Ezrin对人舌鳞癌顺铂耐药细胞上皮-间质转化的影响

目的：探讨Ezrin蛋白下调是否能影响人舌鳞癌顺铂耐药细胞CAL27/CDDP发生上皮—间质转化（epithelial?to?mesenchymal transition ,EMT）。方法以人舌鳞癌细胞株CAL27（亲本细胞）及其顺铂耐药细胞株CAL27/CDDP（耐药细胞）为研究对象,MTT检测CAL27及CAL27/CDDP的半数抑制率（half maximal inhibitory concentration ,IC50）,光学显微镜下观察细胞形态学变化;蛋白印迹检测上皮间质相关标记蛋白Vimentin、E?cadherin的表达变化和Ezrin的表达水平,Transwell检测细胞的迁移能力。通过小干扰RNA（Ezrin?Si1、Ezrin?Si2）转染CAL27/CDDP,检测Ezrin、Vimentin与E?cadherin蛋白表达及细胞迁移能力的变化。结果人舌鳞癌顺铂耐药细胞CAL27/CDDP较亲本细胞CAL27 IC50提高6.8倍,差异具有统计学意义（t=5.283,P=0.0007）;CAL27细胞呈多边形上皮样结构、成簇生长、细胞之间连接紧密,CAL27/CDDP表现为单个分散的长梭形细胞,细胞间连接消失,呈现间质细胞表型;同时,相较于亲本细胞CAL27,CAL27/CDDP间质标志蛋白Vimentin表达升高（t=4.450,P=0.011）,上皮标志蛋白E?cadherin表达降低（t=10.980,P<0.001）,Ezrin蛋白表达上调（t=6.487,P=0.003）,细胞的迁移能力增强（t=3.403,P=0.010）。小干扰RNA转染人舌鳞癌顺铂耐药细胞CAL27/CDDP后Ezrin蛋白表达明显降低,Vimentin表达降低,E?cadherin表达升高,细胞的迁移能力显著下降。结论下调Ezrin能抑制人舌鳞癌顺铂耐药细胞发生上皮—间质转化及转移。     

Twist1调控上皮-间质转化促进舌鳞癌细胞顺铂耐药机制的研究

目的: 探讨Twist1调控上皮-间质转化（EMT）促进舌鳞状细胞癌细胞顺铂耐药的机制。方法: 在CAL27/CDDP中转染Twist1 siRNA,免疫印迹及免疫荧光检测E-cadherin、Vimentin的表达;免疫印迹检测Twist1、Slug的表达;Transwell及划痕实验检测细胞的侵袭、迁移能力;MTT检测细胞对顺铂的半抑制率。采用SPSS17.0 软件包对结果进行单因素方差分析。结果: 转染Twist1 siRNA可逆转CAL27/CDDP的EMT表型, E-cadherin表达增强,Vimentin、Twist1及Slug表达降低,细胞的侵袭、迁移能力明显降低,IC₅₀下降41.75%±5.10%（P<0.01）。结论: Twist1可通过调控上皮-间质转化而促进舌鳞癌细胞的顺铂耐药。     

miR-181a抑制舌鳞癌细胞上皮-间充质转化及化疗耐药机制的研究

目的:探讨miR-181a调控上皮-间充质转化(EMT)促进舌鳞状细胞癌细胞顺铂耐药的机制。方法:分别在CAL27/CDDP、CAL27中转染miR-181a mimics、miR-181a LNA,免疫印迹及免疫荧光检测E-cadherin、Vimentin的表达;免疫印迹检测Twist1、Slug的表达;Transwell及划痕实验检测细胞的侵袭、迁移能力;MTT法检测细胞对顺铂的半抑制率。利用生物信息学方法:预测Twist1可能为miR-181a的靶基因。构建包含Twist1结合序列片段的荧光素酶报告基因质粒,进行双荧光素酶报告基因实验。采用SPSS17.0软件包对结果进行单因素方差分析。结果:转染miR-181a mimics可逆转CAL27/CDDP的EMT表型,E-cadherin表达增强,Vimentin、Twist1及Slug表达降低,细胞的侵袭、迁移能力显著降低,IC₅₀下降47.57%±6.23%（P<0.05）。转染miR-181a LNA可诱导CAL27细胞发生EMT,E-cadherin表达降低,Vimentin、Twist1及Slug表达增强,细胞侵袭、迁移能力显著增强,IC₅₀升高55.61%±7.20%（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实,Twist1是miR-181a的靶基因。结论:miR-181a靶向调控Twist1,从而抑制舌鳞癌细胞上皮-间充质转化与顺铂耐药。     

转化生长因子β1诱导人舌鳞状细胞癌细胞上皮-间质转化及其顺铂耐药性研究

目的 利用转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞CAL27、顺铂耐药细胞CAL27-res发生上皮-间质转化(EMT),建立TSCC细胞发生EMT的实验研究模型.研究EMT对TSCC细胞顺铂耐药性及细胞增殖、凋亡的影响.方法 10 ng/ml的TGF-β1处理CAL27、CAL27-res细胞8 d,观察细胞形态学变化,Western blot 和细胞免疫荧光验证EMT相关上皮标记蛋白及间质标记蛋白表达的变化,划痕试验检测细胞迁移能力的变化,MTT法检测细胞半抑制率(It50),免疫荧光检测MDR、MRP、Topo Ⅱβ的表达,流式细胞仪分析细胞周期及凋亡.结果 TGF-β1 可诱导CAL27、CAL27-res向间质细胞形态转化,并且下调上皮相关标记蛋白E-cadherin的表达,上调间质相关标记蛋白Vimentin的表达,细胞的迁移能力明显增强.IE50分别提高2.31倍(CAL27)和1.72倍(CAL27-res),MDR和MRP表达升高,Topo Ⅱβ表达降低.细胞增殖指数(PI)均明显降低(CAL27:χ2=16.799,P<0.001;CAL27-res:χ2=25.375,P<0.001),细胞凋亡指数(AI)均明显升高(CAL27:χ2=165.0797,P<0.001;CAL27-res:χ2=196.5640,P<0.001).结论 TGF-β1能够成功诱导CAL27、CAL27-res发生EMT并且明显增强细胞对顺铂的耐药性,同时抑制细胞增殖,促进凋亡.     

顺铂诱导舌鳞癌细胞发生上皮-间充质转化及获得肿瘤干细胞样特性的实验研究

目的: 建立舌鳞癌顺铂耐药株,观察其是否具有肿瘤干细胞样特性以及是否发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。方法: 使用顺铂梯度浓度递增法构建舌鳞癌顺铂耐药细胞株,通过MTS、流式细胞术和球囊培养对比舌癌顺铂耐药株和其亲本细胞株化疗耐药性及肿瘤干细胞特性的变化,通过qRT-PCR和Western 免疫印迹检测肿瘤干性因子SOX2、OCT4、BMI1和ABCG2的表达,以及舌癌顺铂耐药株和其亲本细胞株中EMT的指标E-cadherin和Vimentin的表达水平,通过Transwell侵袭迁移实验研究侵袭和迁移能力的变化。采用SPSS 17.0 软件包对数据进行统计学处理。结果: 成功构建了2株舌鳞癌顺铂耐药株CAL27-res和SCC9-res,2株细胞对顺铂具有更强的耐药性。与亲本的舌癌细胞CAL27和SCC9相比,CAL27-res和SCC9-res细胞呈现间充质表型, E-cadherin显著下调(P<0.001),Vimentin和N-cadherin显著上调(P<0.001),侵袭、迁移能力显著增强(P<0.001)。同时,CAL27-res和SCC9-res细胞球囊形成能力增强,肿瘤干性因子SOX2、OCT4、BMI1和ABCG2上调(P<0.001),CD44⁺/CD24^-细胞的比例增高(P<0.001)。结论: 顺铂诱导的舌鳞癌耐药细胞发生EMT且获得了肿瘤干细胞样特性。     

黏着斑激酶抑制剂TAE226对人口腔鳞状细胞癌细胞上皮间质转化的影响

目的 探究黏着斑激酶抑制剂TAE226对人口腔鳞状细胞癌细胞上皮间质转化（EMT）过程的影响。方法 不同浓度（0、1、5、10 μmol·L^-1）的TAE226作用于人口腔鳞状细胞癌HSC-3和HSC-4细胞24、48、72 h后,实时定量聚合酶链反应检测EMT标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的mRNA表达;蛋白质印迹法检测E-cadherin、Vimentin在TAE226作用48 h后的蛋白表达。结果 实时定量聚合酶链反应检测表明,随着TAE226作用时间和浓度的增加,E-cadherin mRNA的表达增加,Vimentin mRNA的表达降低（P<0.05）。蛋白质印迹法检测表明,随着TAE226浓度的增加,E-cadherin蛋白的表达增加,Vimentin蛋白的表达降低（P<0.05）。结论 TAE226能有效抑制人口腔鳞状细胞癌细胞株的EMT进程,有望成为治疗口腔鳞状细胞癌的有效药物之一。     

舌鳞状细胞癌上皮-间质转化与血管生成拟态的关系及意义

目的初步探讨舌鳞状细胞癌（TSCC）上皮-间质转化（EMT）与血管生成拟态（VM）的关系及意义。 方法对65例TSCC组织及相应癌旁正常组织采用免疫组化检测EMT标记物E-cadherin和Vimentin的表达情况,同时CD34联合PAS双重染色检测VM情况。 结果Vimentin在癌和癌旁正常上皮的阳性表达率分别是41.54%和0%,差异具有统计学意义（Z=-5.815,P= 0.000）,Vimentin表达与肿瘤组织分化、临床分期及有无淋巴结转移密切相关。E-cadherin在TSCC和癌旁正常上皮的阳性表达率分别是阳性率56.92%和100%,差异具有统计学意义（Z=-5.951,P= 0.000）,E-cadherin表达与临床分期及有无淋巴结转移密切相关。VM在TSCC和癌旁正常组织的出现的例数比率是33.14%和0%,差异具有统计学意义（Z=-3.946,P= 0.000）,VM与肿瘤临床分期及有无淋巴结转移密切相关。相关分析显示,E-cadherin与Vimentin具有负相关关系（r=-0.507,P= 0.000）,Vimentin表达与VM具有正相关关系（r= 0.592,P= 0.000）,VM与E-cadherin具有负相关关系（r=-0.518,P= 0.000）。 结论TSCC中存在EMT及VM,存在EMT和VM的TSCC具有更高临床分期和容易发生淋巴结转移,两者具有密切相关性,对TSCC侵袭、转移具有重要作用。     

口腔鳞状细胞癌组织中Periostin的表达及其在上皮间质转化中的作用

目的:观察Periostin在口腔鳞状细胞癌组织中的表达情况,及其在上皮间质转化(EMT)中的作用。方法:用免疫组化法检测59例口腔鳞状细胞癌组织(实验组)和15例正常口腔黏膜组织(对照组)中Periostin、E-cadherin、Vimentin表达情况,分析Periostin与E-cadherin、Vimentin间相关关系。结果:59例口腔鳞状细胞癌组织中Periostin、E-cadherin、Vimentin阳性表达率分别为71.2%、52.5%、39.0%, Periostin表达与肿瘤TNM分期、分化程度、淋巴结转移密切相关(P＜0.05);且Periostin与E-cadherin表达降低和Vimentin表达上调间均存在相关性(P＜0.01)。结论:Periostin可能通过调控上皮间质转化促进口腔鳞状细胞癌侵袭转移。     

人舌鳞状细胞癌顺铂耐药细胞系的建立及其耐药基因表达

目的建立耐顺铂(cisplatin,CDDP)人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113/CDDP,探讨其与亲代细胞耐药基因表达水平的差异。方法以人舌鳞癌Tca8113细胞系为实验对象,采用间歇性加药,逐步递增剂量,体外连续诱导培养,诱导其耐药性。用MTT法测定细胞的耐药指数和IC50。RT-PCR检测MDR-1、MRP、GST-π和Bcl-2的表达状况,测其光密度比值。结果建立顺铂耐药细胞系Tca8113/CDDP,耐药指数为9.2倍。RT-PCR显示:其MDR-1、MRP、GST-π和Bcl-2的表达均升高,光密度比值MRP:Tca8113/CDDP∶Tca8113=6.667∶1.111=6倍,Bcl:Tca8113/CDDP∶Tca8113=0.912∶0.549=1.6倍,GST-π∶Tca8113/CDDP∶Tca8113=2∶1=2倍。结论耐CDDP人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113/CDDP有多种耐药基因的表达上升,提示肿瘤细胞的耐药现象受到多种基因的调节。     

lncRNA-HOTTIP在低氧诱导舌鳞癌细胞上皮-间质转化过程中的作用探讨

目的 探讨lncRNA-HOTTIP在低氧诱导人舌鳞癌细胞上皮-间质转化过程中的作用。方法 体外正常氧（20% O₂）或低氧（1% O₂）状态下培养舌鳞癌SCC9、CAL27细胞48 h,实时定量PCR检测lncRNA-HOTTIP与HIF-1α的表达水平;通过小干扰RNA（Si-HIF1α）转染舌鳞癌细胞,检测HIF-1α敲低后lncRNA-HOTTIP的表达变化;进一步通过小干扰RNA（Si-HOTTIP）转染舌鳞癌细胞,验证敲低lncRNA-HOTTIP后E-cadherin、Fibronectin与Vimentin的蛋白和mRNA水平,以及细胞迁移能力的变化。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果 人舌鳞癌细胞SCC9、CAL27在低氧培养48 h后,lncRNA-HOTTIP与HIF-1α均显著升高;Si-HIF1α转染SCC9、CAL27并于低氧培养后,HIF-1α水平显著降低,lncRNA-HOTTIP表达下降。Si-HOTTIP转染SCC9、CAL27并在低氧培养后,lncRNA-HOTTIP水平降低,间质标志蛋白Vimentin和Fibronectin在蛋白和mRNA水平显著降低,上皮标志蛋白E-cadherin表达升高,细胞迁移能力显著降低。结论 低氧可通过上调HIF-1α并激活lncRNA-HOTTIP表达,进而促进人舌鳞癌细胞发生上皮-间质转化及转移。     

化疗耐药相关蛋白在舌鳞状细胞癌中的表达和意义

目的：多药耐药相关蛋白1（MRP1）、肺耐药相关蛋白（LRP）、拓扑异构酶Ⅱβ（TOPOUp）和B细胞淋巴瘤2（BCL2）是公认的肿瘤化疗耐药相关蛋白。本研究主要评估这些耐药相关蛋白在舌鳞癌临床标本和体外化疗耐药模型中的表达差异．以及与舌鳞癌临床病理分期的相关性。方法：采用免疫组织化学法检测65例舌鳞癌标本中MRP1、LRP、TOPOIIB和BCL2的表达,分析其与临床病理指标的相关性。采用顺铂逐步诱导SCC15细胞建立体外化疗耐药模型．MTY法检测细胞药敏性改变．免疫荧光检测耐药蛋白的表达变化,蛋白印迹法检测临床标本与舌鳞癌细胞中耐药蛋白的表达差异。应用SPSS16．0软件包对数据进行Mann-WhitnevU检验、Kruskal—WallisH检验、Spearman相关性分析和单因素方差分析。结果：舌鳞癌组织中MRP1、LRP和BCL2高表达,而TOP0118的表达低于癌旁非肿瘤上皮组织（P〈0．05）：MRP1和TOPOIIB的表达与临床分期、淋巴结转移和组织学分级相关,LRP的表达与组织学分级相关（P〈0．05）。SCC15／CDDP耐药细胞株中,MRP1、LRP和BCL2的表达高于舌鳞癌组织,而TOPOIIB的表达显著低于舌鳞癌组织。结论：舌鳞癌标本中MRP1、LRP、BCL2的高表达和TOPOⅡβ的低表达与肿瘤分化程度和化疗耐药相关．提示舌鳞癌患者中存在原发性耐药现象。     

Lnc RNA KCNQ1OT1靶向miR-506-3p调控舌鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究

目的 探讨长链非编码RNA(Lnc RNA)KCNQ1OT1通过靶向调控miR-506-3p对舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinomas,TSCC)细胞增殖、侵袭和迁移作用机制.方法 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测正常牙龈上皮细胞(human gin-gival epithe...     

低氧激活HIF-1α诱导舌鳞癌细胞上皮-间质转化

目的：探讨低氧微环境诱导人舌鳞癌细胞上皮-间质转化以及HIF-1α在该过程中的作用。方法 体外常氧（20% O₂）或低氧（1% O₂）状态下培养舌鳞癌SCC9、CAL27细胞48 h,Western免疫印迹和实时定量PCR检测上皮间质标记蛋白vimentin、fibronectin和E-cadherin的表达变化和HIF-1α的表达水平,Transwell小室检测细胞的迁移能力。通过小干扰RNA（HIF-1α-Si）转染舌鳞癌细胞,检测HIF-1α、vimentin、fibronectin与E-cadherin蛋白表达以及细胞迁移能力的变化。应用SPSS13.0软件包对数据进行独立样本t检验。结果 人舌鳞癌细胞SCC9、CAL27在低氧环境中培养48 h后,间质标志蛋白vimentin和fibronectin在蛋白和mRNA水平均显著升高,上皮标志蛋白E-cadherin表达降低,HIF-1α表达上调,细胞迁移能力显著增强。小干扰RNA（siRNA）转染舌鳞癌细胞SCC9、CAL27并于低氧下培养后,HIF-1α表达显著降低,vimentin和fibronectin表达也显著降低,E-cadherin表达升高,细胞迁移能力显著下降。结论 低氧通过上调HIF-1α表达而促进人舌鳞癌细胞发生上皮-间质转化及转移。     

微小RNA-21反义寡核苷酸对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的调控作用

目的探讨微小RNA-21（miR-21）反义寡核苷酸（miR-21ASO）对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的调控作用。方法通过转染miR-21ASO，采用实时荧光定量RT—PCR（qRT—PCR）检测舌鳞癌细胞株SCC-15和CAL27中miR．21的表达变化，荧光素酶活性检测实验分析miR-21ASO在舌鳞癌细胞中的调控功能．并运用多种细胞增殖和凋亡检测方法以观察miR-21ASO对舌鳞癌细胞调控产生的系列效应。结果miR-21在两株舌鳞癌细胞SCC-15和CAL27中的表达显著高于在正常舌鳞状上皮细胞中的表达（P=0．037，0．015），转染miR-21ASO可显著抑制其表达（P=0．017，0．006），miR-21对荧光素酶活性的抑制率由50％显著减少到20％以下（P=0．002，0．003），SCC-15和CAL27细胞存活率比转染前明显降低（P=0．002，0．004），细胞克隆形成率比转染前明显降低（P=0．007，0．032）；流式细胞仪检测显示转染miR-21ASO后．SCC-15和CAL27细胞凋亡明显增加，激光共聚焦显微镜观察到线粒体细胞色素C释放较转染前增加。结论miR-21ASO对舌鳞癌细胞miR-21水平降低具有靶向特异性．转染miR-21ASO可有效抑制miR-21的促癌效应，利用反义核酸技术的高度特异性开展针对促癌microRNA分子的靶向治疗将可能为舌鳞癌的基因治疗开辟新的途径。     

乙醇诱导舌鳞状细胞癌上皮细胞间质转化

目的探讨乙醇对舌鳞状细胞癌（TSCC）细胞上皮间质转化的影响。 方法乙醇诱导TSCC细胞株SCC9和SCC15,倒置显微镜下观察处理前后细胞形态及排列情况;Wound healing和Transwell实验检测乙醇处理前后细胞迁移和侵袭能力;Western blot和免疫荧光检测E-cadherin和Vimentin表达情况。数据分析采用SPSS 19.0统计软件,计数资料之间比较采用卡方检验,E-cadherin和Vimentin蛋白表达变化采用单因素方差分析。 结果倒置显微镜下可见乙醇诱导后的SCC9和SCC15细胞由上皮细胞形态向间质细胞形态转化,细胞失去极性和紧密连接,由多边形、铺路石样转变为类似成纤维细胞样形态,细胞呈梭形,部分伸出伪足,细胞间隙增宽甚至丧失,排列较为杂乱、松散;Wound healing实验中,乙醇处理后的SCC9和SCC15细胞划痕愈合更快,迁移能力明显增强（χ²_{SCC9,24 h}= 15.668,P_{SCC9,24 h}= 0.001;χ²_{SCC15,24 h}= 4.703,P_{SCC15,24 h}= 0.028;χ²_{SCC9,48 h}= 3.391,P_{SCC9,48 h}= 0.042;χ²_{SCC15,48 h}= 2.386,P_{SCC15,48 h}= 0.136）;Transwell实验则证实乙醇处理后的SCC9和SCC15细胞的侵袭能力明显增强,SCC9相对侵袭率为384.24%（χ²= 26.917,P<0.001）,SCC15相对侵袭率为428.49%（χ²= 32.880,P<0.001）;Western blot和免疫荧光结果显示乙醇诱导后SCC9和SCC15细胞E-cadherin表达下调（F= 131.533,P_SCC9<0.001,P_SCC15= 0.001）,Vimentin表达上调（F= 355.388,P_SCC9<0.001,P_SCC15<0.001）。 结论乙醇可诱导TSCC细胞发生上皮间质转化,促进其侵袭和迁移。