胰腺癌细胞株原钙黏附蛋白8基因的甲基化状态

目的 分析原钙黏附蛋白8(protocadherin 8,PCDH8)基因在胰腺癌细胞株的甲基化状态.方法 抽提6株胰腺癌细胞株PANC1、ASPC1、BxPC3、CFPAC、PaTu8988、SW1990和2例正常胰腺组织的总RNA,以甲基化特异性PCR(MSP)法检测PCDH8甲基化情况.应用DNA甲基化转移酶(DNMT)抑制剂5-氮杂2'-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理6株胰腺癌细胞株,采用实时定量PCR法检测处理前后细胞的PCDH8 mRNA表达.结果 2例正常胰腺组织PCDH8基因未发生甲基化,PANC1、BxPC3、CFPAC胰腺癌细胞株PCDH8基因部分甲基化,而PaTu8988、ASPC1、SW1990细胞完全甲基化.PCDH8mRNA在PANC1、SW1990、PaTu8988胰腺癌细胞株中有表达,表达的相对值(RQ)分别为1.576±0.648、0.013±0.008、0.002±0.001;BxPC3、CFPAC、ASPC1细胞株无PCDH8 mRNA表达.5-Aza-dC处理后,胰腺癌细胞株PANC1、ASPC1、BxPC3、CFPAC、PaTu8988、SW1990均有PCDH8 mRNA表达,表达量较处理前明显升高,相对表达量分别为7.463±2.628、10.696±1.539、7.852±2.762、421.815±1.493、118.595±4.089、6.690±1.884.结论 PCDH8基因启动子高甲基化是导致该基因在胰腺癌细胞株表达下降的主要原因之一.     

胰腺癌细胞株中Elastase 3B基因启动子异常甲基化研究

目的 探讨Elastase 3B(ELA3B)基因在胰腺癌中低表达的分子机制.方法 应用RT-PCR方法检测2例正常胰腺组织和BxPC、CFPAC、PaTu8988、PANC1、SW1990 5株胰腺癌细胞株ELA3B基因表达.利用去甲基化试剂5-氮-2'-脱氧胞嘧啶(DAC)处理细胞株,再检测ELA3B基因表达,并用甲基化特异性PCR检测和测序进行验证.结果 ELA3B在正常胰腺组织中表达,而在BxPC、CFPAC、PaTu8988、PANC1和SW1990 5株胰腺癌细胞株中均无表达.DAC处理后,BxPC、PaTu8988、PANC1和SW1990 4株胰腺癌细胞株表达ELA3B,而CFPAC仍不表达.正常胰腺组织和PANC1 ELA3B基因部分甲基化,而其他4株胰腺癌细胞株则高甲基化.结论 ELA3B基因启动子的高甲基化是导致该基因在胰腺癌中表达下降的主要原因之一.     

胰腺癌细胞株中Elastase 3B基因启动子异常甲基化研究

目的探讨Elastase 3B（ELA3B）基因在胰腺癌中低表达的分子机制。方法应用RT-PCR方法检测2例正常胰腺组织和BxPC、CFPAC、PaTu8988、PANC1、SW1990 5株胰腺癌细胞株ELA3B基因表达。利用去甲基化试剂5-氮-2′-脱氧胞嘧啶（DAC）处理细胞株,再检测ELA3B基因表达,并用甲基化特异性PCR检测和测序进行验证。结果ELA3B在正常胰腺组织中表达,而在BxPC、CFPAC、PaTu8988、PANC1和SW1990 5株胰腺癌细胞株中均无表达。DAC处理后,BxPC、PaTu8988、PANC1和SW1990 4株胰腺癌细胞株表达ELA3B,而CFPAC仍不表达。正常胰腺组织和PANC1 ELA3B基因部分甲基化,而其他4株胰腺癌细胞株则高甲基化。结论ELA3B基因启动子的高甲基化是导致该基因在胰腺癌中表达下降的主要原因之一。     

胰腺癌细胞株PANC1异常甲基化miRNA的分析

目的 分析胰腺癌细胞株PANC1与正常胰腺组织表达有差异的启动子区甲基化miRNA,寻找与胰腺癌相关的高甲基化miRNA.方法 抽提PANC1与正常胰腺组织基因组DNA,超声断裂.应用抗5-甲基化嘧啶核苷抗体和免疫磁珠法获取甲基化DNA片段.通过DNA甲基化芯片筛选出PANC1与正常胰腺组织表达差异的高甲基化miRNA,采用重亚硫酸盐修饰的PCR (BSP)和TA克隆测序的方法进行验证.提取胰腺癌细胞株BxPC3、CFPAC1、PANC1、SW1990基因组DNA,采用结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)验证芯片筛选出的差异表达的甲基化miRNA.结果 PANC1细胞与正常胰腺组织存在8个差异表达的甲基化miRNA,从中挑选出5个进行BSP+ TA克隆测序验证,其中miR-615、miR-663、miR-663b在PANC1细胞的甲基化率明显高于正常组织(60.6％比7.6％,88.8％比22.2％,94.4％比13.0％);miR-675的甲基化率与正常胰腺组织无明显差异(76.0％比100％);miR1826因测序结果误差较大而舍去.经COBRA验证,PANC1的上述4种miRNA均高甲基化;BxPC除miR-675外,其他3种均高甲基化;CFPAC1的miR-663、miR-663b高甲基化;SW1990的miR-615、miR-663高甲基化.结论 胰腺癌细胞株与正常胰腺组织间存在差异表达的高甲基化miRNA,其中miR-663高甲基化与胰腺癌可能相关.     

HOXA11基因启动子区甲基化是胰腺癌的潜在诊断标志物

目的 在胰腺癌中探讨HOXA11基因启动子区甲基化状态及其作为诊断标志物的可能性。方法 应用半定量RT-PCR和甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术检测8株胰腺癌细胞系中HOXA11的表达及启动子区甲基化情况，应用MSP在216例胰腺癌组织中检测HOXA11启动子区甲基化情况，并分析HOXA11启动子区甲基化与临床病理因素之间的相关性。结果 HOXA11在Panc3.11、Panc5.04、Panc10.05、BXPC3细胞中表达缺失，其MSP结果为完全甲基化。在SW1990、AsPC1中高表达，其MSP结果为非甲基化，在CFPAC1和MIAPaCa2细胞中表达减低，其MSP结果呈部分甲基化状态。应用5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-aza)处理细胞后，HOXA11在Panc3.11、Panc5.04、Panc10.05、BXPC3细胞中恢复表达，在CFPAC1和MIAPaCa2细胞中表达增加，在SW1990、AsPC1细胞中表达水平无明显变化。在216例原发性胰腺癌患者中，76.85%(166/...     

胰腺癌细胞系BxPC3及胰腺癌组织Ras相关区域家族1A启动子CpG岛的甲基化状态

目的 检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株BxPC3及胰腺癌组织中的甲基化状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病机制中的可能作用.方法 采用结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)检测胰腺癌细胞株BxPC3、5例正常胰腺组织、13对胰腺癌及相应癌旁正常胰腺组织中RASSF1A启动子CpG岛的甲基化状态,计算其甲基化率.以甲基化酶抑制剂5-Aza-dC(5-Aza-2-deoxycitydine)处理BxPC3,观察处理前后甲基化率变化情况及RASSF1A mRNA表达变化.结果 在BxPC3细胞株中,RASSF1A启动子的CpG岛甲基化率为62.90%;正常胰腺、癌旁及癌组织中平均分别为9.14%、53.79%和55.82%.与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P值<0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P>0.05).BxPC3经5-Aza-dC处理后,RASSF1A的CpG岛甲基化率显著下降至42.50%(P<0.05),同时RASSF1A mRNA表达增强.结论 RASSF1A启动子CpG岛异常甲基化是胰腺癌发生发展中的早期事件,可能参与胰腺癌的发病过程.     

五株胰腺癌细胞株的 PTCH 和 SMO mRNA 表达

目的 研究胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988s、PANC-1、BxPC3、CFPAC中PTCH和SMO mRNA表达及相关关系.方法 用RT-PCR法测定5株胰腺癌细胞株和正常胰腺组织的PTCH和 SMO mRNA表达.结果 正常胰腺组织无PTCH和SMO mRNA表达;胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988s、PANC-1、BxPC3有PTCH mRNA的表达;胰腺癌细胞株PaTu8988s、PANC-1、BxPC3有SMO mRNA表达,而SW1990无SMO mRNA表达;胰腺癌细胞株CFPAC无PTCH及SMO mRNA表达.结论 正常胰腺组织无PTCH和 SMO mRNA表达;胰腺癌细胞株PTCH和SMO mRNA表达有差异,这可能与其生物学特性不同有关.     

IRX1在胰腺癌中的表达及其启动子区甲基化状态

目的 检测胰腺癌的易洛魁族同源盒基因(IRX1)的表达及其启动子区的甲基化状态,探讨两者间的相关性.方法 采用实时PCR法检测12例胰腺癌组织及6株胰腺癌细胞株的IRX1 mRNA 表达.基因序列分析IRX1基因启动子区结构.应用甲基化抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理胰腺癌细胞,采用甲基化特异性PCR(MSP)、非甲基化特异性PCR (USP)及实时PCR检测处理前后IRX1启动子甲基化状态和IRX1 mRNA表达.结果 胰腺癌组织IRX1 mRNA的表达量为0.31±0.11,显著低于癌旁正常胰腺组织的1.05±0.32(P ＜0.01).胰腺癌细胞AsPCl、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990的IRX1 mRNA表达量分别为0.36±0.08、0.34±0.16、0.37±0.11、0.25±0.06、0.31±0.04、0.36±0.02,均显著低于人肾上皮293细胞的1.03±0.28(P＜0.05或＜0.01).IRX1基因启动子区富含CpG岛.各胰腺癌细胞株IRX1基因启动子CpG岛对应位点均有甲基化,经5-Aza-dC处理后甲基化状态得以逆转,IRX mRNA的表达也得以恢复.结论 胰腺癌的IRX1 mRNA表达下降,与其IRX1基因启动子区CpG岛高甲基化状态相关.     

三种胰腺癌细胞株Mesothelin的表达及成瘤速度的比较

目的 比较3种人胰腺癌细胞株在体外和裸鼠体内Mesothelin的表达及裸鼠皮下种植瘤生长速度的差异.方法 培养人胰腺癌细胞株SW1990、BxPC3、PANC1,取对数生长期分别注射于裸鼠左腋窝皮下,每周测量裸鼠皮下种植瘤的长、短径,计算体积,SW1990、BxPC3组裸鼠观察3周,PANC1组裸鼠观察5周;用蛋白质印迹法分别检测3种细胞及裸鼠皮下种植瘤组织中的Mesothelin表达,用免疫组化染色检测3种裸鼠皮下种植瘤组织中Mesothelin表达.结果 人胰腺癌细胞株体外Mesothelin表达的强弱顺序是BxPC3＞ PANC1＞ SW1990,体内种植瘤组织表达的强弱顺序是SW1990＞ BxPC3＞ PANC1.3种人胰腺癌细胞种植于裸鼠皮下的成瘤率均为100％,各组肿瘤的生长速度顺序为SW1990＞ BxPC3＞ PANC1.结论 不同人胰腺癌细胞株Mesothelin的表达量不同,裸鼠皮下种植瘤的生长速度亦不同,两者无相关性.     

MUC2基因甲基化在胰腺癌细胞株、胰腺癌患者外周血中的检测及意义

目的 检测MUC2基因在胰腺癌细胞株、胰腺癌患者外周血中的甲基化情况,探讨MUC2基因甲基化对胰腺癌早期诊断的价值.方法 收集长海医院消化内科实验室保存的人胰腺癌细胞系SW1990、ASPC、PANC1、BxPC3、PaTu8988、CFPAC1及40例胰腺癌、15例慢性胰腺炎患者和25例正常对照者外周血标本,应用甲基化敏感性限制性内切酶(methylation-sensitive restriction endonuelease,MS-RE)为基础的PCR法检测MUC2基因甲基化.结果 人胰腺癌细胞系PANC1、BxPC3、PaTu8988未发生MUC2基因甲基化;ASPC、CFPAC1、SW1990胰腺癌细胞系发生MUC2基因甲基化.外周血标本中,40例胰腺癌标本甲基化率为40.0%(16例),15例慢性胰腺炎无甲基化,25例正常对照甲基化率4.0%(1例).胰腺癌与慢性胰腺炎、正常对照之间的甲基化率有显著差异(P＜0.01).外周血标本MUC2基因启动子CpG岛甲基化检测诊断胰腺癌的敏感性为40%、特异性为97.5%、诊断准确性68.8%、阳性预测值94.1%、阴性预测值61.9%.结论 用甲基化限制性酶切PCR法对外周血进行MUC2基因启动子区高甲基化检测可望成为新的胰腺癌诊断的重要实验室辅助手段.     

五株胰腺癌细胞株的PTCH和SMO mRNA表达

目的 研究胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988s、PANC-1、BxPC3、CFPAC中PTCH和SMOmRNA表达及相关关系。方法用 RT—PCR法测定5株胰腺癌细胞株和正常胰腺组织的PTCH和SMOmRNA表达。结果 正常胰腺组织无PTCH和SMOmRNA表达；胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988s、PANC-1、BxPC3有PTCHmRNA的表达；胰腺癌细胞株PaTu8988s、PANC-1、BxPC3有SMOmRNA表达，而SW1990无SMOmRNA表达；胰腺癌细胞株CFPAC无PTCH及SMOmRNA表达。结论 正常胰腺组织无PTCH和SMOmRNA表达；胰腺癌细胞株PTCH和SMOmRNA表达有差异，这可能与其生物学特性不同有关。     

消化系肿瘤增殖诱导配体高表达细胞株的筛选

目的筛选出增殖诱导配体（APRIL）mRNA高水平表达的人消化系肿瘤细胞株．为进一步探讨APRIL基因在消化系统肿瘤发生、发展以及转移过程中的作用机制奠定基础。方法选择2株人胃癌细胞（AGS、SGC7901）和3株人胰腺癌细胞（PANC1、CFPAC-1、BxPC3）培养提取mRNA后，逆转录成cDNA作PCR模板。以APRIL基因高保守区设计特异性的引物．以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参，PCR扩增目的片段．通过计算机图像扫描系统分析各株细胞的APRIL mRNA的表达量．以表达量最高的1株作为1-获得各细胞株的APRIL mRNA表达量的相对值。结果5株细胞APRIL mRNA的相对值分别为：AGS．0．09；SGC 7901．0．61；PANC 1．0．45：CFPAC 1.1；BxPC3．0．57．按表达量高低顺序为：CFPAC 1〉SGC 7901〉BxPC3〉PANC 1〉AGS。结论在不同肿瘤细胞中APRIL的表达有高有低．提示APRIL基因在肿瘤发生、发展过程中起一定作用。     

干细胞相关基因Oct-4在人肿瘤细胞系中的表达及其意义

目的探讨干细胞相关基因Oct-4在多种人肿瘤细胞系中的表达。方法体外培养人胰腺癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌细胞系,应用RT-PCR和Western blot法分别检测Oct-4mRNA和蛋白在各种人肿瘤细胞系中的表达。结果Oct-4mRNA和蛋白在胰腺癌细胞系SW1990、PANC1、BxPC3、PC3,宫颈癌细胞系HELA,肝癌细胞系HepG2,乳腺癌细胞系MCF-7和结肠癌细胞系CaCo2中均有表达。结论干细胞相关基因Oct-4在肿瘤细胞中的表达,一方面说明恶性肿瘤与干细胞具有密切的关系,另一方面也说明Oct-4基因在这些肿瘤的发生中起到重要作用。     

12-脂氧合酶在胰腺癌中的表达及其临床意义

目的 检测胰腺癌组织和胰腺癌细胞株SW1990和PANC1的12-脂氧合酶(12-lipooxygenase,12-LOX)表达,探讨其与胰腺癌临床病理参数的关系.方法 分别应用免疫组化染色、RT-PCR和蛋白质印迹法检测胰腺癌组织、癌旁正常胰腺组织及胰腺癌细胞株SW1990和PANC1中12-LOX mRNA和蛋白的表达.分析胰腺癌组织12-LOX表达与临床病理参数的相关性.结果 30例胰腺癌组织12-LOX表达阴性8例,弱阳性7例,强阳性15例,总阳性率为73.3％.SW1990和PANC1细胞均表达12-LOX.阳性表达的胰腺癌组织及两株胰腺癌细胞株均表达12-LOX mRNA,而癌旁正常胰腺组织不表达12-LOX mRNA及蛋白.胰腺癌组织12-LOX强阳性表达与肿瘤TNM分期、肿瘤病理分级和淋巴结转移相关(P＜0.05),而与患者年龄、性别无关.结论 12-LOX在胰腺癌中表达上调,与胰腺癌的恶性生物学行为有关.     

硼替佐米对胰腺癌细胞BxPC3、SW1990生长抑制作用的体外研究

目的 观察硼替佐米对胰腺癌细胞BxPC3、SW1990增殖、凋亡的影响,探讨硼替佐米杀伤癌细胞的可能机制.方法 应用1、10、50、100、500 nmol/L及1、10 μmol/L的硼替佐米干预BxPC3、SW1990细胞,以硼替佐米未干预的细胞作为对照组.采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞的增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;RT-PCR法检测Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、survivin mRNA表达;蛋白质印迹法检测pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、surviving蛋白表达.结果 大于50 nmol/L的硼替佐米干预胰腺癌BxPC3、SW1990细胞时,呈浓度及时间依赖性抑制细胞的增殖,其中硼替佐米对BxPC3细胞的生长抑制作用显著大于对SW1990细胞的作用,两者差异有统计学意义（P值均＜0.05）.100 nmol/L硼替佐米干预组BxPC3和SW1990细胞凋亡率分别为（22.56±4.23）％和（（12.71±2.23）％,显著高于对照组的（2.15±0.47）％和（2.32±0.54）％（P值均＜0.05）,且BxPC3细胞的凋亡率显著高于SW1990细胞（P＜0.05）.100 nmol/L硼替佐米干预48 h后BxPC3和SW1990细胞的Bak mRNA表达无显著变化,Bax mRNA及蛋白表达显著增加（P值均＜0.05）,Bcl-2 mRNA和蛋白表达及Bcl-xl mRNA表达均减少（P值均＜0.05）.survivin mRNA和蛋白表达在BxPC3细胞中均减少,而在SW1990细胞中均增加（P值均＜0.05）.2株细胞的pro-caspase-3蛋白表达减少,而cleaved-caspase-3蛋白表达增加（P值均＜0.05）.结论 硼替佐米可抑制胰腺癌细胞BxPC3、SW1990的增殖、诱导凋亡,对BxPC3细胞的作用高于对SW1990细胞,其机制可能与激活线粒体内源性凋亡途径及survivin参与的肿瘤耐药相关.     

胰腺癌及胰腺星状细胞中基质细胞衍生因子SDF-1及其受体CXCR4的表达

目的 检测基质细胞衍生因子(SDF-1)及其受体CXCR4在胰腺癌组织、细胞株及星状细胞(PSC)中的表达.方法 采用免疫组织化学方法 检测37例胰腺癌及10例癌旁正常胰腺组织SDF-1、CXCR4、α-SMA蛋白表达以及细胞株AsPC-1、PSC的SDF-1、CXCR4蛋白表达.RT-PCR检测AsPC-1、BxPC3、SW1990及PSC的SDF-1、CXCR4 mRNA表达.结果 37例胰腺癌CXCR4表达(+)8例、(++)20例、(+++)9例;10例癌旁正常胰腺组织CXCR4表达(-)2例、(+)7例、(++)1例,两者差异显著(P<0.01).胰腺癌的间质组织SDF-1的表达高于癌旁间质组织(P<0.01),并随α-SMA表达的增加而增加.胰腺癌细胞株AsPC-1有CXCR4蛋白表达,而PSC有SDF-1蛋白表达.AsPC-1、BxPC3、SW1990细胞株均有CXCR4 mRNA的表达,而无SDF-1 mRNA的表达;PSC有SDF-1 mRNA表达,CXCR4 mRNA微弱表达.结论 胰腺癌组织及细胞系表达CXCR4,PSC表达SDF-1,PSC有可能通过SDF-1/CXCR4轴促进胰腺癌的侵袭转移.