可表达EB病毒核抗原的鼻咽癌/淋巴瘤细胞杂交株

EB病毒作为鼻咽癌的病原因子之一,有充分的血清流行病学证据,在鼻咽癌组织中亦可检出EB病毒DNA和EB病毒核抗原(EBNA),但在以往从鼻咽癌组织建立的传代细胞系内未检出任何EB病毒标记。我们用细胞融合方法,建立了低分化鼻咽癌上皮细胞/淋巴瘤细胞的杂交株,能表达EBNA,对探讨EB病毒引起上皮细胞恶变的机制有一定意义。现简要报道如下: 一、材料和方法用作细胞融合的两个亲代细胞株分别为:(1)低分化鼻咽癌上皮细胞株CNE_2的     

核转录因子KLF4在肾脏缺血再灌注损伤中的表达与保护机制探讨

目的 研究核转录因子KLF4在肾脏缺血再灌注损伤中的表达,并对其保护作用的可能机制进行探讨.方法 Realtime-RT-PCR方法检测大鼠双肾在缺血1h,再灌注后不同时间点的KLF4表达情况,Western Blot方法检测KLF4在过氧化氢(H2O2)刺激的人胚肾细胞HEK293中的表达情况,采用基因转染技术过表达KLF4或抑制HEK293细胞中KLF4表达,观察KLF4的表达改变对H2O2损伤引起HEK293细胞死亡率的影响.结果 KLF4在大鼠肾脏缺血-再灌注时表达显著增高,在遭受H2O2损伤时,人胚肾细胞HEK293中KLF4的mRNA与蛋白表达也显著增高.过表达KLF4基因则能显著降低H2O2所致的HEK293细胞株的死亡率.抑制KLF4的表达能明显增加H2O2导致的HEK293肾细胞的死亡率.结论 KLF4极有可能是一个在肾脏缺血再灌注损伤过程中具有保护作用的核转录因子.     

ZNF580与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HEK293细胞的表达和定位

[目的]构建人ZNF580与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白真核表达载体,转染细胞进行瞬时表达,分析ZNF580-EGFP融合蛋白在人胚肾HEK293细胞中的表达和亚细胞定位。[方法]利用PCR技术扩增ZNF580基因cDNA开放阅读框架全编码区（编码1-172位氨基酸）、N端编码区（编码1-93位氨基酸）、C端编码区（编码94-172位氨基酸）,分别克隆到真核表达载体pEGFP-C1,BglΠ及HindШ双酶切筛选鉴定并测序。荧光显微镜下观察ZNF580-EGFP在HEK293细胞中的表达及亚细胞定位。[结果]pEGFP-ZNF580（1-172）、pEGFP-ZNF580（94-172）表达的ZNF580-EGFP融合蛋白聚集于HEK293细胞核。[结论]ZNF580蛋白的核定位信号位于其C端C2H2型锌指主构域（94-172位氨基酸区间）。     

比格犬ERβ_(1293)基因真核载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达和定位

目的观察比格犬Myc标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位。方法以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长。Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术(Western blotting)和间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence,IF)鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况。结果成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中。Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质。结论前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的基因编码蛋白定位在细胞中发生变化。     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.     

Epstein-Barr病毒RPMS1基因的克隆及其编码区序列分析

目的：克隆Epstein—Barr(EB)病毒的RPMS1基因，并分析其编码区序列的变异情况。方法：从7例高发区鼻咽癌组织中分别提取总RNA，以RT—PCR扩增出RPMS1基因编码序列，克隆入pGEM—T载体，构建重组质粒pGEM—T／RPMS1，重组质粒经PCR、BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，并进行序列测序。结果：成功克隆了高发区鼻咽癌的RPMS1基因，该基因编码序列第151nt发生G→A替换，导致相应第51位氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰氨。该变异位于DNA第Ⅴ外显子的155849nt，变异频率为6／7。结论：高发区鼻咽癌EB病毒RPMS1基因的编码序列存在变异；RPMS1基因可能参与高发区鼻咽癌的发生。     

SOX9慢病毒表达载体的构建及其在LNcap细胞中的稳定表达

目的 构建SOX9基因慢病毒表达载体, 建立稳定表达SOX9的LNCa P细胞株.方法 PCR扩增SOX9基因, 将其克隆到慢病毒表达载体p LVX-IRES-Puro中, 双酶切和测序鉴定重组质粒.用HEK293细胞包装重组病毒颗粒并感染LNcap细胞, 经puromycin筛选获得稳定转染细胞株.q RT-PCR和Western Blot分别检测SOX9 m RNA水平及蛋白表达.结果 经双酶切和测序鉴定证实目的片段已插入到慢病毒表达载体上.重组质粒转入LNCa P细胞后经puromycin抗性筛获得稳定表达的细胞株, q RT-PCR检测到SOX9基因在转录水平的表达, Western blot分析显示SOX9蛋白高表达.结论 慢病毒表达载体p LVX-IRES-FLAG-SOX9构建成功, 实现了SOX9在LNcap细胞中的外源性表达.     

过表达TrxR1重组HEK293细胞株的构建和鉴定

目的 构建稳定过表达硫氧还蛋白还原酶1（TrxR1）的HEK293细胞株,为TrxR1的功能研究以及靶向TrxR1药物筛选提供细胞模型。方法 通过PCR扩增,连接转化以及Sanger双脱氧测序构建并筛选出TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-PuroTXNRD1,转染HEK293细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞株。后续研究分为3组进行：①TrxR1过表达HEK293细胞：pLVX-Puro-TXNRD1载体稳定转染细胞;②对照HEK293细胞：pLVX-Puro空载病毒载体稳定转染细胞;③正常HEK293细胞;通过RT-qPCR、Western blot实验检测上述3组细胞中TrxR1的mRNA以及蛋白表达情况;通过胰岛素终点法以及TRFS-green探针成像检测上述3种细胞内TrxR1的酶活力;通过CCK8实验检测上述3种细胞对TrxR1特异性抑制剂auranofin的敏感性。结果 构建载体经DNA测序,成功获得插入TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-Puro-TXNRD1。与HEK293以及HEK293-NC细胞相比,HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1的mRNA和蛋白高表达,且酶活力也同样显著上升（P<0.005）;而与HEK293以及HEK293-NC细胞相比,auranofin对HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1酶活力以及细胞增殖的抑制效率均显著下降（P<0.005）。结论 通过构建pLVX-Puro-TXNRD1慢病毒载体,成功获得过表达TrxR1酶的HEK293细胞株,该细胞对特异性靶向TrxR1的抑制剂的抗增殖作用具有抵抗,因而可用于靶向TrxR1药物的筛选。     

比格犬ERβ1293 基因真核载体构建及在293T细胞中的表达及定位

【摘要】目的：观察比格犬Myc 标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位。方法：以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长。Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术（Western Blotting）和间接免疫荧光技术（Indirect immunofluorescence,IF）鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况。结果：成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中。Western Blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质。结论：前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的基因编码蛋白定位在细胞中发生变化。     

Sedlin蛋白稳定表达细胞株的建立

目的建立稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,研究Sed-lin蛋白在细胞内的分布。方法扩增SEDL基因全长编码序列,经双酶切后克隆至真核表达载体pCDGFP中,将重组表达质粒转染至HEK293细胞,用G418筛选阳性克隆,荧光显微镜和Western blot检测Sedlin蛋白的表达,并观察Sedlin蛋白在HEK293细胞中的分布。结果经测序鉴定,成功构建了SEDL基因的真核表达载体,转染HEK293细胞后,Western blot检测,证明SEDL基因能够稳定有效的表达,荧光观察显示,Sedlin蛋白在细胞核和细胞质中都有表达。结论成功建立了稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,Sedlin蛋白广泛分布于整个细胞中。     

人生发中心激酶基因克隆及其转基因细胞的构建

目的克隆人生发中心激酶（GCK）基因,并构建含有该目的基因的pIRES2-EGFP重组质粒载体,获得稳定表达GCK分子的基因转染细胞。方法采用RT-PCR法从pCMV5-GCK质粒载体上克隆GCK基因,通过双酶切（BglⅡ,SalI）装入pIRES2-EGFP质粒载体中,脂质体法共转染HEK293细胞,24 h后加入G418进行筛选,挑选出能稳定表达GCK蛋白的HEK293细胞株。结果构建了用于表达的含GCK基因的pIRES2-EGFP质粒载体,继而经RT-PCR、Western blot检测筛选出稳定表达人GCK蛋白的HEK293转基因细胞。结论构建了含人GCK基因重组pIRES2-EGFP质粒载体和稳定表达人GCK蛋白的细胞株,为该基因功能的后续研究奠定了基础。     

人血管内皮细胞生长因子165重组腺病毒的构建及其在真核细胞中的表达

目的:体外构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的腺病毒表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:从重组质粒pcDNA3/hVEGF165中获得hVEGF165,经酶切及测序鉴定,将hVEGF165基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,重组穿梭质粒经酶切线性化后,与pAEdasyl质粒在大肠杆菌BSJ183中进行同源重组,线性化后转染HEK293细胞进行包装扩增获取重组病毒上清,同时应用RT-PCR及ELISA法检测hVEGF165的表达。结果:目的基因的测序结果与人VEGF165序列(Genbank)相符。转染后经RT-PCR和ELISA检测证实转染重组质粒组hVEGF165 mRNA及蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到hVEGF165的表达。结论:本研究构建了人VEGF165重组腺病毒表达载体pAd-hVEGF165,并能成功地在HEK293细胞中表达。     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达

目的构建含人Ⅰ型1-磷酸鞘氨醇受体(SIPI)-全长cDNA序列及HA和/或EGFP标签的真核表达载体,并观察其在HEK293细胞上的表达。方法合成2条HA寡核苷酸,克隆入S1P1-Myc-EGFP-N1载体。以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,用PCR的方法扩增HA-S1P1并克隆入pcDNA3.1(+)载体。限制性酶切消化、PCR、测序的方法鉴定,载体经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测S1P1在HEK293细胞上的表达。结果限制性酶切消化、PCR、测序结果证实载体构建成功。S1P1表达在HEK293稳定细胞株的表面。结论成功构建带有HA和/或EGFP标签的S1P1真核表达载体,表面表达S1P1的HEK293稳定细胞株可作为我们进一步研究的细胞模型。     

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.     

SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的：构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白（SIRPα-GFP）真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法：将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论：成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。     

大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对其功能进行初步研究.方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD_4处理后细胞内钙变化.结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD_4可诱导细胞内钙的增加.结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础.     

人CTGF和TIMP1基因重组腺相关病毒双表达质粒的构建及其活性检测

 目的 构建人结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）和基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1, TIMP1)基因腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）表达质粒，并观察其在HEK293细胞中的表达，检测目的蛋白的生物学活性。方法 采用PCR技术，分别设计引物扩增所需序列并进行PCR鉴定。再采用分子克隆的方法，以内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites, IRES)序列连接CTGF和TIMP1并克隆到AAV表达质粒pSNAV2.0构建重组质粒pSNAV2-CTGF-IRES-TIMP1。把重组质粒转染HEK293细胞，用双重免疫荧光和Western blot的方法对重组质粒的表达进行研究，MTT法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性，ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP1蛋白的含量。结果 PCR、酶切、DNA测序等方法均证实成功构建了含有完全正确的CTGF和TIMP1基因序列的AAV表达质粒。双重免疫荧光和Western blot检测到目的蛋白的表达，转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性，ELISA法结果证实重组载体能够高表达TIMP1蛋白。结论 成功构建了双表达质粒pSNAV2-CTGF-IRES-TIMP1，转染 HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的目的蛋白，为基因治疗椎间盘退变的研究工作奠定了基础。     

GST pulldown技术检测HEK293T细胞Daam1的活性

目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中Daam1活性检测的可靠方法?方法:构建GST-RhoA的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21菌株中大量表达?用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Daam1及Daam1蛋白的表达?结果:在成功构建了GST-RhoA的原核表达载体,并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RhoA后,用GST pulldown和Western blot技术证实HEK293T细胞中有活化的Daam1和Daam1总蛋白的表达?结论:本工作所建立的GST pulldown技术可以检测HEK293T细胞中Daam1的活性,从而为进一步深入研究Daam1在真核细胞中的功能提供了技术保障?     

鸡源鹦鹉热衣原体MOMP基因重组腺病毒的稳定性及SPF雏鸡免疫试验

目的:检测重组腺病毒质粒在HEK293细胞中的稳定性;重组腺病毒是否与减蛋综合征阳性血清发生中和反应,以及用重组腺病毒免疫SPF小鸡是否产生保护.方法:将重组腺病毒质粒在HEK293细胞中连续传代,并用PCR法检测目的基因;用减蛋综合征阳性血清在体外中和重组腺病毒,接种HEK293细胞;用重组腺病毒免疫SPF小鸡,然后用CpL菌株攻击.结果:重组腺病毒质粒在HEK293细胞中连续传代后,仍然用PCR检测能检测出目的基因;重组腺病毒与减蛋综合征阳性血清之间无交叉反应;用重组腺病毒免疫SPF鸡,用CpL菌株攻击,90%的小鸡获得了保护.结论:重组腺病毒质粒在HEK293细胞中能稳定传代;重组腺病毒不受减蛋综合征阳性血清的影响;用重组腺病毒免疫SPF小鸡,能够获得保护.