人心肌肌钙蛋白I基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的从人心肌组织中克隆出心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnI）的cDNA。构建成表达重组体导入特定宿主菌，以期大量表达并获得高纯度的心肌肌钙蛋白Ⅰ，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni-NTA树脂纯化后行Western blot进行鉴定。结果成功获取了人cTnI的cDNA，并在大肠埃希菌中高效表达。经Ni—NTA树脂纯化后获得的产物可与其特异性单克隆抗体反应。结论成功克隆了cTnI基因，构建的重组体能够在大肠埃希菌中高效表达，经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ在大肠杆菌中的高效表达及纯化

目的：获得高纯度的人心肌肌钙重组蛋白,为临床上检测心肌损伤及预后担任新的诊断方法。方法：利用ＲＴ－Ｐ０ＣＲ方法从人心肌细胞的ｃＤＮＡ库中扩增编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的ｃＤＮＡ,并克隆支大肠杆菌表达载体中,表达含凝血酶识别序列的ＭＳ２－ｃＴｎⅠ融合蛋白,纯化后用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ进行鉴定。结果：从人心肌ｃＤＮＡ库中扩增出编码人ｃＴｎⅠ的ｃＤＮＡ,克隆并在大肠杆菌中表达,表达量达３０％以上。经离     

人重组钙依赖性磷脂结合蛋白Ⅴ在大肠杆菌中的高效表达、纯化及细胞凋亡检测

目的：为细胞凋亡研究提供快速可靠的实验方法。方法：利用RT-PCR技术从人外周血单核细胞系U937 cDNA文库中扩增出编码钙依赖性磷脂结合蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ) cDNA,并克隆到大肠杆菌表达载体中,在大肠杆菌中表达含凝血酶识别序列的MS2 Annexin Ⅴ融合蛋白。表达产物经凝血酶消化,可除去MS2细菌蛋白,再经离子交换层析纯化,可得成熟的Annexin Ⅴ纯品,FITC标记后的Annexin Ⅴ可用于细胞凋亡的检测。结果：在大肠杆菌表达的人重组Annexin Ⅴ占菌体蛋白的56 %,经纯化获得99 %纯度的非融合型Annexin Ⅴ, FITC标记的Annexin Ⅴ能有效地检测凋亡细胞。结论：成功地建立了批量获取Annexin Ⅴ的技术路线,为推广高效检测凋亡技术提供了基础。     

人血管内皮生长因子(VEGF165)在大肠杆菌中的表达及鉴定

[目的]克隆人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达、纯化重组VEGF165(rVEGF165)蛋白.[方法]用PCR技术,从人心脏cDNA文库中扩增VEGF165cDNA,并定向克隆入原核表达载体pET-28a中.用IPTG诱导VEGF165在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.用HisTrap亲合层析柱纯化重组rVEGF165,Western-blot鉴定.根据人VEGF165的促血管内皮细胞增殖的特性,用MTT法检测重组VEGF165的生物学活性.[结果]从人心脏cDNA文库中扩增出VEGF165cDNA片段.克隆的VEGF165cDNA长576bp,编码191个氨基酸残基,序列与文献报道一致.SDS-PAGE电泳显示,经IPTG诱导,高效表达出25ku的rVEGF165,主要存在于包涵体中,约占菌体总蛋白的20%.MTT检测显示,复性后的rVEGF165能呈剂量依赖性地促进脐静脉血管内皮细胞增殖.[结论]克隆、测定了人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出rVEGF165.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的克隆、表达及重新折叠

目的 :人的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TNF relatedapoptosisinducingligand ,TRAIL)基因经扩增后 ,克隆在大肠杆菌中表达并重新折叠并获得有活性的TRAIL蛋白。方法 :用PCR的方法从人胎盘cDNA文库中扩增TRAIL基因 ,经序列分析鉴定 ,再克隆到原核表达载体 pET11a ,经E .coliBL2 1(DE3)表达 ,电泳鉴定后 ,柱层析纯化 ,重新折叠 ,流式细胞术等方法检测其促凋亡活性。结果 :得到了TRAIL基因 ,并构建了可在大肠杆菌中表达的载体 pET11 TRAIL1(含TRAILcDNA序列 418 933)及可在真核细胞中表达的载体pLNCX TRAIL2 (含TRAILcDNA序列 88 933)。取前者在E .coliBL2 1(DE3)中表达 ,经纯化 ,重新折叠得到了复性的TRAIL蛋白。检测其对人白血病细胞株Jurkat有诱导凋亡的作用。结论 :从人胎盘cDNA文库中扩增TRAIL基因 ,在大肠杆菌中表达、重新折叠、纯化后 ,经检测得到了有活性的TRAIL蛋白     

人血管内皮生长因子(VEGF_(165))在大肠杆菌中的表达及鉴定

[目的]克隆人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达、纯化重组VEGF165(rVEGF165)蛋白。[方法]用 PCR技术,从人心脏cDNA文库中扩增VEGF165 cDNA,并定向克隆人原核表达载体pET-28a中。用IPTG诱导VEGF165在大肠 杆菌BL21(DE3)中表达。用HisTrap亲合层析柱纯化重组rVEGF165,Western-blot鉴定。根据人VEGF165的促血管内皮细胞增殖 的特性,用MTT法检测重组VEGF165的生物学活性。[结果]从人心脏cDNA文库中扩增出VEGF165 cDNA片段。克隆的 VEGF165 cDNA长576 bp,编码191个氨基酸残基,序列与文献报道一致。SDS-PAGE电泳显示,经IPTG诱导,高效表达出25 ku 的rVEGF165,主要存在于包涵体中,约占菌体总蛋白的20％。MTT检测显示,复性后的rVEGF165能呈剂量依赖性地促进脐静 脉血管内皮细胞增殖。[结论]克隆、测定了人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出rVEGF165。     

肿瘤抗原基因MAGE-3的克隆、原核表达与纯化

目的: 克隆人MAGE-3基因并进行原核表达和分离纯化. 方法: 通过RT-PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE-3全长cDNA,经PCR扩增MAGE-3基因3′端324 bp片段,克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX/MAGE-3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化.结果: 经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,以此为模板经PCR扩增出约320 bp片段,测序结果与GenBank公布的MAGE-3序列一致,成功构建了pGEX/MAGE-3原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达Mr约42 000的GST融合蛋白,纯化的蛋白纯度为89%.结论: 成功克隆了人MAGE-3基因全长cDNA并对其3′端324 bp片段编码的108个氨基酸的蛋白进行了原核表达和分离纯化,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

人全长TALL-1在大肠杆菌中的表达

目的在克隆人TALL-1(TNF- and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand 1)全长 cDNA的基础上,用大肠杆菌进行表达并鉴定其生物学活性.方法采用RT-PCR技术,从HL-60细胞中扩增编码人TALL-1的cDNA,克隆于高效原核表达载体pQE-80L中,以IPTG诱导表达,Ni-NTA层析纯化后,进行生物学活性检测.结果 RT-PCR扩增得到了858 bp的DNA片段,测序结果与GenBank中报道的编码TALL-1的cDNA序列一致,并在大肠杆菌中获得了高效表达,活性检测发现它能抑制U937细胞的生长.结论成功克隆了人TALL-1全长cDNA,并获得了高效表达及纯化,纯化产物具有生物学活性,这为进一步的功能研究及临床应用奠定了基础.     

人重组钙依赖性磷脂结合蛋白V在大肠杆菌中的高效表达、纯化及细胞凋亡检测

目的：为细胞凋亡研究提供快速可靠的实验方法。方法：利用RT－PCR技术从人外周血单核细胞系U937 cDNA文库中扩增出编码钙依赖性磷脂结合蛋白V（Annexin V) cDNA,并克隆到大肠杆菌表达载体中,在大肠杆菌中表达含凝血酶识别序列的MS2 Annexin V融合蛋白。表达产物经凝血酶消化,可除去MS2细菌蛋白,再经离子交换层板纯化,可得成熟的Annexin V纯品,FITC标记后的Annexin V可用于细胞凋亡的检测。结果：在大肠杆菌表达的人重组Annexin V占菌体蛋白的56％,经纯化获得99％纯度的非融合型Annexin V,FITC标亡的Annexin V能有效地检测凋亡细胞。结论：成功地建立了批量获取Annexin V的技术路线,为推广高效检测凋亡技术提供了基础。     

粘附结构蛋白migfilin基因N末端的克隆和抗体制备

目的 克隆migfilin-N末端基因并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因表达产物并进行多克隆抗体制备,为研究migfilin与大肠癌的关系奠定基础.方法 根据人migfilin全长cDNA系列,设计PCR引物,以人大肠癌cDNA文库为模板克隆migfilin-N末端基凶,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中,经EcoRI/XhoI双酶切鉴定后,进行DNA序列测定.GST-migfilin-N融合蛋白在硫代半乳糖苷诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用谷胱甘肽亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-migfilin-N融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.并用纯化的抗migfilin多克隆抗体在不同的细胞株中用Western blotting检测migfilin的表达.结果 成功克隆了migfilin-N端基因片段,表达并纯化了GST-migfilin-N融合蛋白,制备了migfilin特异性抗体.Western blotting检测migfilin在不同细胞株中的表达,结果显示migfilin在肺癌及大肠癌细胞株中高表达.结论 migfilin特异性抗体制备成功,为深入探讨migfilin在大肠癌中的作用奠定了基础.     

人L-ficolin基因重组蛋白的表达及功能研究

目的:构建人L-ficolin基因的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:用PCR方法从质粒pCDNA3-L-ficolin中扩增L-ficolin cDNA片断,并将该片断插入pGEX-KG原核表达载体中,以进行插入基因的融合表达,表达后再用Thrombin切除GST以得到单纯的L-ficolin蛋白,SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定,并以细菌侵袭试验检测所得蛋白的生物学活性。结果:酶切结果证实,成功地构建了pGEX-KG-L-ficolin原核表达载体,并使之在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的分子质量(Mr)与预期值相一致。原核表达的L-ficolin蛋白具有调理吞噬作用,促进吞噬细胞吞噬细菌的能力,L-ficolin调理吞噬能力呈剂量依赖关系,并显著高于对照蛋白。结论:成功地构建了重组表达载体pGEX-KG-L-ficolin,经过Thrombin作用后得到的L-ficolin蛋白具有生物学活性,为进一步研究人L-ficolin的功能奠定了基础。     

人canstatin基因的克隆、表达、纯化及其生物活性测定

目的:克隆人Canstatin cDNA,在E.coli中融合表达和纯化,并测定表达产物抑制新生血管生成活性.方法:从中国人胎盘组织提取总RNA,RT-PCR扩增出Canstatin cDNA,克隆入pTYB1载体中并测序,构建原核表达载体pTYB1-hCAN,IPTG诱导表达,几丁质亲和纯化,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验进行活性测定.结果:RT-PCR产物约为700bp,测序结果与文献报道序列一致.构建了人Canstatin原核表达载体vTYB1-hCAN,在大肠杆菌中表达.纯化的融合蛋白在CAM实验中能明显抑制血管生成.结论:克隆、表达了具有生物学活性的人canstatin蛋白.     

东亚钳蝎钙通道样毒素的克隆与其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆东亚钳蝎钙通道样毒素(BmCa)基因,并构建原核表达质粒,在大肠杆菌中重组表达该毒素蛋白.方法:以东亚钳蝎尾毒腺的总RNA为模板,通过RT-PCR技术,扩增并克隆BmCa的cDNA基因,并将该基因重组到PET-GST表达载体中,转化入大肠杆菌BL21并诱导表达,采用Ni-SuperChelating Resin柱亲和层析纯化,用小白鼠毒性实验检测融合蛋白的活性.结果:成功克隆BmCa基因并构建原核表达质粒,IPTG诱导后表达分子质量约为33KD的融合蛋白,含量为大肠杆菌总蛋白的25%,经亲和层析得较高纯度的融合蛋白,小白鼠毒性实验表明融合蛋白具有活性.结论:在大肠杆菌中成功表达了有活性的东亚钳蝎钙通道样毒素蛋白,为其功能研究奠定基础.     

Purification and immunity analysis of recombinant 6His-HPT protein expressed in E. coli

Objective To obtain HPT protein (Hygromycin B Phosphotmnsferase), a kind of plant selective maker gene product expressed from E.coli and to prepare the polyclonal antibody (pAbs) against it. Methods HPT cDNA fragment was obtained by PCR and was inserted into the prokaryotic expressing vector pBV222. Then the constructed recombinant plasmid pBV222-HPT was transfered into E.coli DH5α for HPT expression. The recombinant expressing system was confirmed by restriction endonuclease digestion, DNA sequencing and protein expression. E.coli cells were lysed by sonication and detergent dissolution. After cell membrane was extracted, the inclusion bodies were denatured by 8 mol/L Urea and purified with metal chelate affinity chromatography on Ni-NTA agarose under denaturing condition. The purified 6His-HPT was characterized by SDS-PAGE, and used to immunize rabbit. The titer and specificity of antisera were detected by ELISA and Western blot respecitively. Results Analysis of DNA sequence and restricted enzymes showed that the sequence of PBV222-HPT plasmid was correct. The amount of recombinant HPT expressed in E.coli accounted for 30% of total cellular proteins. From 1 liter of fermentative bacteria about 22 milligrams of pure recombinant HPT was isolated with purity above 95%. The recombinant HPT protein could produce high titer antiserum in rabbits and show good immunity activity. Western blot showed specific binding reaction between the antiserum to the purified 6His-HPT protein and their expressed products (plants protein and bacterial protein). Conclusion HPT protein can be expressed and purified from E.coli by a relatively simple method, which has high immunity activity.     

人Trail分子的克隆、表达及鉴定

目的克隆人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,Trail)基因,并在原核细胞中进行有效表达及纯化后,获得有生物活性的Trail蛋白.方法采用RT-PCR,从激活的人淋巴细胞中扩增Trail胞外区cDNA,将其克隆至载体pGEM-T中,经酶切和测序后,亚克隆构建重组原核表达载体pGEX-5X-Trail,转化大肠杆菌(HBl01),并进行表达和纯化.结果得到了Trail基因,构建了在HB101中表达的重组质粒pGEX-5X-Trail,纯化后,检测发现重组人Trail融合蛋白(rhTrail)对人肝癌细胞株HepG2有诱导凋亡的作用.结论该文成功地构建了人Trail基因高效表达系统,所表达的rhTrail具有良好诱导肿瘤细胞凋亡的活性,为今后的深入研究打下基础.     

人Era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

目的 在大肠杆菌中对人era基因（简称hera)进行表达、纯化。方法 PCR扩增hera基因,测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-C,重组质粒pRSETC-hera以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌,用IPTG进行诱导表达。然后利用亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化。结果 克隆了hera基因,测序正确;利用pRSET-C载体在大肠杆菌中融合表达了全长hera-cDNA基因,表达量占细菌总蛋白的59．6％。融合蛋白在菌体内主要以包涵体形成存在,在变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白,其纯度达到了98．0％。结论 利用基因重组技术在大肠杆菌中高表达了hera基因。并对融合蛋白进行了初步纯化。     

小鼠ERA蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的:对小鼠ERA蛋白(mERA)进行表达、纯化,为真核生物ERA功能研究奠定基础.方法:构建MBP-mERA融合表达载体.在大肠杆菌中诱导表达融合的小鼠ERA蛋白,经直链淀粉亲和层析纯化,Western Blotting鉴定所表达纯化的蛋白.结果:表达的MBP-mERA融合蛋白占菌体总蛋白的18 %;纯化后的融合蛋白纯度为70 %;Western Blotting证实了mERA蛋白的表达.结论:利用基因重组技术,在大肠杆菌中高表达了mera基因,并对融合蛋白进行了初步纯化.     

一种缺失核定位信号区的hbFGF的表达及纯化

目的：为了研究缺失核定位信号区的人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)独特的转运机制，在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达和纯化了缺失核定位信号区的hbFGF。方法：将PCR扩增得到的hbFGF cDNA片断克隆到表达载体pET3c中，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，通过离子交换和肝素亲和层析从菌体上清中纯化目标蛋白，MTT法检测促分裂活性。结果：hbFGF的表达量约为全菌体蛋白的20％，纯化的缺失核定位信号区的hbFGF的促分裂活性与缺失核定位信号区的hbFGF标准品相当。结论：BL21(DE3)／pET3c表达系统能高效表达缺失核定位信号区的hbFGF，纯化得到的hbFGF可用于进一步的研究。