Dnd1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建小鼠Dnd1基因的RNAi慢病毒载体.方法:针对小鼠Dnd1基因RNAi设计有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA.退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的舍Dnd1...     

人ODC基因第三外显子反义RNA腺病毒载体的构建

目的：构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因第三外显子反义RNA的腺病毒载体。方法：RT-PCR方法克隆出人ODC基因第三外显子的片段，插入pMDl8-T载体中，经SalⅠ、BglⅡ酶切，插入穿梭质粒pAd-Track-CMV形成重组质粒pAdTrack-CMV-ODCr。经Pme Ⅰ酶切线性化后，转入pAdesy-1细菌中与含腺病毒基因骨架的质粒pAdesy-1同源重组。将重组质粒pAdesy-ODCr经Pac I酶切后，转染293细胞包装成腺病毒颗粒，经荧光显微镜和PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果：用RT-PCR方法从人前列腺癌组织中扩增出120bp的cDNA片段，经测序证实为ODC基因第三外显子的片段。重组质粒pAdTrack-CMV-ODC。转入pAdesy-l细菌中获得多个阳性克隆。重组质粒pAdesy-ODC。转染293细胞进行包装，经荧光显微镜观察可见其在293细胞中表达。进一步通过PCR法证实其含有目的基因。结论：成功地构建了ODC基因第三外显子反义RNA重组腺病毒载体，为研究其抗肿瘤的作用奠定了基础。     

Smad3基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建Smad3基因RNAi慢病毒载体.方法 针对已经筛选确定的Smad3基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I和EcoR I双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSmad3慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用GC-shSmad3、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,构建出了Smad3 shRNA的慢病毒载体GC-shSmad3.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为3×103TU/ml.结论 成功构建Smad3基因RNAi慢病毒载体.     

PAK4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建PAK4基因RNAi慢病毒载体,并对其在涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83细胞中干扰效率进行鉴定。方法：针对PAK4基因RNAi有效靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ 酶切后的pGCsil-GFP载体连接产生shPAK4i-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用shPAK4i-LV载体、pHelper1.0载体和pHelper 2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度。 结果：PCR扩增出插入片段,测序证实成功构建了PAK4-shRNA慢病毒载体shPAK4i-LV。包装并浓缩慢病毒,滴度为2E+9 TU•mL^-1。将病毒感染SACC-83细胞,real-time PCR检测PAK4的mRNA表达下调70%以上。结论：成功构建了shPAK4i-LV病毒载体并建立了SACC-83-shPAK4i细胞模型,为PAK4在肿瘤信号转导通路中的研究提供工作基础。     

FGL2基因RNAi慢病毒载体的构建及外源性筛选与鉴定

目的拟构建人纤维蛋白原样蛋白2(FGL2)凝血酶原酶基因RNA干扰慢病毒载体,为调控人FGL2凝血酶原酶表达水平提供有利的工具。方法根据人FGL2凝血酶原酶基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生FGL2慢病毒载体,采用PCR及测序鉴定,应用Western blot技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列。用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以系列稀释法测定病毒滴度。结果 PCR扩增和测序结果显示,人FGL2凝血酶原酶核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定一条干扰效率高的有效靶序列。利用筛选确定的有效靶序列,包装产生慢病毒,其浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/ml。结论证实实验成功构建了FGL2基因RNA干扰慢病毒载体。     

Smad4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建Smad4基因RNAi慢病毒载体. 方法:针对已经筛选确定的Smad4基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Mlu I和Cla I酶切后的pLVTHM载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shSmad4慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定. 用LV-shSmad4,pCMV-dR8.74和pMD2G 3质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度. 结果:PCR和测序证实,成功构建Smad4 shRNA的慢病毒载体LV-shSmad4. 包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为5×1010 pfu/L. 结论:成功构建人Smad4基因RNAi慢病毒载体.     

KIR2DS2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA(short hairin RNA,shRNA)的RNAi慢病毒载体.方法针对已经筛选确定的KIR2DS2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shKIR2DS2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shKIR2DS2及Packaging system质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果PCR和测序证实,成功构建KIR2DS2shRNA的慢病毒载体LV-shKIR2DS2.293T细胞测定病毒滴度为6×108TU/ml.结论成功构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA的RNAi慢病毒载体.     

CRBP-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠视黄醇结合蛋白-1(cellular retinol-binding protein-I,CRBP-1)基因RNAi(RNA interfer-ence,RNAi)慢病毒载体。方法:针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的含CRBP-1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论:成功构建大鼠CRBP-1基因RNAi慢病毒载体。     

MMP-9基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体。方法针对小鼠MMP-9基因序列,利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列,并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,用插入鉴定引物进行PCR鉴定阳性克隆并测序,应用Western blot在293T细胞中鉴定MMP-9表达的下调作用。结果PCR鉴定和DNA测序结果显示合成的含MMP-9 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确;构建的MMP-9RNAi慢病毒载体能够抑制MMP-9的表达。结论应用基因工程技术,成功构建了小鼠MMP-9基因RNAi慢病毒载体,为应用于在体基因治疗创造了条件。     

PINCH-1基因RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建人PINCH-1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并转染人骨髓基质细胞初鉴定转染效果.方法 利用RNAi设计软件,设计合成针对人PINCH-1基因的特异性siRNA序列,利用酶切反应合成包含特异性shRNA序列的pGCSIL-GFP慢病毒载体GC-shBC047440,通过GC-shBC047440与pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定.获取的病毒上清筛选最适感染复数(MOI值),并感染骨髓基质细胞,RT-PCR和Western blot检测重组慢病毒对骨髓基质细胞PINCH-1蛋白和RNA表达的影响.结果 酶切鉴定证实成功构建针对人PINCH-1基因的RNAi慢病毒干扰载体GC-shBC047440,载体感染人骨髓基质细胞后PINCH-1 RNA表达较未感染组和空载体对照组显著下降.结论 成功构建针对人PINCH-1基因的RNAi慢病毒载体,该载体能有效沉默PINCH-1基因的表达.     

人支架蛋白IQGAP1-shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的 制备携带人支架蛋白IQGAP1基因小分子干扰RNA的重组慢病毒.方法 分别设计合成针对IQGAP1的4个shRNA慢病毒干扰载体;分别转染293T细胞,利用Western blot验证shRNA的沉默效果,选择其中一个沉默效果较好的shRNA慢病毒干扰载体同源重组产生Lentivirus- IQGAP1-shRNA并测定病毒滴度.结果 测序证实,构建携带IQGAP1-shRNA的慢病毒载体具有较好的沉默靶基因的效果,包装慢病毒,病毒滴度为2.0×l010TU/ml.结论 成功制备携带IQGAP1-shRNA的重组慢病毒载体并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒.     

人GLUT3基因RNA干扰病毒载体的构建与鉴定

目的：筛选出人GLUT3基因有效的RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列,并构建出慢病毒RNAi载体。方法：根据GLUT3基因mRNA序列设计合成siRNA片段4个,分别定向克隆至pLV-shRNA载体上,并将构建的质粒转染HeLa细胞,运用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测GLUT3mRNA的表达量验证其干扰效果。筛选出其中有效的质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒,测定病毒颗粒滴度后,将病毒感染U251胶质瘤细胞以测定感染慢病毒干扰载体后胶质瘤细胞内GLUT3的表达情况。结果：重组RNAi质粒pLV-shRNA-GLUT3-1,pLV-shRNA-GLUT3-2,pLV-shRNA-GLUT3-3,pLV-shRNA- GLUT3-4经测序证实质粒载体构建成功;4个干扰质粒在HeLa细胞中均可以明显抑制GLUT3-mRNA的表达。pLV-shRNA-GLUT3可以在293T细胞中成功包装。收集293T细胞分泌的病毒上清浓缩后测定病毒颗粒LV-GLUT3滴度为1.5×109 TU/mL。与感染阴性对照慢病毒颗粒(0.3641±0.044)相比,胶质瘤U251细胞感染慢病毒颗粒LV- GLUT3后,GLUT3蛋白相对表达明显降低(0.108±0.016,t=16.267,P<0.001)。结论：成功构建了人GLUT3基因有效的慢病毒RNAi载体,为进一步研究GLUT3的生物学功能奠定了基础。     

慢病毒携带人Galectin-3基因RNAi的有效靶点筛选

目的 构建携带人Galectin-3基因的RNAi慢病毒载体,测定感染滴度,并对不同靶点进行有效筛选.方法 根据Galectin-3基因设计4对,经退火制备的双链DNA oligo,连接经双酶切的线性化pGCL-GFP/U6载体,转化后经PCR鉴定,阳性克隆测序,质粒抽提,经CaCl2导入293T细胞,包装成慢病毒,收集病毒上清并检测其滴度.将含Galectin-3基因的RNAi病毒颗粒,感染靶细胞,荧光显微镜观察细胞荧光,感染率>50%时,收集细胞抽提RNA,RT-PCR检测Galectin-3 mRNA水平,评价干扰效果.结果 经测序、PCR分析证实目的 序列成功连接到载体上,载体构建成功,包装成高滴度慢病毒.感染MCF-7细胞系后,细胞荧光显示感染率>50%,定量RT-PCR检测结果发现:1#和3#靶点敲减Galectin-3基因效率达95%、85%.结论 成功构建并筛选了携带有人Galectin-3基因的RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步研究Galectin-3在肿瘤细胞中的作用提供实验平台.     

人鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶双反义腺病毒载体的构建

目的：构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)第三外显子和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)翻译起始位点双反义RNA腺病毒载体。方法：应用RT-PCR方法扩增出SAMDC mRNA翻译起始位点区205 bp的基因片断。插入PMD-18T载体中．经XbaI、XhoI酶切回收,反向插入穿梭质粒pAdTrack-CMV-ODCr,形成重组质粒pAdTrack-ODC-SAMDCr。经PmeI酶切线性化后,转入Adeasy-1细菌与pAdeasy-1质粒发生同源重组。挑选阳性重组质粒pAdeasy-ODC-SAMDCr,经PacI酶切后,转染293细胞,包装出腺病毒颗粒．经荧光显微镜和PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果：利用RT-PCR方法成功地从大肠癌细胞扩增出205bp的cDNA片断,经测序证实为SAMDC翻译起始位点序列。测序证实,重组质粒pAdTrack-ODC-SAMDCr两个基因插入方向和序列均正确．转入Adeasy-1细菌获得多个阳性重组克隆。pAdeasy-ODC-SAMDCr转染293细胞进行包装扩增．可见明显病毒空斑形成,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在293细胞中表达．PCR法证实含有目的基因。结论：成功构建并扩增出ODC和SAMDC双反义RNA腺病毒载体．为以后肿瘤的基因治疗和预防研究提供了必要工具。     

人组织因子基因RNA干扰载体的构建与鉴定

目的 构建人组织因子基因RNA干扰载体,为达到阻止凝血过程的启动打下基础.方法 利用Invitrogen公司在线软件设计人组织因子基因(NM 001993)干扰片段,合成shRNA序列,再制备双链寡核苷酸(ds oligo),退火后形成的ds oligo双链克隆到pENTRTM/U6载体的粘性末端,连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒DNA小提、测序.将构建的载体转染到脐静脉内皮细胞,应用RT-PCR和免疫荧光验证载体对目的基因的干扰情况.结果 测序证实阳性克隆为pENTRTM/U6-TF-shRNA,转染到脐静脉内皮细胞后组织因子的表达受到明显抑制.结论 成功构建出凝血途径的人组织因子基因RNA干扰载体,为研究组织因子基因RNA干扰载体在凝血疾病中的应用提供了稳定的转染细胞载体.     

小鼠Mmp-9 shRNA重组慢病毒包装、筛选及干扰效果检测

目的:设计、筛选、构建并鉴定Mmp-9小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),并构建其慢病毒表达载体,为血管化疾病的防治提供理论依据及实验室数据。方法:针对基质金属蛋白酶9靶基因设计siRNA序列,并合成小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)结构的DNA,与经AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,构建成携带Mmp9-shRNA慢病毒质粒载体(pSIL-RFP/MMP9-shRNA),PCR及测序鉴定后,Western blot筛选出携带最佳siRNA的慢病毒质粒载体,并利用慢病毒包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)将其制备成MMP9-shRNA慢病毒,并测定病毒滴度为1×1010pfu/l。结果:PCR和DNA测序证实合成的含基质金属蛋白酶9短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pSIL-RFP载体,表明实验成功构建基质金属蛋白酶9RNA干扰慢病毒表达载体。结论:成功的构建并筛选出针对小鼠Mmp9基因沉默的特异性shRNA重组慢病毒,为血管化性疾病的防治研究提供基础。     

脑胶质瘤中鸟氨酸脱羧酶的基因表达及其临床意义

目的:研究鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)在脑胶质瘤中的基因表达,以了解脑胶质瘤中多胺代谢及ODCmRNA表达的临床意义。方法:采用RT-PCR检测30例脑胶质瘤及其邻近正常脑组织手术标本中的ODCmRNA表达情况,采用配对样本t检验及Spearman等级相关分析对实验结果进行统计学处理。结果:脑胶质瘤组织ODCmRNA扫描值较正常脑组织明显升高(P<0.0001)。肿瘤组织ODCmRNA表达与肿瘤分级之间无显著相关性(P>0.05)。结论:ODC基因表达增强在脑胶质瘤的发生、发展中起重要作用。     

大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠PEDF 基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响.方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定.针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi 病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi 有效靶序列.有效RNAi 病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后, 收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度.结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功.Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达.PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinf1-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×1012Tu/L.结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础.