用内转录间隔区通用引物的聚合酶链反应快速测定念珠菌菌种

目的：应用内转录间隔区（ITS）通用引物建立一种较为快速、简便的检测和鉴定念珠菌的聚合酶链反应（PCR）方法。方法：采用两对ITS通用引物ITS1、ITS4和ITS86、ITS4对7种（8株）念珠菌菌县液进行PCR扩增。结果：两对引物3.5h内对7种念珠菌的菌县液扩增出种特异的DNA多带，而第2对引物其种特异性更强。结论：采用ITS通用引物结合快速PCR检测法，可快速、简便、特异、敏感地检测出念珠菌，并能同时鉴定到种，这将在今后念珠菌病的早期诊断和治疗上有潜在的应用价值。     

PCR法和传统方法对体液标本中致病真菌的检测比较

目的评价PCR方法诊断深部真菌感染的敏感性和特异性。方法应用真菌通用引物ITS4和ITS86对83例临床体液标本中的致病真菌进行PCR法快速检定,并与传统方法检验的结果进行比较。结果直接PCR扩增的阳性率与传统方法差异无统计学意义。结论采用ITS通用引物PCR法可准确、特异、快速、敏感地检测深部致病真菌。     

应用PCR-RFLP进行申克孢子丝菌的分子生物学鉴定

目的　探索一种简单、快速的申克孢子丝菌的鉴定方法。方法　应用真菌通用引物ITS1和ITS4对来源于不同地区及不同临床型别孢子丝菌病的 2 8株申克孢子丝菌以及 9种其他临床上重要的真菌进行PCR扩增 ,利用限制性内切酶HaeⅢ对PCR产物进行酶切分析鉴定。结果　所有 2 8株申克孢子丝菌和其他 9种真菌均扩增出一条约 3 5 0bp的片段 ,其中 2 8株申克孢子丝菌RFLP带型一致 ,与 9种其他临床上重要的真菌RFLP带型差异较明显。 结论　PCR RFLP可以为建立一种简单、快速鉴定申克孢子丝菌的方法提供依据。     

聚合酶链反应检测深部致病真菌的实验研究

目的 建立能用于临床实践的检测常见致病真菌的聚合酶链反应(PCR)方法.方法 设计了以热启动PCR为基础的实验方法,首先用真菌通用引物对标本进行单重PCR,若阳性,再用白念珠菌、烟曲霉和新生隐球菌的种特异性引物进行三重PCR来检测这3种常见致病真菌.结果 对9属55种78株常见深部真菌均扩增出260bp的DNA片段,而对细菌和人DNA均未扩增出目的 片段,具有高度特异性和敏感性,该方法操作简便且成本低.结论 以热启动PCR为基础的单重PCR和三重PCR方法可能成为临床上深部真菌感染理想的快速诊断工具.     

半巢式PCR-RFLP法快速鉴定临床标本中的皮肤癣菌

目的探索快速鉴定皮肤癣菌病临床标本中致病菌的分子生物学方法。方法以皮肤癣菌的基因组DNA为模板,采用一对半真菌通用引物(NS5、ITS1、ITS4)行半巢式PCR扩增rDNA上的ITS段,用限制性内切酶BciT130Ⅰ及DdeⅠ酶切目的片段,凝胶电泳。结果7种65株常见皮肤癣菌培养菌株和17例临床标本的半巢式PCR-RFLP图谱特异;且临床标本与相应的培养菌株酶切图谱一致。结论半巢式PCR-RFLP方法适合培养菌株和临床标本病原菌的快速准确鉴定。     

真菌

20 0 0 150 6　某些致病真菌的聚合酶链反应检测 /朴英兰 (北京医大一院皮肤科 )…∥中华皮肤科杂志 .-1999,32 ( 6) .- 397建立一种比其它常规方法更为快速、稳定的体系 ,以协助临床早期诊断。共收集临床株 56株。制备模板DNA,引物为细胞色素 P4 50 L1A1基因序列引物 ,目的片段 PCR扩增。结果 :应用 ITS内转录间隔区通用引物 ,从所有受试真菌 DNA中均获得阳性 PCR扩增产物 ,出现预期的 148bp～ 4 78bp唯一条带 ;应用 DH- 1558念珠菌属特异引物 ,其扩增产物出现多条非特异性条带 ;应用 144 0 6/ 144 0 7白念珠菌特异性引物 ,经PCR…     

种特异性引物鉴定申克孢子丝菌

目的 研究申克孢子丝菌的分子鉴定方法,为孢子丝菌感染的分子诊断奠定基础.方法 对22株申克孢子丝菌和12种12株暗色真菌临床分离株的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)进行聚合酶链反应扩增.对10株来源于中国不同地区及1株来源于美国的申克孢子丝菌的扩增产物测序并进行分析,以获得的ITS2区序列为靶序列设计出申克孢子丝菌的种特异性引物(SSP),并用该引物扩增全部受试菌株.结果 序列分析显示,申克孢子丝菌rDNA的ITS2区相当保守,特异性引物对22株申克孢子丝菌可扩增出一条300bp的片段,其他受试菌株均为阴性.结论 应用设计出的种特异性引物,结合PCR方法,鉴定申克孢子丝菌特异、敏感、可靠,可用于临床诊断.     

四对孢子丝菌引物的特异性和敏感性评价

目的 筛选对孢子丝菌特异且敏感的引物。方法 以50株不同地区来源的孢子丝菌临床分离株及标准株的基因组DNA作为研究样本,以毛霉、烟曲霉、念珠菌临床分离菌株基因组DNA作为对照,通过特异引物PCR扩增的方法筛选国内外文献中报道的4对孢子丝菌引物。所有受试孢子丝菌菌株均出现同一扩增产物,而对照菌株未出现者记为特异性引物,随后将基因组DNA模板倍比稀释后依次行PCR扩增,记录各引物出现阳性扩增结果时的最小模板浓度,检测敏感性。结果 在相同PCR条件下,引物S2-R2、SSHF31-SSHR97及ITS3-SSP具有较好特异性,而引物SS3-SS4对孢子丝菌及念珠菌菌株均可扩增出同样大小的PCR产物。引物S2-R2的敏感性最好,基因组DNA模板浓度为5 pg/μL时即可被检出。结论 针对几丁质合成酶1基因的引物S2-R2为孢子丝菌特异且敏感的引物。     

16种支孢随机扩增 DNA多态性研究

目的 了解支孢属腐生真菌与致病真菌的基因学特征及二者的关系。方法 采用溴苯提取法提取基因组DNA,以随机扩增DNA多态性法对16种支孢26株菌的DNA指纹图谱作了分析。结果 （1）共选用10个随机引物进行扩增,筛选出2个具有稳定,清晰DNA扩增带型的引物,即引物2：5′-AGGGTCCTCC-3′,引物5：5′-CAGCACCCAC-3′。（2）26株菌DNA带型不完全相同,有一定的种间和种内的遗传变异性,遗传相似性约为37.4%,（3）同种菌具有较高的遗传相似性。（4）部分腐生菌与致病菌位于同一树组中。结论 随机扩增DNA多态性法研究发现支孢属内各种间有一定的遗传相似性。但腐生菌与致病菌的DNA带型性差异。     

拓扑异构酶Ⅱ基因区PCR-RFLP法鉴别常见皮肤癣菌

目的：探讨拓扑异构酶Ⅱ基因区PCR～RFLP法鉴别常见皮肤癣菌的可行性。方法：用真菌拓扑异构酶Ⅱ基因区通用引物dPsD1、dPsD2，先后对6种34株临床常见皮肤癣菌和2株白念珠菌以及4株曲霉的DNA进行巢式PCR（nested PER）扩增，扩增后的阳性产物分别用限制性内切酶HincⅡ和HinfⅠ酶切，进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析，根据结果来鉴定皮肤癣菌并在种的水平上区分这6种常见皮肤癣菌。结果：通用引物dPsD1对6种皮肤癣菌均能扩增出3390bp、dPsD2能扩增出2380bp的片段，而白念珠菌和曲霉则未见阳性扩增条带。扩增出的产物分别经HincⅡ和HinfⅠ酶切后表现为58—1670bp长短不等的片段组合，根据这些特异性条带谱可以区分这6种临床常见皮肤癣菌。结论：拓扑异构酶Ⅱ基因区的巢式PCR—RFLP方法，是鉴定和区分常见皮肤癣菌的有效方法。     

PCR检测部分病原真菌的实验研究

为探讨和评价ＰＣＲ技术在检测和鉴定病原真菌方面的作用,重点是引物的选择。首先比较了来自ｒＤＮＡ基因序列的通用引物的通用性,并用３对种特异性引物进行２次套式扩增。结果表明３对通用引物均能扩增出预期的靶ＤＮＡ带,平均大小分别为６２０ｂｐ,４８５ｂｐ和５８０ｂｐ;３对种特异性引物分别扩增出白念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉ＤＮＡ,并提高了敏感性。说明用通用引物和种特异引物进行ＰＣＲ扩增可以用于病原真菌的检测和     

PCR-RFLP技术快速鉴定八种致病丝状病原真菌的实验研究

目的 建立能快速鉴定深部丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP方法。方法 用真菌通用引物扩增烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、尖端赛多孢和串珠镰刀菌的ITS区,分别用HhaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、TaqⅠ和MspⅠ 5种限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切,建立以PCR为基础的RFLP方法,然后对22株临床株和2株环境分离株进行PCR-RFLP图谱分析。结果 对PCR产物进行RFLP分析可以准确鉴定8种深部致病丝状真菌,从DNA提取到酶切分析可以在1个工作日完成。22株临床株和2株环境分离株PCR-RFLP鉴定结果与传统的形态学鉴定结果一致。结论 PCR-RFLP技术是一种能够快速鉴定丝状真菌的有效方法。     

聚合酶链反应快速检测丝状真菌

目的　建立并评价一种新的丝状真菌的快速PCR检测方法。方法　将 13种培养的不同丝状真菌菌种经匀浆器研磨处理后直接放入一个新建立的PCR体系 ,用 2对真菌通用引物进行PCR扩增。结果　 13种不同的丝状真菌菌种均在 2h内通过该PCR方法成功地获得了靶DNA的扩增 ,无需任何DNA抽提步骤 ,可用于直接扩增处于任何生长期的未经处理的丝状真菌DNA。结论　此法简便、快速 ,敏感性、特异性均高 ,对丝状真菌引起的深部真菌感染的早期诊断将具潜在意义。     

Arthroderma Vanbreuseghemii所致脓癣的病原菌鉴定及药敏分析

目的：利用rDNAITS序列分析结合真菌形态学对1例脓癣的病原菌进行鉴定,并研究其体外对抗真菌药物的敏感性,为临床脓癣病原菌的快速、准确鉴定及治疗提供思路。方法：取患者病发及皮损处脓液进行真菌镜检和培养。提取菌株DNA,利用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增,扩增产物测序后在GenBank核酸数据库中进行同源性比对。按照CLSI制定的M38-A方案对此临床分离株进行体外药敏分析。结果：临床分离株的菌落形态为白色粉末状,尿素酶试验阳性,玉米培养基培养无色素产生,毛发穿孔试验可见毛发劈裂。小培养可见大量葡萄状小分生孢子,螺旋菌丝及棒状大分生孢子,rDNA序列比对结果显示此临床分离菌株与Arthroderma vanbreuseghemii有99%同源性,该菌株鉴定为Arthroderma vanbreuseghemii。体外药敏试验显示：特比萘芬MIC〈0.0313μg/mL、伊曲康唑MIC1.000μg/mL,伏立康唑的MIC为0.0625μg/mL。以特比萘芬口服250mg/d治疗6周后痊愈。结论：利用rDNA-ITS序列分析结合真菌形态学可快速准确的将脓癣的病原菌鉴定到种;此株Arthroderma van-breuseghemii在体外对特比萘芬最敏感。     

儿童头癣致病真菌调查及分子流行病学研究

目的调查分析儿童头癣患者生活环境中致病真菌存在情况,探索其流行病学规律,为儿童头癣的防治提供依据。方法收集儿童头癣患者临床资料,并进行病发真菌镜检和培养,收集每例儿童头癣患者生活环境中密切接触物品及亲属头发进行真菌培养,培养结果与相应患者真菌培养结果对比分析。鉴定为相同菌株者采用真菌通用引物ITS1和ITS4对rDNA的ITS区进行扩增,并采用（GACA）4单引物进行分子鉴定,用随机引物扩增DNA多态性（RAPD）方法对相同菌株者进行株间差异性分析。结果调查91例儿童头癣患者,年龄从1岁至12岁,病程1周至3月;患者病发的真菌培养结果：犬小孢子菌44株（48．35％）,铁锈色小孢子菌41株（45．05％）,须癣毛癣菌4株（4．40％）,红色毛癣菌1株（1．10％）,石膏样小孢子菌1株（1．10％）;患者亲属头发及枕巾等接触物品真菌培养结果均未分离到致病真菌：2例儿童的伙伴病发中分离到与对应惠儿相同的致病菌;有宠物接触者28例（30．77％）中有7例（7．69％）分离到与头癣患者病发相同的致病菌种。RAPD分析发现从患者分别与其对应环境中分离的犬小孢子菌的基因组DNA随机引物扩增后产生的产物片断长度多态性一致,显示无株间差异性。结论儿童头癣患者生活环境中有致病真菌存在．致病真菌主要来源于宠物及密切接触伙伴。     

PCR-RFLP鉴别临床常见的皮肤癣菌

目的 建立一种快速而简便的分子水平上鉴定常见皮肤癣菌的方法。方法 采用通用引物ITS1（5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‘)、ITS4(5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘)对7种常见皮肤癣菌的核糖体的ITS（internal transcribed spacer)区（包含5.8SrDNA)进行PCR扩增，PCR产物分别应用限制性内切酶MvaI、TaqI、HinfI酶切。结果 7种皮肤癣菌的ITS区扩增产物条带大小不同；以MvaI、TaqI、HinfI三种酶分别酶切PCR-ITS区产物，7种皮肤癣菌均产生独特且易于区分的酶切图，尤其是MvaI酶产生的酶切图在种间差异最为明显。可将7种菌明确区分开。结论 核糖体ITS区PCR-RFLP分析是区分常见皮肤癣菌的有价值的方法。