微小RNA-181a抑制唾液腺腺样囊性癌细胞株增殖能力的研究

目的探讨微小RNA（miR）-181a对唾液腺腺样囊性癌（SACC）细胞增殖能力的体内外作用影响。 方法通过过表达或沉默miR-181a在SACC-LM和SACC-83细胞中的表达。实时荧光定量PCR检测转染后SACC细胞株中miR-181a的表达水平。MTT法检测miR-181a对SACC细胞体外增殖能力的影响。Western blot检测转染后生长因子因子表达的改变。裸鼠皮下移植瘤模型检测miR-181a对SACC细胞体内增殖能力的影响。采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学处理,以P<0.05为差异具有统计学意义。 结果实时荧光定量PCR结果示,转染后SACC-LM细胞中miR-181a表达升高（t = -9.198,P = 0.012）,而SACC-83细胞中miR-181a表达降低（t = -7.241,P = 0.019）;SACC-LM细胞增殖能力降低（t = -4.58,P = 0.045）,而SACC-83细胞增殖能力提高（t = 3.016,P = 0.03）;SACC-LM细胞中转化生长因子β2（TGF-β2）、神经生长因子（NGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平均下调,而SACC-83细胞中TGF-β2、NGF和VEGF的表达水平均升高。裸鼠皮下移植瘤模型结果显示,miR-181a mimics组移植瘤瘤体明显小于mimics NC组（t = -4.692,P = 0.043）。 结论miR-181a能抑制SACC细胞体内体外的增殖能力。     

miR-181a抑制唾液腺腺样囊性癌侵袭、转移机制的实验研究

目的 探讨miR-181a在唾液腺腺样囊性癌细胞侵袭、转移中的作用。方法 利用QRT-PCR检测miR-181a在一对不同侵袭、迁移能力细胞株中的表达水平。过表达或沉默miR-181a在SACC-LM和SACC-83细胞中的表达。利用激光共聚焦显微镜观察转染后细胞骨架的改变。Western免疫印迹检测转染后侵袭、转移相关因子的表达。通过尾静脉注射miR-181a mimics和mimics NC细胞,建立裸鼠肺转移模型。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学处理。结果 QRT-PCR结果显示,miR-181a在低侵袭、迁移能力SACC-83细胞中的表达量显著高于高侵袭、迁移能力的SACC-LM细胞。SACC-LM细胞转染miR-181a mimics后,细胞呈梭形,Slug、pERK1/2、ERK1/2表达水平下调;SACC-83细胞转染miR-181a LNA后,细胞变圆,体积变小,Slug、pERK1/2、ERK1/2表达水平升高。裸鼠肺转移模型miR-181a mimics组,细胞形成肺转移灶面积显著小于mimics NC组（P<0.05）。结论 miR-181a能抑制SACC的侵袭和转移。     

miR-181a靶向SLUG抑制涎腺腺样囊性癌的侵袭和迁移

目的 研究miR-181a靶向SLUG抑制涎腺腺样囊性癌的侵袭和迁移.方法 利用生物信息学软件预测出侵袭转移相关基因SLUG为miR-181a的候选靶基因.利用双荧光素酶报告基因检测验证miR-181a对靶基因SLUG的直接调控作用.在SACC-LM细胞中沉默SLUG后通过细胞划痕和Transwell实验检测转染后细胞侵袭迁移能力的改变.结果 生物信息学软件预测发现,SLUG mRNA序列中包含miR-181a的结合位点.双荧光素酶报告基因实验证实,与对照组相比,miR-18la mimics与psi-CHECK-2-SLUG-3' UTR共转染组细胞内荧光素酶活性明显下降(P＜0.05),而miR-18la mimics与psi-CHECK-2-SLUG-mut-3'UTR共转染组细胞内荧光素酶活性无明显变化(P＞0.05),即SLUG为miR-18la的靶基因.转染SLUG siRNA可成功沉默SACC-LM细胞中内源性表达的SLUG,同时细胞的侵袭迁移能力明显下降(P＜0.05).结论 SLUG为miR-181a的靶基因.miR-181a可靶向调控SLUG,从而调控涎腺腺样囊性癌的侵袭和迁移.     

TGF-β1信号通路相关的microRNA在唾液腺腺样囊性癌侵袭转移中的作用

目的 探讨TGF-β1/MAPKs/MMPs信号通路相关的microRNA (miRNA)在唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)侵袭、转移中的作用。方法：采用 miRNA 芯片检测TGF-β1 刺激腺样囊性癌细胞（SACC-83、SACC-LM）前、后的miRNA表达谱;对 miRNA 表达谱进行差异分析;然后挑选几个显著差异表达的miRNA,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进一步加以验证,同时运用miRNA 靶基因预测软件预测其可能调控的靶基因。结果：芯片结果显示,与低转移株SACC-83相比,高转移株SACC-LM中的miRNA上调表达40个,下调表达 101个;经TGF-β1处理后,进一步显著上调的miRNA 1个,下调12个;qRT-PCR 验证结果与 miRNAs 芯片相符。对显著差异表达的miRNAs进行靶基因预测,共筛选出与 TGF-β1/MAPKs/MMPs信号通路相关的5个miRNAs（miR-125a-5p、miR-181d、mir-145-3p、mir-126-3p和mir-320d）,其对应的靶基因有P38(MAPK14)、MMP2、ERK1/2和SMADs。结论：不同转移能力的SACC存在差异表达的 miRNAs;TGF-β1能够影响SACC细胞miRNAs 的表达;miR-125a-5p、miR-34a、mir-145-3p、mir-126-3p和mir-195可能在SACC转移相关信号调节通路TGF-β1/MAPKs/MMPs中起着重要的调控作用。     

BDNF/TrkB在唾液腺腺样囊性癌上皮-间质转化过程中的表达及意义

目的 研究BDNF、TrkB和E-cadherin在唾液腺腺样囊性癌（SACC）细胞系中的表达,初步探讨BDNF、TrkB和E-cadherin与SACC高转移性及神经侵袭性之间的关系。方法 以SACC高、低转移细胞系SACC-LM和SACC-83为研究对象,利用实时荧光定量 PCR和Western 免疫印迹技术检测BDNF、TrkB和E-cadherin在其中的表达差异;在SACC-83细胞系中加入外源性BDNF因子、TrkB抑制剂k252a,分析BDNF/TrkB通路在SACC侵袭转移过程中的生物学作用;利用实时荧光定量 PCR、Western 免疫印迹、细胞形态观察、细胞迁徙和侵袭实验评估SACC细胞上皮-间质转化（EMT）进程。应用SPSS17.0软件包对数据进行统计学处理。结果 BDNF 和TrkB在SACC-LM中的表达高于SACC- 83,E-cadherin在SACC-LM中的表达低于SACC- 83;外源性BDNF刺激能有效诱导TrkB的激活和表达,降低E-cadherin的表达,提高N-cadherin的表达,使细胞形态呈长梭形改变,促进SACC-83细胞的迁徙、侵袭能力;而TrkB受体抑制剂k252a可有效抑制BDNF的各种作用,降低SACC-83细胞形态变化和迁徙、侵袭能力。结论 BDNF/TrkB信号通路通过介导SACC的EMT过程,促进SACC的迁徙、侵袭能力。     

嘌呤受体P2Y_2在涎腺腺样囊性癌的表达及ATP对其细胞生长的抑制

目的研究嘌呤受体P2Y2在涎腺腺样囊性癌非高转移细胞株（SACC-83）和高转移细胞株（SACC-LM）的表达,及其激动剂ATP对二者细胞生长的抑制作用。方法采用免疫细胞化学法检测P2Y2受体在SACC-83和SACC-LM细胞株中的表达;采用MTT法检测不同浓度ATP（0.1mM/L、0.2mM/L、0.4mM/L、0.8mM/L和1.6mM/L）在不同作用时间点（24h、48h和72h）对SACC-83和SACC-LM细胞生长的抑制作用。结果 SACC-83和SACC-LM细胞中P2Y2均呈阳性表达,在细胞膜的染色较胞浆深,其表达在两细胞株中无明显差异。ATP对SACC-83和SACC-LM细胞的生长均有明显的抑制作用（P〈0.05）,并且对SACC-LM细胞的抑制作用强于对SACC-83细胞的抑制作用,其抑制作用与药物浓度和作用时间呈正相关。结论不同转移能力的涎腺腺样囊性癌细胞SACC-83和SACC-LM的胞膜和胞浆中均有嘌呤受体P2Y2表达,ATP对二者细胞生长有显著抑制作用。     

长非编码RNA lncRNA ADAMTS9-AS2促进唾液腺腺样囊性癌侵袭转移的研究

目的检测不同转移能力的唾液腺腺样囊性癌(salivary gland adenoid cystic carcinoma,SACC)细胞中差异表达的长非编码RNA(lncRNA),探讨lncRNA在唾液腺腺样囊性癌侵袭转移中的作用。方法以腺样囊性癌高转移细胞株SACC-LM为实验组,低转移细胞株SACC83为对照组,采用lncRNA芯片初步筛选差异表达的lncRNA,通过qRT-PCR进一步验证差异表达的lncRNA。通过侵袭迁移实验检测转染差异表达的lncRNA siRNAs前后腺样囊性癌细胞株侵袭迁移能力的变化。并对差异表达的lncRNA与SACC患者的临床病理特征和预后进行分析。结果芯片筛选出ADAMTS9-AS2在高转移细胞系(SACC-LM)中高表达,实时定量RT-PCR进一步验证了其在高转移细胞系(SACC-LM)显著上调,通过侵袭迁移实验发现在转染后下调ADAMTS9-AS2的表达水平后侵袭迁移能力明显降低(P<0.001)。临床病理资料分析表明,ADAMTS9-AS2在SACC组织中高度表达。高表达的ADAMTS9-AS2与SACC患者预后不良和肿瘤转移率高有关。结论高表达ADAMTS9-AS2促进SACC细胞迁移和侵袭,ADAMTS9-AS2在SACC组织中上调,并且与高转移率和不良预后相关。     

PPARγ在人肺高、低转移涎腺腺样囊性癌细胞系中的表达及意义

目的检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）在涎腺腺样囊性癌高、低转移细胞系中的表达,并探讨PPARγ是否与涎腺腺样囊性癌（SACC）肺转移转移相关。方法采用Western blot和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及实时定量PCR（Quantitative Real-time PCR）方法检测肺高转移性涎腺腺样囊性癌（SACC-LM）及肺低转移性涎腺腺样囊性癌（SACC-83）细胞系中PPARγ蛋白表达和PPARγmRNA的表达水平。所得实验数据采用SPSS 16.0统计软件进行t检验。结果 PPARγ蛋白及mRNA在SACC-LM细胞系及SACC-83细胞系中均有表达,与SACC-83细胞系相比,SACC-LM细胞系中PPARγ蛋白较高表达,并且SACC-LM细胞系中PPARγmRNA表达水平是SACC-83细胞中表达水平的4.346939倍（P〈0.01）。结论 PPARγ在SACC肺高低转移细胞系中的差异表达,初步证实PPARγ在SACC远处转移方面有重要作用。     

M期促进因子在唾液腺腺样囊性癌中的表达

目的：研究M期促进因子（MPF）的表达与唾液腺腺样囊性癌（SACC）临床病理特点之间的关系。方法：应用免疫组织化学SP法检测40例SACC组织及40例正常唾液腺组织中MPF的表达。应用Westem印迹测定SACC细胞系SACC-83和SACC肺高转移细胞系SACC-LM中MPF的表达。采用SPSS11．5统计软件包,分别应用χ^2检验、配对t检验和线性相关分析进行统计学处理。结果：SACC组织中MPF的表达明显升高,与正常唾液腺组织之间存在显著差异（P〈0．05）。MPF的表达与SACC的病理类型有关（P〈0．05）。体外培养的SACC细胞系SACC-LM中MPF的表达显著高于SACC-83中MPF的表达（P〈0．05）。结论：MPF在SACC组织中呈高表达,其表达与SACC的发生密切相关,MPF的异常激活是SACC恶性增殖的原因之一,MPF与SACC的转移能力有关。     

MicroRNA-320a调控唾液腺腺样囊性癌侵袭转移的实验研究

目的：探讨microRNA-320a（miR-320a）对唾液腺腺样囊性癌侵袭、转移能力的调控作用。方法：以唾液腺腺样囊性癌高转移细胞株ACC-M为实验样品,通过脂质体介导,将miR-320a的拟似物（miR-320a mimics）转染至ACC-M细胞,升高miR-320a的表达水平。采用荧光实时定量RT-PCR检测转染前、后ACC-M中miR-320a的表达变化,通过Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力的改变,并通过细胞计数试剂盒-8检测转染后细胞增殖能力的变化,流式细胞仪检测miR-320a对细胞凋亡的影响,Western印迹检测miR-320a的靶基因整合素β3（integrinβ3,ITGB3）的表达变化。应用SPSS13.0软件包对所得数据进行t检验或单因素方差分析。结果：转染miR-320amimics后的ACC-M中miR-320a的表达明显上调（P〈0.001）。ACC-M细胞的侵袭迁移能力显著降低（P〈0.001）,而细胞的增殖和凋亡无显著变化。Western印迹检测结果显示,Integrinβ3在低转移细胞株ACC-2表达阴性,在ACC-M中高表达;升高miR-320a在ACC-M中的表达,Integrinβ3表达明显降低。结论：低表达miR-320a有助于维持ACC的侵袭转移特性,调高其表达水平能有效抑制ACC-M的侵袭迁移能力。miR-320a可能通过调控其靶基因Integrinβ3的表达而发挥作用。     

涎腺腺样囊性癌细胞转移潜能与细胞外基质的关系

目的 了解不同转移能力的涎腺腺样囊性癌（ｓａｌｉｖａｒｙ ａｄｅｎｏｉｄ ｃｙｓｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＳＡＣＣ）细胞与细胞外基质粘附、对细胞外基质侵袭及趋化运动的能力。方法 ＭＴＴ法测定ＳＡＣＣ－ＬＭ，ＳＡＣＣ－８３，ＡＣＣ－Ｍ，ＡＣＣ－２与纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原的粘附，用改良Ｂｏｙｅｄｎ ｃｈａｍｂｅｒ方法观察了ＳＡＣＣ细胞对人工重组基底膜的侵袭以及趋化运动。结果 高转移的ＳＡ     

ERK在SACC-LM及SACC-83细胞中表达水平与活性的比较

目的：探讨细胞外信号调节激酶（ERK）在涎腺腺样囊性癌细胞中的活性及表达变化：方法：采用RT—PCR和Western blotting法检测SACC—LM及SACC-83细胞系中ERK蛋白mRNA和蛋白表达，测定ERK酶活力。所得实验数据采用SPSS12．0统计软件进行t检验组间比较。结果：ERK在SACC—LM及SACC-83细胞系中的平均活性分别为54．846pmol·min^-1·μg^-1和40．281pmol·min^-1·μg^-1．SACC—LM细胞中ERK具有较高活性：SACC-LM细胞中ERK有较高表达。结论：ERK蛋白活性变化及蛋白表达与SACC的转移有关。     

特异性抑制剂对腺样囊性癌细胞中蛋白激酶B表达的影响

目的探讨特异性抑制剂LY294002对体外培养涎腺腺样囊性癌（SACC）细胞中蛋白激酶B（PKB）表达和转录水平的影响.方法经细胞培养后,应用Wester-blot和RT-PCR实验技术,用酶显法显色、EB染色,将实验数据进行配对t检验.结果SACC-83细胞PKB丝氨酸^473（Ser^473）的表达和转录水平显著低于SACC-LM细胞PKB（Ser^473）的表达和转录水平（P＜0.05）;而经LY294002处理的细胞PKB（Ser^473）的表达显著低于未经处理细胞PKB（Ser^473）的表达（P＜0.01）,但两者转录水平差异无统计学意义（P＞0.05）.结论体外培养的SACC-83细胞PKB（Ser^473）的蛋白表达和转录水平显著低于SACC-LM细胞;LY294002对体外培养细胞中的PKB（Ser^473）蛋白表达有明显抑制作用.     

TGF-beta1 promotes migration and invasion of salivary adenoid cystic carcinoma

Salivary adenoid cystic carcinoma (SACC) is one of the most common subtypes of salivary gland carcinomas and frequently metastasizes to distant organs. However, little is known about the molecular mechanisms that promote SACC metastasis. In this study, we report that transforming growth factor (TGF)-β1 was highly expressed in the highly metastatic SACC-LM cell line as compared with its parental low-metastatic SACC-83 cell line. Exogenous addition of TGF-β1 induced Smad2 phosphorylation and promoted the migration and invasion of SACC-83 cells. Consistently, the inhibition of endogenous TGF-β1 signaling in SACC-LM cells by an inhibitor specific to the type I TGF-β1 receptor (TβRI) suppressed cell migration and invasion. Moreover, we found that TGF-β1 expression was significantly increased in human primary SACC samples with metastasis. Taken together, our results suggest that TGF-β1 may play a crucial role in SACC metastasis.