外周血K-ras基因突变检测在胰腺癌诊断中的应用

目的 检测胰腺癌患者外周血K-rag基因第12、13密码子突变,探讨其对胰腺癌的诊断价值.方法 选取经病理证实的胰腺癌患者54例以及健康志愿者33例.抽取全部实验者外周血标本,抽提循环中的DNA,应用肽核酸钳制实时定量PCR法检测K-rag基因突变,并分析其与患者临床病理参数的相关性.结果 54名胰腺癌患者中,40例(74.1%)外周血标本可检测出K-ras基因第12或13密码子突变.33名健康志愿者外周血标本无一例检出K-ras基因突变.外周血中K-ras基因的突变与患者年龄、淋巴血管侵犯、肿瘤分化程度、肿瘤临床分期、CA19-9水平有关(P＜0.05),而与患者性别、肿瘤部位、肿瘤大小及病理类型无关.结论 肽核酸钳制实时定量PCR法检测外周血K-ras基因突变的敏感性高.外周血K-ras基因突变的检出提示肿瘤具有高侵袭性,可能预后不良.     

胰腺癌及相关胰腺疾病组织中K-ras12、13密码子突变的检测及其临床诊断价值

目的 研究K-ms基因第12、13位密码子突变在胰腺导管腺癌及相关胰腺疾病组织中的定量检测及其临床意义.方法 收集经手术切除的130例(胰腺导管腺癌105例,胰腺腺鳞癌8例,胰腺黏液腺癌2例,内分泌癌3例,十二指肠及壶腹部恶性肿瘤6例,胰腺良性疾病6例)有明确病理诊断的组织标本及临床资料,应用双荧光探针联合肽核酸钳制实时定量PCR方法检测组织中K-ras基因第12、13密码子的突变量,以突变量＞100拷贝为阳性计算突变阳性率.结果 胰腺导管腺癌、腺鳞癌、黏液腺癌、内分泌癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤、胰腺良性疾病的K-ras12密码子突变量的中位数及四分位数分别为4062(495,10800)、238(45,8420)、15(9,21)、3(3,16)、2283(73,5037)和21(8,56);突变阳性率分别为84.8％ (89/105)、50.0％(4/8)、0、0、66.7％ (4/6)和16.7％(1/6).胰腺导管腺癌的K-ras12密码子突变量及阳性率与胰腺腺鳞癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤差异无统计学意义,而较胰腺黏液腺癌、内分泌癌、胰腺良性疾病显著增加(P值均＜0.05).通过接受者操作特征(ROC)曲线分析,胰腺导管腺癌K-ras 12密码子突变的曲线下面积为0.727,诊断胰腺导管腺癌的敏感性及特异性分别为84.8％、64.0％.胰腺导管腺癌的K-ras基因第12密码子突变量与患者生存期显著相关.胰腺导管腺癌的K-ras 13密码子突变量及阳性率与其他胰腺疾病的差异无统计学意义.结论 K-ras12密码子基因突变对胰腺癌有较好的鉴别诊断及患者预后判断价值.     

胰腺超声内镜细针穿刺活检组织中粘蛋白表达检测辅助诊断胰腺癌的价值评价

目的 检测粘蛋白（MUCl、MUC2、MUC5AC）在胰腺超声内镜细针穿刺（EUS-FNA）组织标本中的表达，评价其对胰腺癌辅助诊断的价值。方法 收集54例胰腺占位病变的EUS-FNA组织标本，采用S-P免疫组化法检测粘蛋白（MUCl、MUC2、MUC5AC）的表达，根据临床综合判断的诊断，与细胞学检查结果比较，评价其诊断价值。结果 54例患者最后确诊为胰腺癌38例，胰腺良性肿瘤6例，慢性胰腺炎10例。细胞学和组织学的诊断敏感性分别为31．6％和47．4％。MUC1、MUC2、MUC5AC在胰腺癌EUS-FNA标本组织中的阳性表达率为81．6％（31／38）、10．5％（4／38）、84．2％（32／38），在胰腺良性疾病组织标本中分别25％（4／16）、31．3％（5／16）、43．8％（7／16），其中MUCl和MUC5AC两组间差异有统计学意义（P〈0．01）。MUCl的表达与胰腺癌的临床分期、淋巴结转移呈正相关。将细胞组织学检查结合MUCl和MUC5AC表达检测诊断胰腺癌的敏感性可提高至89．5％。结论胰腺EU$-FNA组织标本中MUCl、MUC5AC的检测对胰腺癌有临床辅助诊断价值，且MUCl还能预测胰腺癌的临床分期及淋巴结转移。     

胰液端粒酶和K-ras基因检测对胰腺癌的诊断价值

目的探讨胰液端粒酶活性与K-ras基因突变联合检测对胰腺癌患者诊断价值。方法收集25例胰腺癌和21例慢性胰腺炎患者胰液,K-ras基因突变采用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)检测,端粒酶活性检测采用端粒末端重复序列扩增技术(TRAP)。结果胰腺癌中K-ras基因突变率为88.0%(22/25),慢性胰腺炎中K-ras基因突变率仅为19.0%(4/21),P<0.01;在25例胰腺癌中端粒酶阳性检出率为84.0%(21/25);而21例慢性胰腺炎胰液中端粒酶阳性检出率为28.6%(6/21),P<0.01。K-ras基因突变或端粒酶活性阳性检测诊断胰腺癌的特异、敏感性分别为92%,66.7%;两者联合检测诊断胰腺癌的敏感性为80.0%,特异性达到85.7%。结论联合检测胰液中K-ras基因、端粒酶活性可提高胰腺癌诊断的敏感性和特异性,对胰腺癌筛查、诊断和鉴别诊断有一定临床意义。     

胰腺癌组织K-ras基因第12密码子突变的定量检测

目的 检测胰腺癌及相应癌旁组织K-ras基因第12密码子的突变量,分析其与胰腺癌临床病理参数的关系.方法 应用肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)钳制双荧光标记探针的实时定量PCR法检测93例胰腺癌组织及其癌旁组织中K-ras基因第12密码子的突变拷贝数,以突变百分率表示突变量.K-ras基因突变百分率=K-ras突变型拷贝数/(K-ras野生型拷贝数+K-ras突变型拷贝数)×100%.结果 胰腺癌及其癌旁组织的K-ras基因第12密码子突变率分别为83.9%和65.6%,相差显著(P＜0.05);它们的突变量分别为(13.385±1.745)%和(2.246±0.728)%,相差亦显著(P＜0.05).K-ras基因第12密码子突变量与临床病理参数无关.结论 胰腺癌及相应癌旁组织不仅存在K-ras基因突变率的差异,亦存在K-ras基因突变量的差异.     

PCR-MASA检测胰腺癌外周血K-ras基因点突变的研究

目的了解胰腺癌外周血中K-ras基因点突变检测的临床价值.方法采用PCR-MASA法检测胰腺癌患者外周血中K-ras基因点突变.结果胰腺癌外周血标本中K-ras基因点突变率为38.1%(8/21),而所有被检测的急、慢性胰腺炎、胰岛素瘤、壶腹癌、十二指肠乳头癌、胆管癌及胆石症患者外周血标本均无K-ras基因突变.结论(1)PCR-MASA方法简捷、特异、敏感,扩增产物只需常规电泳、染色即可观察结果,无需酶切、杂交、放射性和非放射性显影;(2)对外周血标本检测K-ras基因第12位密码子有无突变,具有临床实用性,有助于判断胰腺病变良恶性及胰腺癌的早期诊断.     

胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤患者K-ras基因的突变

目的探讨K-ras基因在胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN)组织中的突变情况。方法采用荧光定量PCR法检测31例IPMN组织内K-ras基因突变情况,分析突变与临床特征的关系。结果 31例样本共检测10例(32.26%)发生K-ras基因突变,其中胰胆管型突变率5例、胃型2例、肠型2例、嗜酸细胞型1例,各临床分型差异显著(P0.05)。浸润型突变率(85.7%)明显高于非浸润型(16.7%,P0.01);不同分化类型差异有统计学意义(P0.001)。结论 IPMN存在K-ras基因突变,突变与IPMN分型、分化及浸润有关。     

超声内镜引导下细针穿刺活检在胰腺肿瘤诊断中的价值

超声内镜引导下细针穿刺活检(endoscopic ultrasoundguided fine needle aspiration biopsy,EUS-FNAB)是在EUS的基础上获得细胞学诊断,故扩展了EUS的应用。自从1992年Vilmann首先成功报道对胰腺的EUS-FNAB后,其在胰     

超声内镜下细针穿刺活检术对胰腺囊性病变的诊断价值

目的 探讨超声内镜引导下细针穿刺活检术(EUS-FNA)及细胞块对胰腺囊性病变的诊断价值.方法 回顾性分析2010年1月至2012年12月行传统影像学检查(CT、MRI、B超)、EUS-FNA的15例胰腺囊性病变的临床资料,其中8例行液基细胞学(LBC)、细胞块检查.同时,比较4种检查技术在胰腺囊性病变中的诊断价值.结果 假性囊肿7例,黏液性囊腺瘤2例,胰腺导管内乳头状黏液瘤(IPMN)1例,胰腺癌3例,囊腺癌2例.传统影像学、EUS-FNA、LBC、细胞块的诊断正确率为53.3％、86.7％、75.0％、100.0％,差异有统计学意义(P＜0.05).EUS-FNA较单纯传统影像学的灵敏度、特异度、约登指数均高(86.7％、75.0％、0.62与53.3％、58.3％、0.12),细胞块较LBC灵敏度高(100.0％与75.0％).结论 EUS-FNA及细胞块可提高诊断胰腺囊性病变的准确率.     

K-ras基因点突变对胰腺癌的诊断价值

背景传统的放射或超声检查早期诊断胰腺癌非常困难.目的研究胰腺良、恶性病变中的K-ras基因12密码子点突变情况,探讨K-ras基因点突变对早期胰腺癌的诊断价值.方法取23例胰腺癌和12例胰腺良性病变标本,经DNA提取后,行半巢式聚合酶链反应(PCR),扩增产物借助聚丙烯酰胺凝胶电泳检测有无K-ras基因点突变.结果胰腺癌和胰腺良性病变石蜡包埋组织的K-ras基因12密码子点突变率分别为65.2%(15/23)和33.3%(4/12)(P＜0.05).结论K-ras基因12密码子点突变的检测可能有助于胰腺癌,尤其是早期胰腺癌的诊断.     

胰管刷检标本K-ras基因突变检测在胰腺癌诊断中的价值

目的 探讨胰管刷检标本K-ras基因突变检测在胰腺癌诊断中的价值。方法 应用突变富集聚合酶联反应（PCR）－单链构象多态性（SSCP）法，检测胰腺疾病胰管刷检标本K-ras基因第一外显子第12密码子点突变。结果 35例胰管刷检标本PCR扩增均获成功，成功率为100％。20例胰腺癌中14例K-ras突变（70％），7例慢性胰腺炎中1例K-ras突变（14％），两组间差异有显著性（P＜0．05）。胰腺囊腺瘤，十二指肠乳头癌均未见K-ras突变。胰管刷检标本K-ras突变与胰腺癌部位无关。胰管刷检K-ras突变检测诊断胰腺癌的敏感性，特异性和准确性分别为70％，90％和83％。结论 检测胰管刷检标本中K-ras基因突变有助于胰腺癌的诊断，具有良好的临床应用前景。     

胰腺癌患者胰液中K-ras基因突变的检测及其意义

目的 通过对经逆行胰胆管造影（ＥＲＣＰ）所获胰液的Ｋ－ｒａｓ基因突变检测,以探索胰腺癌诊断的新方法。方法 应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）－限制性片段长度多态性的方法检测胰腺良、恶性疾病组织物、胰液上清和细胞的Ｋ－ｒａｓ突变。结果 胰腺癌和胰腺良性疾病标本分别有７１％（１５／２１）,而胰腺良性疾病无一例有Ｋ－ｒａｓ的突变。用胰液细胞有４％ＰＣＲ未能获得成功,胰腺癌胰液细胞Ｋ－ｒａｓ的突变率为６５％（１１     

Clinical significance of K-ras and c-erbB-2 mutations in pancreatic adenocarcinoma and chronic pancreatitis

Background: The differentiation of chronic pancreatitis (CP) from pancreatic adenocarcinoma (PA) remains the great challenge for clinicians. The purpose of this study was to compare the prevalence of K-ras and c-erbB-2 mutations in PA and CP in order to evaluate their usefulness in differential diagnosis of those diseases. Methods: The study included 49 patients who underwent Whipple resection or distal pancreatectomy for pancreatic adenocarcinoma (26 subjects) or chronic pancreatitis (23 subjects). DNA from pancreatic tissue was analyzed for K-ras codon 12 and c-erbB-2 mutations with PCR amplifications. Results: The K-ras gene mutation has been shown in 20 (76.9%) PA cases and in 8 (34.8%) CP cases (p<0.01). Prevalence of c-erbB-2 amplification in patients with PA was 17 (65.3%), which was not different from CP, 16 (56.5%) (p=0.58). There was a significant correlation between K-ras mutation and lymph node metastases (p=0.025) as well as between K-ras mutation and G3 tumor differentiation (p=0.037). Overall median survival in patients with PA was 9.5 mo. There was no relationship between presence of K-ras (p=0.58) or c-erbB-2 (p=0.17) mutation and survival time in PA patients. Conclusion: Those results may indicate that both K-ras and c-erbB-2 play a role in pancreatic carcinogenesis, however only K-ras may provide an additional tool in differential diagnosis of CP and PC.     

K-ras mutations in the bile of patients with primary sclerosing cholangitis

BACKGROUND AND AIMS: The development of cholangiocarcinoma (CCC) is a complication of primary sclerosing cholangitis (PSC). To date, no reliable factors have been described which can define those PSC patients at high risk for the development of CCC and the clinical diagnosis of CCC in PSC patients is difficult. Therefore, molecular markers of cholangiocarcinogenesis, such as K-ras mutations, may improve the early diagnosis of CCC or the timing of liver transplantation. METHODS: K-ras mutations were analysed by enriched polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism in the bile fluid of 56 PSC patients and 20 patients with other cholestatic diseases. To assess the value of K-ras mutations as a risk factor for cholangiocarcinogenesis, patients were prospectively investigated over a mean period of 31.5 months. RESULTS: In contrast with the control group, 17 (30%) patients with PSC revealed K-ras mutations in bile fluid. The mean Mayo score was not significantly different between PSC patients with (mean score 0.70) and without (mean score 0.13; p=0.2) K-ras mutations. In contrast with the group of PSC patients without K-ras mutations, four CCCs and two dysplasia were diagnosed in the group of patients with K-ras mutations during the follow up investigation (p<0.001). CONCLUSIONS: Our results indicate that K-ras mutations in bile fluid of PSC patients represent frequent early events during cholangiocarcinogenesis. However, most of the PSC patients with K-ras mutations remained tumour free after a long follow up investigation which is in agreement with the fact that these mutations are not specific for malignancy but may also occur in normal bile duct mucosa or in dysplasias. Therefore, analysis of K-ras mutations in bile should not be used for diagnosis of CCC in PSC patients. However, the results of our prospective follow up investigation indicate that K-ras mutations in bile fluid of PSC patients have to be considered as risk factors for the development of CCC which may have implications for the timing of liver transplantation.     

胰腺癌组织SPARC基因CpG岛甲基化状态及临床意义

目的 检测胰腺癌SPARC基因CpG岛的甲基化状态及其与临床病理参数的关系.方法 收集17例胰腺癌及相应癌旁组织、6例CP和6例正常胰腺组织以及6例健康成人外周血液标本,抽提DNA,进行亚硫酸氢盐修饰,然后行甲基化特异性PCR,检测SPARC基因第一外显子区CpG岛的甲基化状态,并分析与肿瘤病理参数的关系.结果 健康人外周血白细胞DNA中SPARC基因第一外显子区CpG位点均无甲基化.正常胰腺、CP、胰腺癌及相应癌旁组织SPARC基因第2、3、4、5、6、7 CpG位点的甲基化率分别为61.6%、47.1%、37.5%、24.7%;第1,8、9、10、11、12 CpG位点的甲基化率分别为52.0%、28.7%、16.7%和0.胰腺癌SPARC基因甲基化率与正常胰腺、CP比较均差别非常显著(P＜0.001),与相应癌旁组织比较差别不显著.胰腺癌SPARC基因CpG岛甲基化与患者性别、年龄、危险诱因(如长期吸烟或饮酒、CP)、肿瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴结转移等均无显著差异.结论 胰腺癌SPARC基因第一外显子区CpG岛为高甲基化状态,可能为胰腺癌发生、发展的早期事件.     

顺序特异性引物法快速检测胰腺癌K—ras基因点突变

目的：研究简捷、特异、敏感的检测胰腺癌K－ras基因点突变的方法及其在胰腺疾病中定性诊断的价值。方法：采用针对K－ras基因点突变方式（CGT、GAT、GTT）设计的顺序特异性引物（SSP），先后对胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液进行多聚酶链反应（PCR），扩增产物借助常规电泳和染色检测有无K－ras基因突变及突变方式。结果：胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液中K－ras基因点突变率分别为74．2％、95．1％、91．4％及94．1％，而所有被检测的慢性胰腺炎、胰岛素瘤、壶腹癌、胆管癌、十二指肠乳头癌及外伤胰腺的组织标本和胰液标本均无K－ras基因突变发生。结论：该检测法简便、快速、特异、敏感，具有临床实用性，可以作为鉴别胰腺肿块良恶性和诊断胰腺癌的一种方法。     

短发夹RNA对胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因表达的影响

目的:研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人胰腺癌细胞PANC-1中突变型K-ras基因表达的抑制作用.方法:构建特异性针对胰腺癌PANC-1细胞突变型K-ras基因的重组质粒pGensil-1-P1,阴性对照质粒pGensil-1-HK并采用脂质体介导的方法转染胰腺癌细胞.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测K-ras基因mRNA和蛋白的表达,CCK-8方法测量细胞生长曲线.并建立人胰腺癌细胞PANC-1裸鼠皮下移植瘤模型,分别注射Pgenesil-1-P1、Pgenesil-1-HK质粒,动态观察并处死裸鼠计算肿瘤体积.结果:测序证实质粒表达载体构建成功,短发夹RNA(shRNA)使胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因的mRNA较未治疗组、阴性对照组相比明显减少(P=0.01);未治疗组、阴性对照组及治疗组的K-ras蛋白表达率分别为100%,99.0%±0.73%,39.9%±2.1%,前两组K-ras蛋白表达差异无统计学意义,治疗组较未治疗组K-ras蛋白表达下调了约60.1%;细胞生长受到明显抑制(P=0.02);经重组质粒治疗14 d后,裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,相较于对照组瘤体明显缩小(P=0.03).结论:shRNA对特异性转染组的胰腺癌细胞的突变K-ras基因表达有抑制作用,使细胞以及裸鼠移植瘤的生长受到抑制.