HPV16 E6/E7永生化口腔上皮细胞的上皮-间叶变

目的研究人乳头状瘤病毒HPV16 E6/E7永生化口腔上皮细胞的上皮-间叶变(EMT),以及发生EMT细胞的生物学特征.方法相差显微镜、微分干涉显微镜观察HPV16 E6/E7永生化口腔上皮细胞系HIOEC细胞形态学改变;透射电镜观察细胞间桥粒形成情况; RT-PCR比较正常口腔上皮细胞和HIOEC细胞中β-catenin、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、wnt-4、wnt-5a、snail基因的转录情况;免疫组化检测HIOEC细胞中细胞角蛋白(CK)、波形蛋白(Vim)的表达.免疫荧光、激光共聚焦显微镜观察Actin 细胞骨架的改变.结果 HIOEC细胞呈梭形成纤维细胞样改变,细胞分散生长;RT-PCR结果显示HIOEC细胞E-cadherin、wnt-4转录水平下调, wnt-5a转录水平上调,β-catenin、snail基因无明显改变.HIOEC细胞共表达CK和Vim.Actin细胞骨架在HIOEC细胞中更显丰富,呈束排列.结论 HPV16 E6/E7永生化口腔上皮HIOEC细胞发生上皮-间叶变,细胞表现间叶细胞的部分生物学特征.     

HPV16 E6/E7永生化口腔上皮细胞的上皮-间叶变

目的研究人乳头状瘤病毒HPV16 E6／E7永生化口腔上皮细胞的上皮-间叶变(EMT)，以及发生EMT细胞的生物学特征。方法相差显微镜、微分干涉显微镜观察HPV16 E6／E7永生化口腔上皮细胞系HIOEC细胞形态学改变；透射电镜观察细胞间桥粒形成情况；RT-PCR比较正常口腔上皮细胞和HIOEC细胞中β-catenin、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、wnt-4、wnt-5a、snail基因的转录情况；免疫组化检测HIOEC细胞中细胞角蛋白(CK)、波形蛋白(Vim)的表达。免疫荧光、激光共聚焦显微镜观察Actin细胞骨架的改变。结果HIOEC细胞呈梭形成纤维细胞样改变，细胞分散生长；RT—PcR结果显示HIOEC细胞E-cadherin、want-4转录水平下调，wnt-5a转录水平上调，β-catenin、snail基因无明显改变。HIOEC细胞共表达CK和Vim。Actin细胞骨架在HIOEC细胞中更显丰富，呈束排列。结论HPV16 E6／E7永生化口腔上皮HIOEC细胞发生上皮一间叶变，细胞表现间叶细胞的部分生物学特征。     

宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中HPV 16,18的关系

目的 探讨宫颈上皮内瘤变（CIN）和宫颈癌的临床病理与人乳头状瘸病毒（HPV）之间的关系。方法 收集妇科门诊活检和手术切除标本139例（其中CIN 108例、宫颈癌31例），同时进行HPV16，18检测。结果 31例宫颈癌中HPV16，18型阳性表达率为58．1％（18／31），108例CIN HPV16，18型阳性率为47．2％，两者阳性率差异无显著性（P〉0．05）；CIN 1级阳性表达率最低33．4％，呈现级别越高，其HPV阳性率越高。结论 提示HPV 16，18有促进肿瘤生长的作用。     

宫颈上皮内瘤样病变与人乳头瘤病毒感染的关系研究

目的：观察宫颈上皮内瘤样病变与人乳头瘤病毒感染的关系。方法选取妇科门诊就诊患者中经阴道镜下宫颈活检病理检查确诊为CIN的患者共263例,均对其检测HPV分型。HPV分型的检测采用PCR扩增、基因芯片探针杂交分型检测法。结果 HPV感染率随着CIN级别进展逐渐升高。CINⅠ级主要为LR-HPV感染;CINⅡ-Ⅲ主要为HR-HPV感染,尤其是HPV-16、18。HPV-16、18感染率在CINⅠ与CINⅡ、CINⅡ与CINⅢ之间差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论 HPV感染率随着CIN级别的增高而上升,HPV感染的基因型决定了CIN病变的级别,LR-HPV主要引起轻度鳞状上皮内病变,相当于CINⅠ级,HPV基因型主要为HPV-11、6。HR-HPV主要引起高度鳞状上皮内病变,相当于CINⅡ-Ⅲ,HPV基因型主要为HPV-16、18、58。因此,对有性生活的女性开展HPV分型检测,结合宫颈液基薄层细胞制片法(TCT)检查,发现阳性及时行阴道镜下宫颈活检,及时有效地发现宫颈上皮内瘤样病变(CIN)并进行干预治疗,能降低宫颈癌的发病率和死亡率。     

人巨细胞病毒促进HPV16永生化的宫颈皮细胞癌变研究

探讨宫颈癌的发生发展与人乳头瘤病毒和人巨细胞病毒协同感染的关系。方法：本实验应用我国室建立的ＨＰＶ１６永生化的人宫颈上皮细胞系,转染ＨＣＭＶ即早基因。结果：ＨＣＭＶ整合在细胞染色体中,协同ＨＰＶ１６促进宫颈上细胞的恶性化,在裸鼠中形成肿瘤。     

HPV E6/E7 mRNA对宫颈上皮内瘤变Ⅰ级转归的预测价值

目的：评估人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）E6/E7 mRNA预测宫颈上皮内瘤变Ⅰ级（cervical intraepithelial neoplasia gradeⅠ,CINⅠ）转归的应用价值。方法：选取2017年10月至2020年3月在重庆医科大学附属妇女儿童医院妇科门诊就诊,液基细胞学检测（thinprep cytology test,TCT）、HPV DNA检测和HPV E6/E7 mRNA检测中一项结果异常行阴道镜检查,病检结果为CINⅠ的患者208例,1年后复查TCT、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA,检测中一项结果异常再次阴道镜下行宫颈活检,随访患者病变消退、持续存在或进展,分析HPV E6/E7 mRNA对宫颈上皮内瘤变Ⅰ级进展风险的预测价值。结果：(1)208例CINⅠ患者中有17例进展为CINⅡ或CINⅢ,进展率8.2%,进展患者中TCT阳性率为58.8%、HPV DNA阳性率为100%,HPV E6/E7 mRNA阳性率为100%;(2)Cox回归分析中,TCT的风险比（hazard ratio,HR）为9.184,H...     

高危型HPVE6/E7mRNA检测对高级别宫颈病变的诊断价值

目的探讨高危型人乳头瘤病毒（HPV）E6/E7mRNA检测对高级别宫颈病变的临床诊断价值。方法选取2014年8月至2015年3月在妇科门诊及住院的疑似宫颈病变患者311例,均行宫颈脱落细胞的薄层液基细胞学检查、HPVDNA分型检测和高危型HPVE6/E7mRNA检测,对其中任意一项或多项结果阳性者行阴道镜下宫颈活组织检查和组织病理学检查。以病理报告为金标准,进行统计学分析。结果慢性宫颈炎组中HPVDNA分型检测检出率（29.4%）高于高危型HPVE6/E7mRNA（17.5%）,差异有统计学意义（P＜0.05）。高危型HPVE6/E7mRNA检测预测高级别宫颈病变的特异度（73.4%）高于HPVDNA分型检测（59.8%）,差异有统计学意义（P＜0.05）。高危型HPVE6/E7mRNA检测诊断高级别宫颈病变ROC曲线下面积（0.816）大于HPVDNA分型检测（0.710）,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论与HPVDNA分型检测相比,高危型HPVE6/E7mRNA检测预测高级别宫颈病变具有更好的特异度,其诊断效能更佳。     

雌激素受体亚型与人乳头状瘤病毒感染状态在宫颈病变进展中作用的研究

[目的]探讨雌激素受体(ER)亚型及人乳头状瘤病毒(HPV)感染在不同程度宫颈病变中的相互作用及其对宫颈病变进展的影响。[方法]应用免疫组化方法检测ERα/ β两种亚型及HPV16 -L1/E7两种蛋白在6 6例不同程度宫颈病变组织中的表达。[结果]宫颈癌组的HPV16 -L1(- ) /HPV16 -E7( )者(42 .9% )及ERβ阳性率(6 1.9% )高于非宫颈癌组(13.3%和33.3% ) ,差异有显著性(P =0 .0 19和P =0 .0 2 9) ,并且HPV的表达状态与ERβ的表达相关。[结论]ERβ可能通过影响HPV在宿主细胞中的感染状态对宫颈病变的发展起一定影响。     

高度宫颈上皮内病变的筛查与处理

目的:探讨高度宫颈鳞状上皮内病变筛查、早期诊断、治疗方案及预后.方法:对组织病理学诊断的65例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ级和60例CINⅢ级的宫颈细胞学检查、阴道镜检查及多点活检、治疗方法和预后进行回顾性分析.结果:本组125例,细胞学诊断与组织病理学的符合率是82.4%,阴道镜检查符合率是92%.合并高危型人乳头状瘤病毒(HPV)感染者110例,阳性率88%.106例行高频电波刀电圈切除术(LEEP),19例采用宫颈冷刀锥切术(CKC)或全子宫切除术,其中13例年轻尚未生育的妇女因多点CINⅢ或原位癌者行两次LEEP或CKC后行LEEP或LEEP后行全子宫切除术.结论:CIN趋于年轻化;应用宫颈细胞学、阴道镜检查及多点活检,结合HPV-DNA的检测能提高宫颈上皮内病变早期诊断率;对大多数CINⅡ～Ⅲ级的治疗LEEP可作为首选,术后定期随访十分重要,尤其对多个点CINⅢ或原位癌行LEEP或CKC的患者要定期随诊.     

HPV16相关宫颈癌细胞系和组织中E7和DRR1蛋白的表达

目的:研究人乳头瘤病毒16(HPV16)相关宫颈癌细胞系和组织中E7和肾细胞癌下调基因1(DRR1)表达的关系。方法:以HPV16 E7阳性的宫颈癌Ca Ski和Si Ha细胞、HPV16 E7阴性的宫颈癌C-33A细胞及184例宫颈鳞状细胞癌组织为研究对象,采用Western blot方法和免疫组化染色方法检测E7和DRR1蛋白的表达,分析E7与DRR1蛋白表达的关系。结果:Western blot结果显示,C-33A细胞中HPV16 E7无表达,DRR1蛋白的表达显著高于Ca Ski细胞和Si Ha细胞(F=454.982,P<0.001);Ca Ski细胞和Si Ha细胞表达HPV16 E7,二者DRR1蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化染色结果显示,HPV16 E7阳性宫颈鳞状细胞癌组织141例,其中DRR1蛋白阳性34例;HPV16 E7阴性宫颈鳞状细胞癌组织43例,其中DRR1蛋白阳性32例;HPV16 E7阳性组织中DRR1蛋白的表达显著低于HPV16 E7阴性组织(χ2=36.250,P<0.001)。结论:DRR1可能是HPV16 E7作用的潜在靶基因。     

宫颈癌妇女人乳头瘤病毒16E6/E7基因变异分析

目的了解宫颈癌妇女人乳头瘤病毒(HPV)16E6/E7基因变异的情况,为HPV防治提供流行病学数据。方法从大量样本中筛选出HPV16阳性标本180例,其中宫颈癌患者100例,宫颈不典型增生患者50例,宫颈炎症患者30例,对宫颈脱落细胞样本采用PCR方法扩增HPV16 E6/E7基因,然后对反应产物采用DNA测序法获得基因序列,在GeneBank进行经BLAST分析,寻找变异位点。结果宫颈癌患者中E6核苷酸变异率为82.00%(82/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);宫颈癌HPV16E6最频繁的序列变异为T178G(60/100),其他常见变异为T350G、C335T/A442C、T178G/G39T,年轻宫颈癌组E6核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但两者T178G变异率存在明显差异(=0.000)。宫颈癌患者HPV16 E7核苷酸变异率为74.00%(74/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);E7最频繁序列变异为A647G 32.00%(32/100),其他常见的变异为A647G/C749T/T843C/T846C、A647G/C749T/T846C、C749T/C790T、A647G/C749T;年轻宫颈癌组E7核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但A647G变异率存在明显差别(=0.03)。结论宫颈癌患者明显存在HPV16E6E7核苷酸变异,HPVE6 T178G、E7 A647G可能与宫颈癌年轻化密切相关,故对该人群的检测并及时尽早采取干预措施。     

人乳头瘤病毒E6／E7mRNA与宫颈病变关系的研究进展

人乳头瘤病毒与子宫颈癌的发生和发展密切相关,其中病毒癌基因E6、E7的表达是致癌的关键,当病毒基因整合进入宿主基因后,E6、E7基因过度表达,最终导致子宫颈癌的发生。文章对E6、E7基因转录产物E6／E7mRNA的研究进展进行综述。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗的影响

目的研究抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗敏感性的影响。方法以脂质体法将抗HPV16E6-Ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R、CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达,Northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达。用克隆形成试验检测3种细胞对化疗的敏感性,Annexine/PI双标法检测细胞凋亡率。结果点杂交证实核酶能在CaSKi-R细胞中稳定表达,Northern杂交证实CaSKi-R中表达E6较CaSKi-P、CaSKi明显降低。CaSKi-R细胞的生长速率较CaSKi-P、CaSKi明显减慢,泰素作用后相对克隆形成率和凋亡率在3种细胞间亦无差异(P>0.05);顺铂作用后CaSKi-R细胞的相对克隆形成率较CaSKi-P、CaSKi明显下降(P<0.01),而凋亡率明显增加(P<0.01)。结论转染抗HPV16E6-ribozyme的CaSKi-R细胞出现一定程度的生长抑制,且对顺铂的敏感性增加,而对泰素的敏感性没有发生改变。     

HR-HPV载量和HR-HPV E6/E7 mRNA在宫颈癌和癌前病变的表达和意义

目的 比较和分析高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）载量和HR-HPV E6/E7 mRNA在宫颈癌和宫颈上皮内瘤变（CIN）的表达和差异,探讨二者的关联及其在宫颈癌变进程中的临床意义。方法 以339例HR-HPV持续感染者为研究对象,依病理组织学诊断分为宫颈癌和CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ共4组,分别采用PCR荧光法、支链DNA技术定量检测宫颈刷检物中的HPV-DNA和HPV E6/E7 mRNA,对数据资料进行统计学分析。结果 （1）随宫颈病变严重程度的增加,HR-HPV DNA和HR-HPV E6/E7 mRNA的表达水平和阳性表达率均明显上升;（2）不同等级的宫颈病变中,HR-HPV DNA和HR-HPV E6/E7 mRNA的阳性表达率总体分布差异无统计学意义（P>0.05）,两两比较显示,除CINⅡ组两指标检测阳性率差异无统计学意义（P>0.05）,其余各组间差异有统计学意义（P<0.05）;（3）4组患者HPV E6/E7 mRNA和HR-HPV DNA的总体表达水平差异均有统计学意义（P<0.05）,两两比较显示：HPV E6/E7 mRNA在CINⅢ和宫颈癌之间差异无统计学意义（Z=-1.013,P=0.311）,其余组别间差异有统计学意义（P<0.05）。HR-HPV DNA在CINⅠ和CINⅡ之间差异无统计学意义（Z=-1.376,P=0.169）,CINⅢ和宫颈癌之间差异无统计学意义（Z=-0.991,P=0.322）,其余组别间差异有统计学意义（P<0.05）;（4）HPV E6/E7 mRNA和HR-HPV DNA间存在相关性（r=0.533,P<0.05）,不同级别病变表现为在CINⅠ、CINⅡ呈明显正相关（r=0.412,0.804,均P<0.05）,在CINⅢ和宫颈癌无相关性（P>0.05）;（5）随着病毒载量的提高,高级别CIN和宫颈癌在宫颈病变整体构成的占比上升。结论 HR-HPV E6/E7 mRNA在CINⅠ阶段即开始表达,随着表达量激增,加速宫颈癌的发生,HR-HPV载量和HR-HPV E6/E7 mRNA存在显著相关性,病毒与宿主基因整合,干扰了HPV载量与病变严重程度的一致性。     

HPV16 E6基因反义寡核苷酸诱导SiHa细胞凋亡的研究

目的　探讨 HPV16 E6反义寡核苷酸 (AE6 )对宫颈癌细胞 Si Ha细胞凋亡的诱导作用 .方法　应用细胞生长抑制实验 (MTT)、透射电子显微镜 (TEM)、DNA电泳及流式细胞术 (FCM)研究 AE6对 Si Ha细胞生长抑制、超微结构改变、核酸及细胞增殖周期的影响 .结果　 AE6 1～ 40μmol· L- 1对 Si Ha细胞抑制率为 9.9%～ 6 0 .3% ,相互间有显著性差异(P<0 .0 5 ) .AE6 2 0 μmol· L- 1作用 72 h,Si Ha出现凋亡形态学改变 ,DNA电泳呈梯状带型 .AE6 5 ,10 ,2 0和 40μmol· L- 1 作用 72 h后 ,Si Ha细胞凋亡率分别为 1.9% ,7.9% ,8.1%和 19.7% .结论　 HPV16 E6基因与 HPV16阳性宫颈癌细胞的增殖和细胞凋亡密切相关 ,AE6可通过诱导 Si Ha细胞凋亡而抑制其生长 ,它的分子克隆有助于阐明宫颈癌发生的分子机制     

Effects of anti- HPV16E6- ribozyme on phenotype and gene expression of a cervical cancer cell line

Objective To investigate the effects of anti- HPV16E6- ribozyme (HRz) on phenotype and gene expression of a cervical cancer cell line. Methods HRz was designed by computer programs.HRz’s activity was identified by cleavage experiments in vitro.HRz and empty eukaryotic plasmids were transfected into CaSKi cells with lipofectin, then renamed CaSKi- R and CaSKi- P, respectively. The expression of ribozyme in transfected cells was observed by RNA dot blot.The amounts of E6 mRNA in three kinds of cells lines were detected by Northern blot.Cell growth curves and soft agar forming ability were studied.The ability of each cell line to form tumors was assessed in nude mice.Apoptosis rates and expression of c- myc, bcl- 2, p53 and Fas were detected by flow cytometry (FCM).Antigens of tumor cells, HLA- 1, HLA- 2, B7- 1 and B7- 2 were also detected.NK, LAK, and CD3AK cells were induced.Their cytotoxicities were detected in CaSKi- R, CaSKi- P, and CaSKi cells. Results In vitro cleavage reaction demonstrated that HRz could cleave HPV16E6 mRNA in a site- specific manner.HRz could be expressed stably in transfected CaSKi cells.Northern blot analysis showed that E6 mRNA levels were lower in CaSKi- R than in CaSKi.The growth rate of CaSKi- R was slower than those of CaSKi and CaSKi- P.The soft agar- forming rate of CaSKi- R was lower compared with those of CaSKi and CaSKi- P cells.The ability of CaSKi- R to form tumors in nude mice was also poor.The apoptosis rate of CaSKi- R cells was much higher than those of CaSKi and CaSKi- P.HRz could reduce the expression of E6, c- myc and bcl- 2 proteins, and increase the expression of p53 as well.HRz could increase the expression of HLA- 2, B7- 1 and B7- 2 antigens.The cytotoxicity of NK, LAK and CD3AK cells was much higher in CaSKi- R than in CaSKi- P and CaSKi cells.Conclusion HRz not only reverses the malignant phenotype of CaSKi cells partially, but also induces apoptosis in the cells, and increases sensitivity of CaSKi cells to immune cells.     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞放疗影响的研究

目的人乳头瘤病毒（HPV）是官颈癌最主要的致病因素，E6是主要的致癌基因之一，高危HPV基因型，如HPV16的E6蛋白表达水平是维持宫颈癌恶性表型的必要条件；放射治疗是目前宫颈癌治疗的标准和有效的方法；该研究旨在探讨抗HPV16E6核酶（ribozyme）对宫颈癌CaSKi细胞放疗敏感性的影响。方法以脂质体法将抗HPV16E6-ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞，命名为CaSKi—R、CaSKi—P细胞。点杂交交检测核酶在细胞中的表达，Northem杂交检测3种细胞中E6基因的表达。用克隆形成试验检测3种细胞对放疗的敏感性，Annexine/PI双标法检测细胞凋亡率，流式细胞术检测bcl-2、p53、bax蛋白表达。结果点杂交证实核酶能在CaSKi—R细胞中稳定表达，Northern杂交证实CaSKi-R中E6表达较CaSKi—P、CaSKi中明显降低。CaSKi—R细胞生长速度较CaSKi-P、CaSKi明显减慢（P〈0.01）；CaSKi-R细胞对X射线的敏感性较CaSKi—P、CaSKi明显增加，克隆形成率明显下降（P〈0．05），CaSKi-R细胞照射前后的凋亡率较x射线照射后CaSKi—P、CaSKi明显增加（P〈0．（31）；CaSKi—R细胞p53、bax蛋白表达较CaSKi—P、CaSKi明显升高山bcl-2明显减少（P〈0．01）。结论转染抗HPV16E6-Ribozyme的CaSKi—R细胞出现一定程度的生长抑制，且时放射治疗的敏感性增加。     

HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞凋亡及化疗敏感性的影响

目的：探讨HPV16E6对不同p53基因型的宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法：应用AO/EB染色结合荧光显微镜技术及Annexine V-FITC/PI双标法流式细胞仪检测不同浓度DDP干预前后宫颈癌细胞凋亡情况;Western印迹检测DDP干预后对HPV16E6和p53mt蛋白表达的影响;通过差异RT-PCR检测不同浓度DDP干预C33A,C33A-E6,C33A-P和CaSki4组细胞24和48h后HPV16E6基因mRNA表达的变化。结果：AO/EB染色和流式细胞术检测的C33A,C33A-E6,C33A-P,CaSki细胞随着DDP干预剂量的增大,凋亡率亦明显增加（P〈0.05）。Western印迹结果示C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6蛋白的表达随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长而逐渐降低甚至难以检测到表达（P〈0.01）,而未干预的对照组C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6的表达量稍有增加。C33A-E6,C33A和C33A-P3组细胞中均检测到p53mt的表达,但随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长,3组细胞总蛋白中p53mt的表达量均无明显改变（P〉0.05）。差异RT-PCR结果表明,在未予DDP干预的情况下,C33A-E6与CaSki细胞在24h时HPV16E6 mRNA的表达量无差异,而在48h时则C33A-E6细胞的HPV16E6 mRNA表达量显著高于CaSki细胞（P〈0.05）,且两组细胞48h的HPV16E6 mRNA表达均较24h显著增高（P〈0.05）;在24和48h两时间段内,随着DDP干预浓度的增加,两组细胞的HPV16E6 mRNA表达量均逐渐减少（P〈0.01）;但在同样浓度的DDP干预时,C33A-E6与CaSki的HPV16E6mRNA表达量无统计学差异（P〉0.05）。结论：HPV16E6基因对宫颈癌细胞株化疗敏感性的影响与p53的基因型（p53mt/p53wt）无明显关系,其可能通过其他作用机制对C33A细胞的凋亡和化疗敏感性产生作用。