上皮细胞黏附分子表达与乳腺癌的分子分型及预后

目的：探讨上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)在乳腺癌及其分子亚型中表达的临床病理及预后意义。方法：采用免疫组织化学MaxVisionTM法检测835例乳腺浸润性导管癌中EpCAM的表达,分析其与临床病理特征和预后的关系。结果：EpCAM的阳性表达与组织学分级、淋巴结转移、肿瘤大小、ER和PR表达、HER2表达和临床分期均有关(均P<0.05),与绝经状态无关(χ2=0.117,P=0.733)。在腺腔A型、腺腔B型(HER2−)、腺腔B型(HER2+)、HER2过表达型及三阴型乳腺浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma,IDC)中, EpCAM的阳性表达率分别为19.2%,73.0%,48.9%,72.2%和62.1%。Log-rank检验和单因素COX分析显示EpCAM阳性患者的预后较差(均P<0.001),并与三阴型、腺腔B型(HER2−)和HER2过表达型预后有关(均P<0.05)。多因素COX分析显示EpCAM阳性表达与三阴型和HER2过表达型预后差相关(均P<0.05)。结论：EpCAM可能与乳腺癌进展有关,并与分子分型相关,在乳腺癌总体上及三阴型和HER2过表达型中是一种独立的预后因子。     

人信号传导及转录激活因子shRNA载体的构建与鉴定

目的：构建针对人信号传导及转录激活因子1（STAT1）基因的shRNA表达载体,检测其对STAT1基因的沉默效果。方法设计针对STAT1的shRNA序列,克隆到pGPU6质粒载体,并进行测序、转染和鉴定。结果 DNA测序显示成功构建了4个shRNA表达载体。shRNA能有效抑制STAT1基因在人宫颈癌细胞株TZM- bl细胞中的表达,抑制率为63%。结论成功构建了针对人STAT1基因的shRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo- shRNA STAT1。     

RNA干扰对胆囊癌细胞上皮细胞黏附因子表达的影响

目的:观察RNA干扰(RNAi)对胆囊癌GBC-SD细胞株中上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EP-CAM)表达的抑制作用。方法:针对EP-CAM基因的不同位点构建4个miRNA重组质粒。经DNA测序后,用LipofectamineTM2000介导转染人胆囊癌GBC-SD细胞株,48 h后用RT-PCR和Western blot检测EP-CAM的mRNA和蛋白的表达变化情况。结果:经测序分析证实,靶向EP-CAM的4个miRNA重组质粒均构建成功。RT-PCR及Western Blot技术显示,4个重组质粒均不同程度地抑制靶基因EP-CAM的表达。结论:针对人EP-CAM基因的miRNA表达载体能有效地下调GBC-SD细胞中EP-CAMmRNA及蛋白的表达。     

膜联蛋白Ⅱ基因短发夹RNA表达载体的构建和鉴定

目的:构建针对膜联蛋白(annexin)Ⅱ的短发夹RNA(shRNA)的表达载体,观察其对目的基因表达的影响.方法:根据GenBank中annexinⅡ基因已知序列设计了2条序列,即annexinⅡshRNA1、annexinⅡshRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照.据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接人pGenesil1载体,转化扩增后进行序列测定.3种重组表达载体均转染HEK293细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western印迹法分别在基因和蛋白水平上检测各自annexinⅡ的表达,以未转染细胞作为空白对照.结果:3种重组表达载体(pGenesil1-annexinⅡshRNA1、pGenesil1-annexinⅡshRNA2和pGenesil1- negative shRNA)经限制性酶切及测序分析证明基因插入正确.转染HEK293细胞后,转染pGenesil1-annexinⅡshRNA2组细胞annexinⅡ基因和蛋白表达明显低于转染pGenesil1-annexinⅡshRNA1、pGenesil1-negative shRNA以及空转染细胞(P＜0.05),而后三者间没有明显差异.结论:成功构建了针对annexinⅡ的shRNA表达载体(pGenesil1-annexinⅡshRNA2),转染细胞后可抑制annexinⅡ基因表达.     

Ku70 基因RNA 干扰载体的构建及干扰效果鉴定

目的构建靶向Ku70基因的RNA干扰(RNAi)表达载体并进行RNAi效果鉴定。方法设计3个针对Ku70基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染Hela细胞系。在转染24、48、72 h后,通过免疫印迹分析检测Ku70蛋白的表达量。把RNAi效果最显著的siRNA设计成短发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA),克隆入pSi-lencerTM 4.1-CMV hygro载体,转染Hela细胞系并筛选稳转细胞株,在mRNA和蛋白水平,评估Ku70 siRNA的干扰效果。结果 siRNA转染Hela细胞24、48 h后,Ku70蛋白的表达没有显著变化,但在72 h后,蛋白的表达量显著下降。在具有稳定表达siRNA的稳转细胞株中,Ku70基因的表达在mRNA水平和蛋白水平都受到了非常明显的抑制。结论成功构建靶向Ku70基因RNAi载体,并筛选出效能最优序列,为进一步研究Ku70基因的表达与宫颈癌放射治疗敏感性的关系奠定了基础。     

TGF-β1基因特异性shRNA真核表达载体的构建及其基因抑制作用

目的:构建针对人TGF-β1基因的shRNA表达载体并评价其在人脐静脉内皮细胞株中对TGF-β1基因的抑制作用,筛选出高效的表达载体以用于后续的RNAi研究.方法:利用生物信息学方法设汁shRNA,在人TGF-β1基因的mRNA序列中选择靶序列,设计并合成编码的shRNA的两条寡核件酸序列,经退火成互补双链,再克隆至PGenesil-1质粒.构建2个表达载体PCenesil-TGF-β1-1(pT11)和PGenesil-TGF-β1-2(pT12),酶切及测序证实后转染至人脐静脉内皮细胞株(ECV304)中,错构载体(pHK)为阴性对照.转染后采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测TGF-β1mRNA表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定TGF-β1蛋白质的表达.结果:酶切及测序证实表达载体pT11、pT12构建成功,两个表达载体的转染率为38.2%和40.1%,两个表达载体对人脐静脉内皮细胞株TGF-β1基因的转录抑制率为58.1%和60.0%,蛋白表达抑制率为38.9%和44.3%.结论:成功构建的针对人TGF-β1基因的shRNA表达载体对脐静脉内皮细胞株FGF-β1基因的转求有明显的抑制作用,并以表达载体pT12的效果为优,为后续移植肾肾病基因治疗的研究奠定了基础.     

HnPNPB1基因短发夹环RNA载体的构建与鉴定

目的 利用RNA干扰（RNA interfering,RNAi）技术,构建HnRNPB1表达载体,并进行鉴定。方法 采用H1启动子,分别把被7bP序列间隔的21bp长短的HnRNPB1靶序列的反向重复序列,置于PsiRNA-hH1neoG2质粒中,分别构建HnRNPB1短发夹环RNA（shRNA）,产生重组质粒PSiRNA—hHl neoG2 HnRNPB1。结果 将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,并作测序分析,经测序鉴定确定为所需序列。结论 针对HnRNPB1基因的特异性ShRNA真核表达载体PSiR—NA—hH1 neoG2 HnRNPB1的成功构建,为进一步研究其基因功能打下基础。     

一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

目的 建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法.方法 制备包含单一限制性内切酶Cta Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段(Cla Ⅰ位点两侧碱基序列不互补).与BamH Ⅰ和Hind Ⅲ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含Cla Ⅰ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ.用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含Cla Ⅰ识别序列)做连接反应.构建GFP shRNA表达质粒.提取阳性克隆质粒DNA,行Cla Ⅰ单酶切鉴定,对未被Cla Ⅰ线性化的质粒行DNA测序鉴定.结果 DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,以pSilencer-4.1-Cla Ⅰ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被Cla Ⅰ线性化的均为GFP shRNA表达质粒.结论 构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,所引入的单一的Cla Ⅰ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒.     

人Smad3的shRNA表达载体构建和鉴定

目的：构建人Smad3的shRNA表达载体，运用RNAi下调Smad3基因在肿瘤细胞系中的表达，观察对肿瘤细胞生长的影响．方法：化学合成针对人smad3基因的dsRNA，瞬时转染入Hela细胞，检测RNA干扰效果，筛选有效干扰靶位点；设计并合成针对人smad3基因的siRNA寡核苷酸链，经退火形成双链后克隆入质粒载体pSilencer^TM3．1-H1hygro，转染入Hela细胞，用hygromycinB筛选稳定单克隆细胞株，对细胞株行RT-PCR和Western Blot检测，观察siRNA对靶基因的抑制效果，进一步研究下调目的分子表达水平以后肿瘤细胞生长的变化．结果：瞬时转染筛选到了有效的RNA干扰靶位点，构建载体后，建立稳定转染的单克隆细胞株，smad3mRNA和蛋白质水平均显著下调，导致肿瘤细胞生长抑制．结论：成功构建了针对人Smad3高效、特异、作用持久的shRNA表达载体，转染细胞后可下调Smad3的表达，为进一步研究smad3的功能和肿瘤的基因治疗奠定了基础．     

人Smurf1 shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建三条人Smurf1 shRNA真核表达载体,以逆转TGF-β1诱导人HK-2细胞转分化。方法：针对人Smurf1基因设计,采用体外转录生物合成的特异性短发夹RNA（shRNA）双链分子,对重组质粒（命名为pSilencer-S1 shRNA、pSilencer-S2 shRNA、pSilencer-S3 shRNA）进行1%琼脂糖凝胶电泳,初步鉴定及测序鉴定。结果：1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定证实Smurf1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入序列测序结果与合成序列结果一致。结论：Smurf1 pSilencer-S1 shRNA、pSilencer-S2 shRNA、pSilencer-S3 shRNA真核表达载体构建成功。     

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定

目的:利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的载体,并进行活性鉴定.方法:设计表达短发夹RNA的互补DNA序列,经退火成双链,克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析.构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞,检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化,确定重组质粒的活性.结果:构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2.酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达.结论:成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体.     

EGFR靶向shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建干扰表皮生长因子受体(EGFR)的pSilencerTM-EGFR表达质粒,转染入非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞株,为观察对EGFR的沉默效应奠定基础.方法 ①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以pSilencerTM2.1-U6-hygro质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5α大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体2000分别转染人类非小细胞肺癌细胞株A549,用潮霉素(HygromycinB)筛选阳性克隆.结果 ①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4种重组干扰质粒,分别命名为pSilencerTM-EGFRⅠ、pSilencerTM-EGFRⅡ、pSilencerTM-EGFRⅢ和pSilencerTM-EGFRⅣ;②成功转染A549细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆.结论 利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入A549细胞.     

靶向增强绿色荧光蛋白shRNA的真核表达载体构建

目的构建针对增强绿色荧光蛋白（EGFP）的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6。方法设计并合成针对EGFP的shRNA DNA片段,退火后连接到真核表达载体pGenesil-1上,通过测序证实载体构建成功;用脂质体将构建正确的质粒转染到中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中,72 h后在荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果测序证实针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6构建正确;荧光显微镜下观察转染pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6质粒的CHO细胞中,荧光明显减少。结论针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6能明显干扰EGFP的表达。     

shRNA表达质粒对转基因小鼠HBV的抑制作用

目的观察shRNA表达质粒对转基因小鼠HBV的抑制作用。方法将质粒DNA采用Hydrodynamic技术注入HBV转基因小鼠体内,观察血清ALT和AST水平、血清HBsAg和肝组织HBcAg表达和HBVmRNA的变化。结果在注射质粒后,ALT和AST呈一过性升高,3天后降至正常;血清HBsAg和肝细胞内HBcAg表达减少,蛋白抑制至少持续14天;质粒注射后第5天,实验组肝脏HBVmRNA与注射前相比明显减少,而对照组HBVmRNA信号无明显变化。结论shRNA表达质粒对HBV转基因小鼠HBV有抑制作用。     

靶向YWHAE基因shRNA慢病毒表达质粒的构建及功能验证

目的 构建靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表达质粒,并验证其对AGS胃癌细胞增殖的影响. 方法 设计并合成5对针对人YWHAE基因的shRNA序列,分别克隆入pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达质粒,接着将重组的慢病毒表达质粒和包装质粒PHR、包膜质粒VSVG一起采用磷酸钙法转染293T细胞包装慢病毒,收集制备的慢病毒感染AGS细胞,用抗生素Puromycine进行筛选.Western-blot检测感染细胞YWHAE蛋白的表达.选取干扰效率最高的慢病毒表达质粒,针对性设计siRNA的点突变引物,重叠延伸PCR法扩增获得点突变的YWHAE基因,克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A载体,构建YWHAE点突变的表达质粒,转染YWHAE沉默效果最好的AGS细胞株,Western-blot检测转染细胞YWHAE蛋白的回复表达.采用MTS法检测YWHAE-shRNA慢病毒对AGS细胞增殖的影响. 结果 5对针对人YWHAE基因的shRNA序列构建的慢病毒中,pLL3.7-siYWHAE-5包装成的慢病毒抑制AGS细胞的YWHAE蛋白表达的效果最明显,仅为对照组相对表达量的(0.269±0.083)倍;pLL3.7-siYWHAE-5包装的慢病毒,其干扰效应可经由YWHAE点突变表达质粒回复.与对照组比较,YWHAE-shRNA组AGS细胞增殖能力明显下降. 结论 成功构建了靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表达质粒,获得YWHAE基因表达显著下调的AGS细胞株;探明YWHAE表达的下调可有效抑制AGS细胞的增殖,提示YWHAE在胃癌中的致癌潜能.     

靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞。     

针对PKM2多位点RNAi质粒载体的构建和筛选

目的：构建针对M2型丙酮酸激酶（PKM2）基因3个可干扰序列设计小发夹RNA（small hairpin RNA,shRNA）载体,为下一步探索Ad-PKM2介导PKM2 RNAi对乳腺癌细胞作用及机制建立基础。方法：根据RNAi设计软件设计并合成3对shRNA模板序列,依次将它们克隆至pGenesil载体中构建重组质粒,通过MTT检测筛选出对乳腺癌细胞株MCF-7增殖效应影响最强的RNAi序列。结果：酶切鉴定和测序结果证实RNAi载体构建成功,均能高效感染MCF-7并抑制MCF-7细胞的增殖,pGenesil-PKM2-（1＋2＋3）的抑制能力最强。结论：针对PKM2多靶点RNAi载体成功构建,为下一步研究PKM2被沉默后细胞生物学行为的变化打下基础。     

细胞周期相关因子CDCA3基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,构建能有效下调CDCA3蛋白表达的shRNA真核表达载体,研究其对CDCA3表达的影响,以便进一步研究CDCA3的功能。方法根据文献获得CDCA3的siRNA靶序列,依据RNA干扰机制和shRNA靶序列的设计原则,以CDCA3基因为靶基因,合成一对编码shRNA的两条DNA序列,经退火后合成DNA双链,再克隆至shRNA表达载体pSIREN-DNRDsRed质粒中,连接产物转化E.coilJM109感受态细胞,然后挑取克隆提质粒,进行酶切鉴定和DNA序列测定。将构建成功的载体通过脂质体介导转染导入人胚肾HEK293细胞,采用Western blot法和Realtime RT-PCR,检测特异性shRNA对CDCA3蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果。结果成功构建靶向CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体;转染HEK293细胞后,可显著下调CDCA3在细胞内的mRNA水平及蛋白表达水平。结论 CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体能显著下调HEK293细胞内的CDCA3蛋白表达。成功构建CDCA3 shRNA表达载体,为进一步研究CDCA3基因的功能提供了实验基础。     

大鼠血管内皮生长因子shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制角膜新生血管的研究做准备.方法:用DNA重组技术根据大鼠VEGF mRNA序列设计并合成3条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pSihncer2.0 U6中,进行酶切鉴定和测序.结果:酶切证明构建的shRNA序列已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠VEGF shRNA表达质粒.结论:成功构建了3条大鼠VEGF shRNA真核表达质粒,为靶向VEGF的RNAi抑制角膜新生血管奠定了基础.     

LHR真核表达载体构建及表达

目的构建黄体生成素受体（LHR）真核表达质粒载体和建立稳定高表达LHR的乳腺癌细胞株。方法KpnI／Hpa工双酶切LHR-cDNA质粒载体获得目的基因,定向克隆构建pcDNA3．1（4-）真核表达载体,酶切图谱和序列分析鉴定;重组质粒载体经脂质体转染MCF-7乳腺癌细胞,G418筛选,RT-PCR、细胞内cAMP测定,筛选鉴定高表达LHRMCF-7细胞。结果重组质粒pcDNA3．1（4-）-LHR酶切图谱分析结果、序列分析证明pcDNA3．1（4-）-LHR载体中LHR序列与GenBank的LHR基因序列完全相符。RT-PCR检测MCF-7细胞LHRmRNA,MCF-7细胞内cAMP浓度测定,证实MCF-7细胞高表达LHR。结论构建并转染pcDNA3．1（4-）-LHR真核表达载体,在MCF-7细胞中稳定表达,为探讨hCG对乳腺癌细胞的作用提供实验基础。