,SQS1,β-AS合酶基因以及内标基因lectin的定量检测实验中,其定量反应的Ct值分别在25.82～25.88,29.01～29.08,15.52～15.56,19.06～19.08变化,SD分别是0.033,0.032,0.024,0.011,其CV分别是0.12%,0.22%,0.16%,0.06%。结论:所建立的Real time PCR体系重复性好,检测系统工作稳定可靠,可用于甘草HMGR,SQS1,β-AS基因的CNVs筛选。     

麻黄汤不同配伍对苦杏仁和甘草有效成分的影响

目的:评价麻黄汤不同配伍对苦杏仁和甘草有效成分的影响。方法:制备苦杏仁苷对照品溶液和甘草酸单铵盐对照品溶液和不同配伍方式的麻黄汤水煎液供试品溶液,以正交设计8中不同配伍的麻黄汤组方,苦杏仁有效成分研究中以A-H进行标识;甘草有效成分研究中以A1-H1对8中不同配伍方式进行标实。最终结果根据国家药典委员会提出的中药指纹图谱相似度评价系统2004A进行相似度分析,采用MATLAB软件进行数据处理和统计。结果:苦杏仁和甘草色谱条件能够分别将苦杏仁苷和甘草酸清晰的分离出来,无其他杂质峰,基线稳定,具有可比性。麻黄汤不同配伍方式中对苦杏仁有效成分苦杏仁苷每剂含量未见明显差异,进行方差分析后结果显示,麻黄汤不同配伍中麻黄、桂枝、甘草对苦杏仁苷的影响差异无统计学意义(P0.05)。麻黄汤不同配伍方式中以H1单纯甘草中甘草酸含量为最高,而麻黄汤全方A1中的甘草酸含量为最低;不同配伍中麻黄、桂枝和苦杏仁均降低麻黄汤中甘草酸的含量(P0.05)。结论:麻黄汤不同配伍中麻黄、桂枝、甘草对苦杏仁中有效成分苦杏仁苷未见明显影响;而不同配伍中麻黄、桂枝和苦杏仁均降低麻黄汤中甘草有效成分甘草酸的含量。     

不同方法蜜炙甘草对甘草质量的影响研究

目的考察不同方法蜜炙甘草对甘草质量的影响。方法以重量法测定甘草不同炮制品中甘草酸含量,依照《中国药典》2005年版炙甘草质量标准测定水分、总灰分和酸不溶性灰分。结果与传统炮制法比较,远红外干燥法炙品甘草酸的含量增加最明显,恒温干燥法炙品次之,微波干燥法炙品增加不明显;水分差异显著,外观性状评价优于传统炙品,质量稳定性好,而总灰分和酸不溶性灰分均符合《中国药典》规定。结论3种新法蜜炙甘草均便于操作,温度和时间可控,炮制品外观性状和内部质量较传统法好,且质量稳定性好,利于贮存,但从炮制品甘草酸含量的角度看,远红外干燥法最好,恒温干燥法次之,微波干燥法稍逊。     

甘草Ri质粒转化及不同理化因子对甘草毛状根生长的影响

目的:研究甘草毛状根的诱导及外界因子对其生长的影响。方法:用发根农杆菌Agrobacterium rhizo-genesLBA9402和R1601感染甘草Glycyrrhiza uralensis外植体。结果:2种发根农杆菌均能诱导甘草产生毛状根,LBA9402比R1601表现出较强的对甘草的感染能力,下胚轴的转化率高于子叶。在WP培养基上毛状根生长最快。光照对毛状根生长有抑制作用。毛状根中5种黄酮类化合物的总量比愈伤组织中高1.5倍,其中甘草查耳酮含量是愈伤组织中的15.5倍。结论:本实验所建立的甘草毛状根培养系统,为研究甘草毛状根大量培养生产黄酮类化合物奠定了基础。     

甘草苷的荧光光谱研究

首次建立了测定甘草苷的荧光方法.选择了最佳激发和荧光发射波长,考察了乙醇浓度、温度、放置时间、pH值和共存离子对测定的影响.甘草苷的荧光光谱具有良好的稳定性.在最佳实验条件下,其荧光强度与浓度分别在0.04～8.37 μg· ml-1范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998 9,检测下限为0.017 μg· ml-1.     

短日照处理对野菊CO基因表达量的影响

该实验研究了野菊光周期途径关键基因CO的表达模式,采用RT-PCR法克隆得到野菊CO基因的CDS序列,其开放阅读框长1 380 bp,编码459个氨基酸。生物信息学分析表明,野菊CO与甘菊、黄花蒿同源性较高,表现为CO在同科内较为保守。预测得到该蛋白的相对分子质量约为52. 04 k Da,理论等电点为4. 81,α螺旋占17. 65%,随机卷曲占76. 69%,延伸链占5. 66%,无β折叠,无信号肽。实验结果显示短日照处理可以提高野菊CO基因的表达量并诱导其开花; qRT-PCR结果显示CO基因在野菊不同组织及不同处理时期相对表达量差异显著。该文通过研究短日照处理对野菊光周期途径开花关键基因CO表达量的影响,为光周期调控野菊花期、采收期提供研究基础。     

不同蜜炙方法对甘草中甘草酸含量的影响

中药甘草生用具有补脾益气 ,清热解毒 ,祛痰止咳 ,缓急止痛 ,调和诸药的作用 ;蜜炙后增强补脾和胃益气的功效。传统的蜜炙方法为手工操作 ,我院用河南省周口制药机械厂生产的 CY- 4型炒药机蜜炙中药饮片。甘草酸的含量测定方法有重量法、比重法、薄层扫描法、气相色谱法等[1] ,本文采用《中国药典》所载的重量法测定了生甘草、用传统蜜炙法及机器蜜炙法蜜炙的甘草中甘草酸的含量 ,根据其测定结果 ,对机器蜜炙法的意义进行了讨论。1　实验材料与样品炮制1 .1　实验药材甘草原药材 ,购于安阳市药材站 ,经本院质检室鉴定为内蒙产豆科植物甘草 …     

基于R语言的近红外光谱对甘草中指标成分定量分析

目的:建立较优的甘草质控成分(水分、总灰分、甘草苷、甘草酸)的近红外定量模型,实现快速检测。方法:基于2015年版《中国药典》方法测定97批甘草中水分、总灰分、甘草苷及甘草酸的含量。采用近红外光谱仪扫描其近红外光谱。采用R语言筛选最佳光谱预处理方法,建立近红外定量模型。结果:水分和甘草苷近红外定量模型的最佳预处理方法为一阶导数,其中水分测试集和验证集的相关系数分别为0.930 0和0.929 9,均方根误差分别为0.243 2和0.203 8,甘草苷测试集和验证集的相关系数分别为0.930 3和0.907 6,均方根误差分别为0.093 9和0.128 9;总灰分近红外定量模型的最佳预处理方法为MSC,测试集和验证集的相关系数分别为0.926 5和0.917 7,预测均方根误差分别为0.109 6和0.103 7;甘草酸近红外定量模型的最佳预处理方法为SNV,测试集和验证集的相关系数分别为0.918 1和0.915 7,预测均方根误差分别为0.274 8和0.236 0。结论:该研究建立了较优的甘草质控成分的近红外定量模型,其模型的准确度均较高,为实现快速检测奠定了基础。