抗肝癌单链双功能抗体在Hut-78细胞系中的表达及体外杀伤活性

目的 用携带分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因（sFv-TNF-α）的重组逆转录病毒感染T细胞淋巴瘤Hut-78细胞，使其表达并分泌针对人肝癌细胞的sFv-TNF-α融合蛋白，观察转导的T细胞对体外培养肝癌细胞的杀伤作用。方法 用感染性重组病毒产生细胞C22（PA317/PST）产生的病毒上清转导入T细胞淋巴瘤Hut-78细胞，采用PCR，RT-PCR，细胞原位杂交及免疫组织化学染色等方法，对转导的Hut-78细胞进行DNA，mRNA及蛋白水平的分析。转导的Hut-78细胞分别与SMMC-7721，HHCC共培养，MTT法检测Hut/PST细胞表达产物对两种肝癌细胞的杀伤作用。结果 PCR，RT-PCR结果显示转导Hut细胞中扩增出外源目的基因对应的电泳条带，neo基因探针原位杂交显示转导细胞质内有较强的紫蓝色阳性反应信号，其阳性率约为95%，鼠抗人TNF-α多克隆抗体免疫组织化学染色，转导细胞质内有明确的棕黄色阳性反应信号，MTT法检测结果，分泌型抗肝癌单链双功能抗体对体外培养的两种肝癌细胞的杀伤率分别为15.4%和26.5%。结论 分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因可以在T细胞中整合并稳定表达，其分泌的表达产物对两种肝癌细胞均具有一定的亲合活性，并且具有一定的体外杀伤作用。     

脐血单个核细胞体外扩增的实验研究

目的 :采用集落刺激因子体外扩增脐血单个核细胞 (CBMC) ,研究集落刺激因子对CBMC增殖活性的影响。方法 :用RPMI1 640培养液加入集落刺激因子IL - 3、SCF、GM -CSF及其组合 ,体外扩增CBMC ,健康成人外周血单个核细胞 (PBMC)作为对照组。结果 :加入不同集落刺激因子体外培养CBMC与PBMC后 ,增殖活性均有不同程度的升高 ,以加入IL - 3、SCF、GM -CSF组最为显著 ;CBMC的增殖活性与PBMC比较有显著性差异 (P<0 .0 5)。结论 :集落刺激因子可在体外扩增CBMC ,IL - 3、SCF、GM -CSF之间有明显的协同作用 ;与PBMC相比 ,CBMC有更高的增殖潜能     

树突状细胞体外激活的CTL杀伤效应

目的 :研究树突状细胞 (dendriticcell,DC)激活的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的特异性杀伤效应。方法 :从人外周血中分离出外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcell,PBMC) ,在GM -CSF和IL - 4的作用下培养 7天诱导出DC ,然后PBMC或DC为刺激细胞在体外诱导出HBsAg特异性CTL ;在调节好一定浓度靶细胞 (人肝癌细胞系HepG2及人肺腺癌细胞系A5 4 9)中加入效应细胞 (DC或PBMC) ,4 8h后瑞氏染色计数残存细胞数 ,计算杀伤率。结果 :DC激活的CTL对HepG2 杀伤率为 71.6 % ,而PBMC(APC ,非T细胞 )激活的CTL杀伤率为 4 3.8% ,两者有显著性差异 ,P <0 .0 1。此外 ,DC诱导的肝癌细胞抗原特异性CTL对肺癌细胞的杀伤率仅为 2 3%。结论 :DC诱导的CTL比PBMC高效 ,而且具有较高的特异性。     

催乳素对体外单独培养的Graves病外周血单个核细胞活化及增殖影响的研究

目的 :研究催乳素 (PRL)对体外单独培养的Graves病 (GD)外周血单个核细胞的活化及增殖有无直接影响。方法 :提取 12例GD患者和 8例正常健康对照的外周血单个核细胞 ,单用含不同浓度羊催乳素或植物血凝素的培养液进行体外培养。并利用流式细胞技术等测定其表面CD2 5的表达 (反映活化状态 )或细胞内DNA含量以计算增殖指数 (反映增殖状态 )。结果 :GD患者和正常人的外周血单个核细胞经 12 .5 10 0 0ng/ml羊催乳素作用后 ,其CD4+ CD2 5 + 细胞百分率、CD8+ CD2 5 + 细胞百分率及增殖指数均无明显变化 (P均 >0 .0 5 )。所设阳性对照植物血凝素 (5 μg/ml)能直接刺激这两种来源的单个核细胞发生活化、增殖 ,使上述各项指标均显著增高 (P均<0 .0 1)。结论 :催乳素不能刺激体外单独培养的GD外周血单个核细胞发生活化及增殖     

筛选抗HBV药物的外周血单个核细胞体外培养系统的建立

由于乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)宿主范围狭小 ,主要对人类和黑猩猩易感 ,因而为抗ＨＢＶ药物筛选的研究带来了很大的困难。本文探索建立了一种利用乙型肝炎病人外周血单个核细胞 (ＰＢＭＣ)进行体外培养来筛选抗ＨＢＶ药物的新系统 ,取得了一定的效果。1　资料和方法病例 :选自 1996年本科收治住院的慢性乙型肝炎病人 ,共 2 0例。ＰＢＭＣ分离与培养 :无菌抽取病人外周静脉血 10ｍｌ,常规法分离并培养ＰＢＭＣ ,连续培养 3天 ,分别收集培养上清及细胞 ,- 2 0℃保存备检。药物 :试验药物为磷甲酸钠 (ＰＦＡ)、阿昔洛韦、肝炎灵注射液、注射用蜂毒…     

细胞因子预处理对体外扩增NK 细胞活性的影响

目的 采集健康志愿者和肿瘤患者的外周血单个核细胞（PBMCs）进行自然杀伤细胞（NK）的 扩增培养,培养过程中白细胞介素IL-2、IL-12、IL-15、IL-18 以不同组合及不同方式添加,探究体外培养 NK 细胞的细胞因子最佳组合和添加方式。方法 根据细胞因子组合及添加方式的不同,将NK 培养分为3 组。 A 组：IL-2+IL-15 组,B 组：IL-2+IL-12+IL-15+IL-18 组,C 组：IL-12+IL-15+IL-18 预处理/IL-2 组。 培养过程中第7 天和第14 天分别取样统计各组细胞因子培养后的细胞数量,并使用流式细胞仪检测NK 细胞 表面分子表达;将NK 细胞与K562 细胞共培养,然后ELISA 测定NK 细胞的IFNγ 释放量,CSFE/7-AAD 法 检测NK 细胞的杀伤活性。结果 3 组不同的培养方式所得细胞的扩增倍数差异无统计学意义,随着培养时间的 增加,NK细胞的比例也逐渐上升,3组间NK细胞比例差异无统计学意义（P >0.05）。NK细胞表面CD25（IL-2Rα） 的表达情况比较,差异有统计学意义（P <0.05）,C 组的阳性率高于A 和B 组。IFN-γ 的释放量和NK 细胞的 体外杀伤活性一致,均为C 组高于A 和B 组。对肿瘤患者的NK 细胞,C 组的细胞因子添加方式也能很好的进 行扩增（CD3-CD56+ 细胞比例大于50%）。结论 C 组中的细胞因子预处理方式能够高效扩增NK 细胞,与A 或B 组联合添加的方式比较,该方式能显著激活NK 细胞的杀伤活性。     

CpG-ODN活化的外周血单个核细胞体外对肿瘤细胞杀伤效应的研究

目的探讨CpGODN体外活化的外周血单个核细胞（PBMC）后对肿瘤细胞的杀伤效应。方法CpG—ODN体外刺激人外周血单个核细胞（PBMC），将活化的PBMC与肿瘤细胞按50：1的比例共孵育72h后，以MTT和酶学检测活化的PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用。结果CpC—ODN诱导活化的PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用增强，而对正常肝细胞则无明显的杀伤作用。结论CpG—ODN可诱发机体免疫效应，提高对肿瘤细胞的杀伤作用。     

小剂量γ射线辐照外周血单个核细胞对人前列腺癌LNCaP细胞的杀伤作用

目的 观察小剂量γ射线辐照外周血单个核细胞对培养人前列腺癌细胞系LNCaP细胞的杀伤作用.方法 实验设LNCaP肿瘤细胞对照组、单纯外周血单个核细胞对照组、照射和未照射的外周血单个核细胞与肿瘤细胞共培养组,照射剂量为0.5-3 Gy,剂量率为17Gy/min.利用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染色法,观察外周血单个核细胞对LNCaP细胞的杀伤情况.结果 外周血单个核细胞在照射后各组培养至144 h均有大量细胞死亡.存活细胞明显少于未照射组,培养至240 h时,照射与非照射组中存活的外周血单个核细胞均减少,但是在照射的各组中减少更为明显.在外周血单个核细胞与LNCaP肿瘤细胞共培养组中,各照射组问在培养72 h内无明显差异,在共培养96～240 b时.0.5～2Gyγ射线照射外周血单个核细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用明显增强,尤其以1Gy照射组更为明显.而2.5与3Gyγ射线辐照组以及未照射外周血单个核细胞对肿瘤细胞的杀伤作用明显低于0.5～2 Gy各组,在培养至240h时,仍有肿瘤细胞存活并出现增生.结论 γ射线辐照对某些外周血单个核细胞有损伤作用,0.5～2Gyγ射线辐照的外周血单个核细胞杀伤肿瘤细胞活性增强,而2.5Gy和3Gyγ射线辐照对分离后的外周血单个核细胞对肿瘤细胞杀伤有抑制作用.     

体外人类单个核细胞表达降钙素原

降钙素原(PCT)为降钙素的前体物质，已证实其在系统性细菌感染中的诊断价值，但目前对于其体内的主要产生部位不明，由于外周血单个核细胞(PBMC)是细菌性感染的重要炎性细胞，故本文主要探讨了人类PBMC表达PCT的情况以及各种炎性因子对其表达的影响。通过逆转录一多聚酶联反应(PT-PCR)发现：人类PBMC是产生PCT的主要场所之一，细菌脂多糖(LPS)、IL-1β、IL-2、IL-6以及TNF-α可显著增强PBMC表达PCT的mRNA，而IL-10则无明显的影响。     

尼古丁对体外培养人外周血单个核细胞分泌TNF的影响

OBJECTIVE: To observe the effect of nicotine on the secretion of TNF of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in vitro, and explore the possible mechanism of the high level of TNF caused by smoking. METHODS: Twenty-one non-smokers and 19 smokers were studied. The PBMCs isolated from each volunteer's blood sample were distributed to three groups, and cultured for 72 hours in supplemented RMPI 1640 alone or in supplemented RPMI 1640 containing 50 ng.ml-1 nicotine or 500 ng.ml-1 nicotine respectively. The level of TNF in supernate was quantified with the immuno-radioassay, and PBMC proliferation was observed. RESULTS: The level of TNF spontaneously secreted by PBMCs in smokers was significantly higher than that in non-smokers (P < 0.05). When the concentrations of nicotine were 50 ng.ml-1 and 500 ng.ml-1, the level of TNF increased significantly in non-smokers (P < 0.05, P < 0.01). In smokers, the level of TNF significantly increased when the concentration of nicotine was 50 ng.ml-1; however, the level of TNF significantly decreased (P < 0.05), and the proliferation of PBMCs was inhibited when the concentration of nicotine was 500 ng.ml-1 (P < 0.05, P < 0.05). The level of TNF was positively correlated to the multiple of PBMC proliferation (r = 0.93, P < 0.05). The linear regression equation was Y = 2.913X - 2.955. CONCLUSION: Nicotine can induce PBMCs to secrete more TNF, and the magnitude of the effect is strongly related to the dosage of nicotine, but a great dose of nicotine will inhibit the production of TNF.     

长链非编码RNA在类风湿性关节炎患者和健康人PBMCs中差异表达及其发病机制

目的 探究长链非编码RNA(IncRNA)在类风湿性关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMCs)和健康人PBMCs中的差异表达,并对其分析以进一步阐明RA的发病机制.方法 选取2016年1-4月在该院风湿免疫科就诊的RA患者22例作为观察组,22例健康人作为对照组.采用Agilent Human IncRNA芯片测定5例RA患者和5例健康人的PBMCs中的In-cRNA和mRNA的差异表达;利用GO以及Pathway分析检测出差异表达的IncRNA的功能分布,构建起IncRNA-mRNA的共表达网络,采用Trans-与Cis-预测其中与RA发病相关的IncRNA.结果 IncRNA在RA患者的PBMCs和健康人的PBMCs中共存在1 623条差异表达,mRNA差异表达则有851条.GO、Pathway分析表明,差异表达的mRNA的主要功能是参与蛋白激酶、核苷酸、金属离子的结合和转录调节,还参与B细胞受体信号通路、TNF信号通路的调节.经过Cis-和Trans-分析预测和Re-al-time PCR验证后找到3个IncRNA可能与RA发病有关,分别为NONHSAT 120696、uc.80+、NONHSAT 031501.结论 IncRNA在RA患者PBMCs和健康人PBMCs中存在差异表达,NONHSAT 120696、uc.80+、NONHSAT 031501 3个IncRNA可能与RA的发病有关.     

胃癌细胞FoxP3的表达及其与外周血单个核细胞（PBMCs）的相互作用

 目的 检测叉头样蛋白3(forkhead box protein 3,FoxP3)在胃癌细胞中的表达分布,并探讨其在外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)和胃癌细胞共培养过程中的作用。方法  应用免疫荧光技术检测FoxP3蛋白的表达定位;建立胃癌细胞和PBMCs的体外共培养体系,然后用CCK-8法检测共培养后胃癌细胞的生长抑制情况;通过Real-time PCR技术检测共培养后胃癌细胞和PBMCs中FoxP3 mRNA表达情况;并采用流式细胞技术和Western blot技术检测共培养后两种细胞中FoxP3蛋白表达情况。结果  FoxP3表达于胃癌细胞的胞质和胞核。胃癌细胞与PBMCs共培养时能明显抑制胃癌细胞的增殖。直接和间接共培养后MKN28胃癌细胞的FoxP3蛋白的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)均增加(P=0.031;P=0.015);与单培养相比,来源于胃癌患者和健康对照组的淋巴细胞与胃癌细胞共培养后其FoxP3 MFI均明显增加(P=0.016; P=0.034),且IL-2能促进间接培养条件下PBMCs的FoxP3表达(P=0.024),而对直接共培养影响不大。共培养后胃癌细胞的FoxP3 mRNA和蛋白表达均增加,直接共培养较间接共培养增加更明显(P=0.035)。结论  胃癌细胞与PBMCs的相互作用主要依赖细胞间的直接接触方式,FoxP3的表达变化在这一过程中发挥了重要作用,这可能跟肿瘤免疫逃逸有关。     

无症状乙型肝炎病毒携带者外周血单个核细胞分泌细胞因子的研究

目的 通过分析乙型肝炎病毒无症状携带者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)分泌的细胞因子,探索乙肝病毒慢性感染的病理机制.方法 用不同的抗原物质及抗体刺激培养肝炎病毒无症状携带者PBMCs,ELISA检测细胞培养上清中不同的细胞因子水平.结果 HBV携带者PBMCs细胞分泌的IFN-γ、IL-12明显比健康对照组减少,而TGF-β和IL-10等细胞因子的水平则明显升高;用抗体同时中和TGF-β和IL-10才能恢复IFN-γ的表达水平,而低剂量的外源性IL-12协同乙肝抗原能促进PBMCs抗原特异性T细胞分泌IFN-γ.结论 PBMCs分泌IL-12减少可能是乙肝病毒携带者长期带毒的根本原因,联合使用IL-12和乙肝特异性抗原可促进乙肝病毒携带者PBMCs的细胞免疫功能.     

PBMCs和血浆中HCV基因型的临床意义

目的检测HCV感染者血浆和PBMCs中HCV基因型的相关性，同时研究不同型的HCV与丙型肝炎病情的关系。方法应用特异性限制性片段长度多态分析（PFLP）一酶切分型法。结果在82例血浆HCVRNA阳性的病例中Ⅱ型为37例，Ⅲ型为34例，Ⅱ／Ⅲ型为11例。在PBMCs中HCVRNA为阳性的为54例，其中Ⅱ型为38例，Ⅲ型为12例，Ⅱ／Ⅲ型为4例。结论HCV感染人体后，不但在血浆中可以检测到HCVRNA，而且也可以在PBMCs中检测到HCVRNA。同时HCVⅡ型比Ⅲ型更易感染PBMCs，并且HCVⅡ型感染者易出现慢性持续性感染，以至于发展为肝硬化。     

血细胞分离机大量采集实验猕猴外周血单核细胞方法探讨

目的 使用COBE Spectra血液成分分离机大量采集实验猕猴外周血单核细胞(PBMCs),继而可从中分离得到外周血造血干细胞(PBSC),为进一步利用猕猴开展免疫学研究、基因治疗提供足够的目的 细胞,探讨采集的关键技术,建立安全、有效的采集方法.方法 体重为4-5奴的实验猕猴5只,采集前一个月内分3次进行自体或异体血液于4℃储备共120 mL,用于采集时填充管路.5只猴采集前接受rhGM-CSF 20μg/ks皮下注射动员4～5 d,麻醉动物后行股动脉穿刺,选择自动外周血干细胞收集程序(Auto-PBSC)进行采集.采集结束后管路中血液以10 mL/min回输给动物3～5 min.结果 生长因子连续注射第4天外周血白细胞数增至最高,收获细胞数量随循环血量和采集次数增加而增多.经动员的所有猴能够采集到需要的PBMC,最多达9.9×108,采集次数1～3次,循环血量达750～1420 mL,实验结束后1只猕猴因心脏衰竭死亡.结论 人用血细胞分离机可用于4～5 kg实验猕猴PBMC的大量采集.由于动物不同于人体,为保证采集成功需要选用适合于猕猴的程序,采集前做好储血和生长因子动员准备,稳定的麻醉保定,提高抗凝剂比例,积极处理并发症是关键.     

Ⅰ型糖尿病患者单个核细胞对大鼠胰岛素分泌的影响

目的 :探讨Ⅰ型糖尿病患者发病过程中的细胞免疫变化。方法 :采集新发病及病程较长的Ⅰ型糖尿病患者和Ⅱ型糖尿病患者的外周血单个核细胞 (PBMCs)与新生大鼠的胰岛细胞共同培养 2 4h ,观察PBMCs对胰岛素分泌的影响。用正常人的PBMCs作对照。结果 :只有初发病的Ⅰ型糖尿病患者的PBMCs对大鼠胰岛素的分泌有抑制作用 ,表现为刺激后胰岛素分泌减少 ((12 7 4± 2 6 .3)mU/L(n =12 )Vs(2 0 9.6± 41.8)mU/L(空白对照n =6 )及(2 0 0 9± 41 7)mU/L(健康对照n =5 ) ,P <0 .0 5 )。结论 :初发病的Ⅰ型糖尿病患者存在细胞免疫的异常 ;且这种异常主要存在于发病前后的较短的时间内 ;这种异常可能是机体胰岛功能减退的原因之一。     

I型糖尿病患者单个核细胞对大鼠胰岛素分泌的影响

目的：探讨Ⅰ型糖尿病患者发病过程中的细胞免疫变化。方法：采集新发病及病程较长的Ⅰ型糖尿病患者和Ⅱ型糖尿病患者的外周血单个核细胞(PBMCs)与新生大鼠的胰岛细胞共同培养24 h,观察PBMCs对胰岛素分泌的影响。用正常人的PBMCs作对照。结果：只有初发病的Ⅰ型糖尿病患者的PBMCs对大鼠胰岛素的分泌有抑制作用,表现为刺激后胰岛素分泌减少((127.4±26.3)mU／L(n=12)Vs(209.6±41.8)mU／L(空白对照n=6)及(200.9±41.7)mU／L(健康对照n=5),P＜0.05)。结论：初发病的Ⅰ型糖尿病患者存在细胞免疫的异常;且这种异常主要存在于发病前后的较短的时间内;这种异常可能是机体胰岛功能减退的原因之一。     

抗人肝细胞癌单链抗体基因的构建和表达

目的：构建抗人肝细胞癌单链抗体基因，并在大肠杆菌中表达．方法：采用RT-PCR法扩增抗体重链和轻链可变区基因，用(Gly4Ser)，肽段连接VH基因和VL基因，构建克隆载体，将测序完全正确的ScFv基因克隆到分泌性表达载体pCANTAB 5E中诱导表达转化的TG1和HB2151细胞．用SDS-PAGE和免疫组化方法分析检测表达产物．结果：DNA测序证实ScFv基因结构正确，可在大肠杆菌中成功表达，游离ScFv相对分子质量大约为30ku，与HC-108，HepG-2和SMMC-7721肝癌细胞有特异性的结合反应．结论：重组制备的抗人HCD78分子单链抗体在人肝癌的基础和临床研究中具有潜在的应用价值．