AIBP在肝癌细胞中的表达及意义与含AIBP基因及AFP启动子驱动的双自杀基因表达载体构建

目的：探讨载脂蛋白A-I结合蛋白（AIBP）在肝癌细胞中的表达及意义。方法：用RT-PCR与Western blot法分别检测正常肝细胞株L02,AFP阳性人肝癌细胞株HepG2和Hep3B,及AFP阴性人肝癌细胞株SMMC7721中AIBP基因与蛋白的表达;构建AFP启动子驱动的双自杀基因（CD,TK）+AIBP基因过表达载体pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK,并转染Hep3B和SMMC7721细胞,用MTT法检测转染后细胞的增殖能力,用RT-PCR和Western blot法检测细胞AIBP,血管内皮生长因子（VEGF）,VEGF受体2（VEGFR-2）,基质金属蛋白酶9（MMP-9）基因和蛋白的表达。结果：AIBP mRNA和蛋白在正常肝细胞中高表达,而在各肝癌细胞系中均表达下调,且Hep3B和SMMC7721细胞中下调明显。成功构建pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK真核表达质粒并转染入Hep3B和SMMC7721细胞。转染后AFP阳性Hep3B细胞生长到明显抑制,但AFP阴性SMMC7721细胞增殖不受影响;两种细胞的AIBP基因与蛋白表达均明显上调,而VEGFR-2,VEGF和MMP-9基因与蛋白表达明显表达下调。定量指标间的差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论：AIBP在肝癌细胞中表达下调,AIBP与肝癌细胞的侵袭转移能力有关,而与细胞增殖能力无关;成功构建了联合基因载体pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK。

     

稳定表达Angiopoietin-1基因肝癌细胞株的建立及其意义

目的 通过将Angipoietin-1基因转染培养人肝癌细胞SMMC－7721,建立长期表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞模型。方法 基因重组构建Angipoietin-1真核表达质粒pcDNA3/Angipoietin-1,经脂质体将pcDNA3/Angipoietin-1质粒转染培养人肝癌细胞株SMMC－7721,G418筛选阳性细胞克隆,逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测转染后25-30d细胞Angipoietin-1基因mRNA表达水平。结果 （1）限制酶切和凝胶电泳证明成功构建表达质粒pcDNA3／Angipoietin-1;（2）通过脂质体Dosper将质粒pcDNA3／Angipoietin-1转染SMMC－7721,经G418筛选后获得阳性细胞克隆;（3）RT－PCR证明经脂质体转染的人肝 癌细胞株SMMC－7721可较稳定表达Angipoietin-1基因。结论 成功建立稳定表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞株SMMC－7721／Angipoietin-1,为通过在体途径探讨Angipoietin-1对肿瘤血管生成的调节作用奠定了基础。     

pcDNA3.1(+)-ABCG2真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建人的ABCG2基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2,并在ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中表达.方法 以人的癌细胞为材料提取RNA,经反转录得到cDNA,利用PCR方法,根据人ABCG2基因62526032(NM_004827.2)序列信息设计引物,扩增ABCG2基因的CDS序列,将其克隆到pcDNA3.1+表达载体中.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中.采用Western blot法检测外源基因ABCG2的表达.结果 PCR扩增片段大小与理论片段大小相符,酶切大小与理论大小相符,阳性的克隆测序鉴定正确,表明人ABCG2基因克隆及真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2构建成功.在蛋白水平,转染72h后的细胞中外源基因ABCG2表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2,并在ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中进行了表达.     

人甲胎蛋白增强子驱动自杀基因靶向杀伤肝癌细胞的实验研究

目的 探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鸟苷自杀基因系统体内外靶向杀伤肝癌细胞的效应.方法 构建人AFP增强子驱动的pAFP-cDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒;利用脂质体将质粒转染入AFP阳性肝癌细胞株HcpG2和AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721;采用RT-PCR和Western blot检测TK mRNA和蛋白表达;MTT检测细胞的存活率;观察丙氧鸟苷对肝癌细胞体外增殖、生长曲线和细胞凋亡的作用,以及丙氧鸟苷体内抑制肿瘤生长的效应.采用t检验分析相关数据.结果 成功构建pAFP-cDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒并转染入肝癌细胞;AFP阳性肝癌细胞株HepG2中能检测到TKmRNA和蛋白表达;丙氧鸟苷呈剂量和时间依赖性抑制转染后肝癌细胞株HepG2的生长并诱导其凋亡;AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721中没有TKmRNA和蛋白表达,细胞增殖、生长曲线和凋亡均不受影响,两者比较,差异有统计学意义(t=2.58,2.73,3.12,P＜0.05).丙氧鸟苷可以特异性地抑制转染后肝癌细胞株HepG2治疗组中肿瘤的生长,肿瘤抑制率为46%,而在转染后肝癌细胞株SMMC7721治疗组中,对肿瘤生长无明显抑制作用,两者比较,差异有统计学意义(t=3.36,P＜0.05).结论 人AFP增强子驱动的HSV-TK/丙氧鸟苷自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞,抑制肿瘤生长.     

血管内皮生长因子基因稳定转染兔骨髓基质干细胞的研究

目的 检测人血管内皮生长因子(VEGF)基因稳定转染对兔骨髓基质干细胞(BM-SC)VEGF表达的影响.方法 分离并培养兔骨髓基质干细胞,利用脂质体介导pcDNA3.1-VEGF165转染兔BMSC,G418筛选稳定表达pcDNA3.1-VEGFl65的细胞克隆,RT-PCR、Western blot法检测转染前后细胞中VEGF165 mRNA和蛋白的表达.结果 通过筛选获得了稳定表达pcDNA3.1-VEGF165的细胞克隆.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot结果显示:稳定转染组BMSC中可检测到VEGF165 mRNA和蛋白的表达,空白和空载体组未见VEGF表达.结论 pcDNA3.1-VEGF165载体转染的兔BMSC可稳定表达外源性VEGF165 mRNA和蛋白,可作为治疗骨缺损和骨缺血性坏死研究的种子细胞.     

RhoC基因对肝癌细胞促血管生长因子表达的影响

目的:观察RhoC基因对肝癌HepG2细胞表达促血管生长因子（VEGF，bFGF）的影响。 方法:将pcDNA3.1-RhoC重组质粒和空载体pcDNA3.1转染HepG2细胞，用RT-PCR及免疫组化检测HepG2细胞的RhoC mRNA及RhoC蛋白表达情况;RT-PCR及免疫组化检测HepG2细胞VEGF和bFGFmRNA及蛋白的表达。将转染pcDNA3.1-RhoC重组质粒和空载体pcDNA3.1的HepG2细胞接种裸鼠，观察肿瘤的成瘤率。结果:与转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞相比，转染pcDNA3.1-RhoC重组质粒的细胞表达RhoC mRNA及RhoC 蛋白增强，其表达VEGF和bFGFmRNA及蛋白明显增强（P＜0.01）;重组质粒转染组成瘤率高于空载体组。结论:RhoC表达可促进HepG2细胞表达血管内皮生成因子。RhoC可促进肝癌细胞分泌促血管生长因子，可能是促进肝癌侵袭、转移的机制之一。     

DcR3反义RNA表达载体的构建及表达

目的：构建DcR3反义RNA表达载体PVAXI-as-DeR3，并研究其对肝癌细胞中DcR3蛋白表达的影响。方法：从肝癌组织中提取总RNA，RT-PCR法克隆出DcR3基因片段，将其与PMD18-T载体连接，经BamHⅠ、XholⅠ双酶切TA—DeR3及PVAXⅠ（-）真核表达载体后，使用T4DNA连接酶连接，构建反义DcR3表达载体。转染肝癌细胞株SMMC7721。Western blot法检测DeR3蛋白表达。结果：用RT-PCR方法从肝癌组织中扩增出DcR3片段，并经测序证实。重组质粒经酶切鉴定正确，转染肝癌细胞株SMMC7721后，经Western blot证实DcR3蛋白表达较对照组下降。结论：成功构建反义RNA表达载体PVAXⅠ-as-DcR3，构建的反义表达载体PVAXⅠ—as—DcR3具有阻断DcR3基因表达的效应。     

含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽的白细胞介素-24突变体真核表达载体的构建及其体外抗肝癌作用

目的 构建含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽的白细胞介素(IL)-24突变体(RGD-IL-24)真核表达质粒,观察其对肝癌细胞的抑制作用.方法 利用重叠PCR技术在IL-24cDNA中插入GGT三个碱基,获得RGD-IL-24 cDNA.将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1/RGD-IL-24.将pcDNA3-1/RGD-IL-24及作为对照的pcDNA3.1/IL-24转染肝癌细胞HepG2,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-24 mRNA表达;Western blot检测IL-24蛋白表达;噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖;FITC-Annexin V染色检测细胞凋亡;Western blot检测bax、bcl-2表达.结果 测序证明pcDNA3.1/RGD-IL-24构建成功.RT-PCR、Western blot证实转染pcDNA3.1/RGD-IL-24的肝癌HepG2细胞表达IL-24.pcDNA3.1/RGD-IL-24、pcDNA3.1/IL-24处理组HepG2细胞存活率分别为(0.382±0.064、0.563±0.038),凋亡细胞阳性率分别为(0.346±0.049、0.163±0.087),两组差异均有统计学意义.Western blot证实pcDNA3.1/RGD-IL-24促进bax表达、抑制bcl-2表达作用强于pcDNA3.1/IL-24.结论 RGD-IL-24真核表达质粒不仅不影响IL-24表达,且能显著增强IL-24诱导肝癌细胞凋亡及抑制肿瘤生长作用.     

运用siRNA建立稳定低表达IGF1R基因的肝癌细胞株的实验研究

目的运用siRNA技术在肝癌细胞株中建立稳定低表达人胰岛素样生长因子1类受体(IGF1R)基因的细胞株。方法构建包含封闭IGF1R基因的真核表达载体pSUPER-IGF1R-siRNA,转染SMMC7721和Hep3B细胞,G418筛选表达稳定的细胞株。通过RT-PCR、Western-blot分析与鉴定IGF1R mRNA和蛋白及cyclin D1、cyclinB1蛋白的表达,并绘制细胞生长曲线。结果在SMMC7721和Hep3B细胞中成功建立低表达IGF1R基因的细胞株,其生长明显减慢(P<0.05),且其cyclinD1表达亦明显下降(P<0.05)。结论pSUPER-IGF1R-siRNA能抑制SMMC7721和Hep3B细胞的生长。     

缺氧诱导因子-1α对低氧状态下前列腺癌PC-3细胞株增殖及侵袭的影响

目的 研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对低氧状态下前列腺癌PC-3细胞株增殖及侵袭的影响。 方法 利用转染试剂Fermentas将人HIF-1α重组表达质粒pcDNA3.1-HIF-1α转染PC-3细胞株后,低氧环境培养,采用G418筛选,建立稳定表达HIF-1α基因的细胞株,分别命名为pcD-NA3.1-HIF-1 α-PC-3、pcDNA3.1-PC-3及PC-3组。采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测3组细胞HIF-1α mRNA和蛋白的表达情况;噻唑盐法测定细胞生长;transwell小室检测侵袭能力。 结果 与pcDNA3.1-PC-3组和PC-3组相比,pcDNA3.1-HIF-1 α-PC-3组细胞内HIF-1α mRNA条带增强不明显,pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3组细胞内HIF-1α蛋白的条带明显增强,HIF-1α过表达的PC-3细胞增殖速度明显增快,侵袭细胞数明显增多。 结论 HIF-1α过表达对PC-3细胞株的增殖及侵袭具有促进作用。     

生存素反义核酸增加人结肠癌对泰素帝的化疗敏感性

目的探讨生存素(survivin)反义RNA真核表达质粒pcDNA3.0/survivin对泰素帝诱导人结肠癌多药耐药细胞株LOVO/Adr凋亡的影响。方法将已构建成功的survivin反义RNA真核表达质粒pcDNA3.0/survivin用脂质体瞬时转染LOVO/Adr细胞,以RT-PCR法检测质粒转染前后细胞survivinmRNA的变化,用MTT法和流式细胞术分别观察泰素帝对转染细胞的毒性作用和细胞凋亡变化。结果pcDNA3.0/survivin明显下调LOVO/Adr细胞survivinmRNA表达,MTT检测发现,泰素帝对转染pcDNA3.0/survivin、pcDNA3.0及未转染细胞抑制率分别为(37.3±2.9)%,(21.9±2.3)%和(21.1±1.9)%,前者与后两者间差异具有统计学意义(P<0.01);流式仪分析显示,各组细胞凋亡率分别为(28.7±1.7)%、(13.4±1.6)%与(14.3±1.8)%,前者与后两者间差异有统计学意义(P<0.01)。结论Survivin反义RNA真核表达质粒pcDNA3.0/survivin能下调LOVO/Adr细胞survivin基因表达,增加其对泰素帝的敏感性,为临床提高结肠癌疗效提供了一种新思路。     

乙型肝炎病毒X蛋白对DNA甲基转移酶3A/3B表达的影响

目的观察乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对QSG7701细胞中DNA甲基转移酶（DNMT）3A/3B表达的影响。方法本研究室前期构建好的重组表达质粒pcDNA-X及空载体pcDNA3.0分别转染QSG7701细胞,经含G418的选择性培养基筛选获得稳定转染HBV-X基因的细胞克隆（pcDNA-X/QSG7701）及稳定转染空载体pcDNA3.0的细胞克隆（pcDNA3.0/QSG7701）。采用RT-PCR、Westernblot分别检测转染细胞中HBxmRNA和HBx蛋白的表达。Real-timePCR检测3种细胞DNMT3A/3BmRNA的表达情况。免疫组织化学法检测3种细胞DNMT3A/3B蛋白的表达情况。结果RT-PCR、Westernblot检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中有HBxmRNA及HBx蛋白的表达。Real-timePCR结果显示pcDNA-X/QSG7701中DNMT3A/3BmRNA表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及未转染的细胞QSG7701（P〈0.05）。免疫组织化学检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中DNMT3A/3B蛋白表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及QSG7701细胞（P〈0.05）。结论稳定转染HBV-X基因的人源性永生化非瘤性肝细胞QSG7701中DNMT3A/3BmRNA和蛋白的表达水平均显著升高,提示HBV-X基因在mRNA及蛋白水平能上调转染细胞中DNMT3A/3B的表达,而细胞中DNMT3A/3B表达的增加是否能进一步影响癌基因、抑癌基因的表达水平,从而导致细胞癌变,尚有待进一步研究。     

脆性组氨酸三联体基因对胆管癌细胞凋亡的影响

目的 观察脆性组氨酸三联体(FHIT)基因对胆管癌细胞株QBC939凋亡的影响,探讨FHIT基因对细胞周期蛋白Cyclin D1的调控作用.方法 通过构建重组人FHIT真核表达质粒转染QBC939细胞,应用流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡的变化,并通过荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测胆管癌细胞Cyclin D1表达的变化.结果 成功构建出重组人FHIT真核表达质粒并转染入QBC939细胞,转染后QBC939细胞的凋亡率明显增高(25.8%比30.9%比55.4%,P<0.05);并且Cyclin D1 mRNA表达下降至原细胞株的0.03倍,该基因蛋白质的表达也明显下降(0.33±0.02对比0.33±0.01比0.14±0.02,P<0.05).结论 FHIT基因可以促进QBC939细胞凋亡,并能下调Cyclin D1基因的表达.     

linamarase稳定转染肝癌细胞系的建立及研究

目的构建含木薯linamarase(lis)基因的稳定转染肝癌细胞系,并对其生物学特性进行研究。方法应用PCR法从木薯的DNA中扩增出lis基因,将其克隆至pcDNA3.1(+)质粒中,构建重组质粒pcDNA3.1/lis。通过脂质体法将其转染人肝癌细胞系HepG2,进行G418筛选,获得稳定转染的肝癌细胞系HepG2/lis,通过免疫荧光染色、RT-PCR和Western blot法鉴定lis在细胞中的表达;采用Lambert法对细胞内lis酶的活性进行分析;采用MTT法观察稳定转染细胞系生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠成瘤实验分析其体内成瘤特性。结果 lis基因能稳定整合于真核细胞中,并包装出具备β-葡萄糖苷酶活性的蛋白。lis在细胞中的稳定表达对细胞形态、生长特性、细胞周期、体内成瘤性等生物学特征并无明显影响。结论成功构建含lis基因的稳定转染肝癌细胞系,为将lis自杀基因系统应用于肝癌的治疗提供了实验基础。     

HBx基因大鼠卵圆细胞株的建立及鉴定

目的 构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达质粒pEGF-HBx,建市稳定、高效表达乙型肝炎病毒x基因(HBx)的大鼠卵圆细胞株,以便进一步研究HBx基因和卵圆细胞在肝癌发牛过程中的作用和机制.方法 用PCR方法从质粒pcDNA3.1-HBx中扩增含Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的HBx基因序列.对增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-NI)及扩增的HBx目的 基因片段进行双酶切,纯化后用连接酶连接得到重组体pEGFP-HBx,将其转化大肠杆菌DHSα,抗生素筛选培养得到阳性克降,提取质粒后用双酶切和基因测序进行鉴定.通过脂质体介导将质粒pEGFP-HBx转染到大鼠卵圆细胞株(LE/6)中,经G418筛选,尤限传代后得到稳定表达EGFP-HBx融合蛋白的细胞株.分别采用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测细胞株中HBx基凶的表达情况.结果 双酶切及基因测序结果均显示构建的pEGFP-HBx质粒中含有完整的HBx基因片段.将得到的抗性细胞株培养传代20次后仍表达强的荧光;RT-PCR及免疫细胞化学检测均发现HBx基因在抗性细胞(LE/6)中得到了稳定转录和翻译.结论 已成功构建带HBx基因的真核表达质粒pEGFP-HBx,获得了稳定、高效表达EGFP-HBx融合蛋白的大鼠卵圆细胞株,为进一步研究HBx基凶和卵圆细胞在肝癌发生过程中的作用和机制奠定了实验基础.     

bFGF基因修饰雪旺细胞表达的实验研究

目的 利用基因工程技术将外源bFGF基因以质粒pcDNA3.1为载体导入大鼠雪旺细胞,观察外源bFGF基因在雪旺细胞中的表达水平.方法 通过预变性大鼠坐骨神经、混合酶消化法获取高纯度的雪旺细胞;将真核表达质粒pcDNA3.1及外源bFGF基因片段双酶切,酶切片段回收后重组bFGF-pcDNA3.1质粒;通过脂质体转染法将pcDNA3.1-bFGF质粒导入雪旺细胞,用EIASA及RT-PCR方法分别从蛋白质水平及mRNA水平检测bFGF的表达情况.结果 经外源bFGF基因修饰的大鼠雪旺细胞,bFGF的表达水平极大提高(H=126.835,v=2,P=0.000),并且相对持续、稳定.结论 bFGF基因修饰的雪旺细胞能持续稳定高水平地表达分泌bFGF,将bFGF基因与雪旺细胞移植载体相结合治疗脊髓损伤具有独特的优势,为下一步bFGF基因修饰细胞治疗大鼠脊髓损伤的实验研究奠定了基础.     

大鼠葡萄糖转运体3真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建大鼠葡萄糖转运体3（GLUT3）的真核表达载体，为进一步研究葡萄糖转运体3对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定基础。方法以逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）的方法从大鼠脑组织中获取GLUT3全长cDNA片段，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-Glut3，随后用Lipofectamine^TM2000介导转染HEK293细胞，以RT-PCR的方法检测重组质粒在mRNA水平的表达，以免疫组织化学的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。结果克隆的大鼠GLUT3全长cDNA大小约1．5kb且无碱基突变，以构建的重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-Glut3转染293细胞后，在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体3的表达。结论成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体3的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-Glut3，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因。     

Tip30真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的：探讨人Tip30全长基因的真核表达载体pAAV-TIP30的构建,并观察其转染肝癌细胞株HepG2后的表达。方法：以正常人肝组织mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增Tip30,利用限制性内切酶BamH I和Xba I,将Tip30基因克隆到真核表达载体pAAV-MCS中,并经酶切和测序鉴定。重组质粒转染HepG2细胞,运用Western blot法检测Tip30蛋白表达。结果：RT-PCR方法正确地扩增出全长Tip30基因。限制性内切酶酶切和测序结果证实Tip30基因克隆完全正确。重组质粒转染肝癌细胞系HepG2后,Western blot证实Tip30蛋白表达增高。结论：成功构建了真核表达重组质粒pAAV-TIP30并转染HepG2细胞,为进一步研究Tip30基因对肝癌的影响及其机制打下了基础。