槲皮素对NIH-3T3细胞氧化损伤的保护作用

目的探讨槲皮素对NIH-3T3细胞氧化损伤的保护作用。方法取处于对数生长期的3T3细胞,平均分为以下四个实验组。槲皮素前保护组(Q1组):先加含有50μmol/L槲皮素培养液培养24h,再换含有0.5mmol/LH2O2的培养液培养30min。槲皮素后保护组(Q2组):先加含有0.5mmol/LH2O2的培养液培养30min;再换含有50μmol/L槲皮素培养液培养24h;H2O2损伤组(H2组):先加含有0.5mmol/LH2O2的培养液培养30min,再换仅含有10%的胎牛血清的培养液培养24h。对照组(C组):仅加10%胎牛血清的DMEM培养液培养24h。收集并裂解各组细胞,检测细胞内T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH、NOS、NO、MDA的变化,应用MTT实验检测3T3细胞的生存率。结果Q1与Q2、H2组相比,Q1组细胞内T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH均有增加,NOS、NO无明显改变,MDA减少,细胞存活率明显增加。结论槲皮素可能是通过上调抗氧化酶系活性对3T3细胞的氧化损伤产生保护作用。     

金银花抗氧化作用的分子学机理研究

目的探讨金银花抗氧化作用分子学机理。方法采用过氧化氢（H2O2）作用于人正常RBL肝细胞，制作氧化应激损伤的细胞模型。将培养的细胞分为四个实验组：正常对照组（C），H2O2损伤组（H2），金银花前保护组（Jb），金银花后保护组（Ja）。采用TUNEL和DNA Ladder法，检测各组细胞凋亡情况。应用免疫组化和Western blot观察各组细胞的HSP-70、NF-kB、Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达及免疫反应活性。应用MTT实验检测RBL细胞的生存率。结果Jb组的细胞凋亡率明显低于H2和Ja组，Bcl-2表达增高，HSP-70、NF-kB、Bax和Caspase-3的表达降低。结论金银花对RBL细胞氧化应激损伤具有一定保护作用．且前保护作用效果好于后保护作用，其保护作用机理可能是通过抑制HSP-70和NF-kB的表达，阻抑NF-kB信号传导途径并提高细胞内抗氧化防御酶系水平。     

乙醇对小鼠胰岛瘤细胞凋亡的影响及其分子机制

目的观察乙醇对小鼠胰岛瘤细胞(NIT-1细胞)凋亡的影响及Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的变化,探讨乙醇诱发小鼠胰岛瘤细胞凋亡的分子机制。方法体外培养的小鼠NIT-1细胞,不同剂量乙醇(0、50、100、2004、00 mmol/L)作用24 h,单细胞凝胶电泳实验(SCGE),AnnexinV/PI双标记法流式细胞仪检测细胞凋亡情况。不同剂量的乙醇作用6、122、4 h,RT-PCR法检测与凋亡有关的基因Bcl-2,Bax和Caspase-3 mRNA表达水平。结果SCGE实验结果显示,低剂量乙醇损伤不明显,高剂量(2004、00 mmol/L)组DNA迁移率、DNA损伤程度分级、DNA平均迁移长度与对照组比较,差异均有显著性。AnnexinⅤ/PI检测结果表明,2004、00 mmol/L乙醇组NIT-1细胞凋亡率升高,与对照组相比,差异有非常显著性。乙醇作用6 h,随着乙醇剂量增加,Bcl-2/Bax mRNA表达先升高后降低;乙醇作用12 h,400 mmol/L剂量Bcl-2/Bax比值下降;作用24 h,各剂量组Bcl-2/Bax比值均下降。Caspase-3 mRNA表达水平与乙醇剂量和作用时间相关。400 mmol/L剂量组作用24 h,Caspase-3 mRNA表达增加。结论乙醇可诱发体外培养的NIT-1细胞凋亡,凋亡的发生很可能与Bcl-2家族和Caspase-3激活有关。     

miRNA-21通过对血小板源性生长因子B和血管内皮生长因子的调控促进肝星状细胞活化的研究

目的 研究miRNA-21通过对血小板源性生长因子B（PDGF-B）和血管内皮生长因子（VEGF）的调控促进肝星状细胞（HSC）活化的分子机制。方法 将大鼠肝星状细胞HSC-T6分为正常组、酒精组、miRNA-21模拟物组和miRNA-21抑制剂组。正常组给予含有10%胎牛血清的DMEM培养基正常培养48 h;酒精组给予含有100 mmol·L^-1乙醇和10%胎牛血清的DMEM培养基培养48 h; miRNA-21模拟物组将miRNA-21模拟物用Lip3000转染试剂瞬时转染入细胞，再用含有100 mmol·L^-1乙醇和10%胎牛血清的DMEM培养基培养48 h; miRNA-21抑制剂组将miRNA-21抑制剂用Lip3000转染试剂瞬时转染入细胞，再用含有100 mmol·L^-1乙醇和10%胎牛血清的DMEM培养基培养48 h。用CCK-8实验检测细胞的增殖情况，用蛋白质印迹法检测PDGF-B和VEGF因子的表达情况。结果 正常组、酒精组、miRNA-21模拟物组和miRNA-21抑制剂组的细胞增殖率分别为0.17...     

脂脉宁对H_2O_2诱导VEC-304细胞表达NF-kB及HSP-70的影响

目的探讨脂脉宁对过氧化氢(H2O2)诱导血管内皮(VEC)-304细胞NF-kB及HSP-70表达的影响。方法将VEC-304细胞分4组:对照组、H2O2组、试验1组(脂脉宁大剂量)、试验2组(小剂量)。采用免疫组化、Western blot分析法,观察H2O2诱导VEC-304细胞的NF-kB及HSP70蛋白的表达。结果H2O2组NF-kB、HSP-70的表达比对照组均明显上调;而试验1、2组细胞NF-kB、HSP-70的表达均明显较H2O2组下调;1组与2组比,NF-kB的下调更明显。结论H2O2可诱导VEC-304细胞NF-kB、HSP-70高表达,而脂脉宁可使其表达下调。     

槲皮素通过靶向GAS5/Notch1信号通路促进乳腺癌细胞凋亡的研究

目的探讨槲皮素对乳腺癌细胞促凋亡作用的可能机制。方法用槲皮素处理乳腺癌MCF-7细胞后,采用MTT法检测细胞活力;平板克隆实验检测细胞增殖克隆能力;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;同时,分别采用槲皮素(40、80、160μmol·L^-1)、GAS5小干扰RNA(siGAS5)、槲皮素(80μmol·L^-1)协同siGAS5处理细胞后,qRT-PCR法和Western blot法检测GAS5、Notch1、Jagged1、Hes1、Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达。结果槲皮素(40、80、160μmol·L^-1)处理MCF-7细胞后,发现40μmol·L^-1槲皮素可明显抑制增殖,而80、160μmol·L^-1槲皮素不仅明显抑制增殖且诱导凋亡;槲皮素(40、80、160μmol·L^-1)可上调GAS5、Bax和Caspase-3的表达,下调Notch1、Jagged1、Hes1和Bcl-2的表达;细胞转染siGAS5后,与sncRNA组相比,GAS5、Bax和Caspase-3表达下调,Notch1、Jagged1、Hes1和Bcl-2表达上调;当siGAS5与槲皮素(80μmol·L^-1)共处理细胞后,与sncRNA加槲皮素对照组相比,GAS5、Bax和Caspase-3表达下调,Notch1、Jagged1、Hes1和Bcl-2上调。结论槲皮素通过靶向GAS5/Notch1信号通路促进乳腺癌细胞凋亡。     

小鼠前脂肪细胞3T3-L1培养与四联诱导分化方法的探讨

摘要： 目的 改进小鼠前脂肪细胞 3T3-L1 的培养并诱导分化为成熟脂肪细胞的方法。方法 使用含有 10％胎牛血清 （FBS） 的高糖型 DMEM 液体培养基常规培养小鼠前脂肪细胞, 2~3 d 换液 1 次。细胞按诱导分化方式的不同分为三联诱导组和四联诱导组。三联诱导组诱导分化培养基Ⅰ成分为常规培养基基础上加用人胰岛素 10 mg/L, 1- 甲基-3-异丁基黄嘌呤 （IBMX）0.5 mmol/L, 地塞米松 （DEX） 1.0 μmol/L; 四联诱导组诱导分化培养基Ⅰ的成分为在三联诱导组基础上加入吲哚美辛 0.1 mmol/L。2 组均诱导分化培养基Ⅰ培养 2 d, 连续诱导 2 次后换用诱导分化培养基Ⅱ, 成分为： 高糖型 DMEM 培养基含 10 %胎牛血清、 100 U/mL 青霉素和 100 mg/L 链霉素混合液, 人胰岛素 10 mg/ L。培养 2 d, 连续诱导 2 次。倒置显微镜和油红 O 染色观察诱导前及诱导后 2 组细胞的形态变化。结果 小鼠前脂肪细胞 3T3-L1 状态良好, 呈现铺路石状生长, 均匀布满培养瓶底, 2 d 传代 1 次。四联诱导组诱导分化结果优于三联诱导组。三联诱导剂诱导前脂肪细胞后, 细胞形态并未发生明显变化。四联诱导剂诱导前脂肪细胞后, 可达到 90％以上的成熟脂肪细胞。成熟的脂肪细胞呈圆形, 有大量脂滴聚集, 油红 O 染色显现橘红色。结论 在三联诱导基础上加入吲哚美辛的四联诱导法可以更好地促进脂肪前体细胞分化。     

长链非编码RNA PCGEM1通过转化生长因子β2/果蝇母源抗皮肤生长因子蛋白2信号通路调控膀胱尿路上皮癌细胞侵袭和转移的研究

目的 探讨长链非编码RNA PCGEM1（LncRNA PCGEM1）通过转化生长因子β2/果蝇母源抗皮肤生长因子蛋白2（TGF-β2/Smad2）信号通路调控膀胱尿路上皮癌（BUCC）细胞侵袭和转移。方法 将BUCC细胞分为空白对照组、T24-siNC组和T24-siPCGEM1组。空白对照组置于10%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养;T24-siPCGEM1组和T24-siNC组分别用Lipofectamine 2000将10μmol·L^-1的siPCGEM1和阴性对照siNC转染至细胞,然后置于10%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养。用实时荧光定量聚合酶链反应检测LncRNA PCGEM1的表达水平,用平板克隆实验检测细胞增殖情况,用蛋白质印迹法检测TGF-β2和Smad2的表达情况。结果 T24-siPCGEM1组、T24-siNC组和空白对照组的细胞克隆数分别为（192.83±15.59）,（419.00±52.15）和（432.83±57.74）个,TGF-β2相对表达量分别为0.08±0.01,0.39±0.05和0.41±0.05,Smad 2...     

二苯乙烯苷、大黄素改善高糖诱导下小鼠海马神经元凋亡

目的 探讨何首乌主要成分二苯乙烯苷（TSG）、大黄素（Emodin）对高糖诱导下海马神经元HT-22细胞凋亡的影响。方法 将小鼠海马神经元HT-22细胞分为4组：对照培养基组（NC组,葡萄糖浓度25 mmol/L）、高糖培养基组（HG组,葡萄糖浓度55 mmol/L）、HG+TSG组和HG+Emodin组。HG+TSG组和HG+Emodin组分别用TSG和Emodin以50、100、200μmol/L的浓度作用细胞12、16、20、24、48 h,CCK-8法检测细胞存活率,确定细胞的最佳作用浓度和时间。流式细胞术检测细胞凋亡率;通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测4组细胞组蛋白乙酰化转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性;蛋白免疫印迹（Western blot）检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达。结果 TSG以200μmol/L、48 h,Emodin以100μmol/L、48 h作用细胞为最适条件。流式细胞术结果显示,TSG和Emodin干预细胞48 h后,细胞凋亡率显著...     

8-Br-cAMP联合槲皮素对人食管癌Eca-109细胞的逆转化作用

目的探讨8-Br-cAMP与槲皮素联合用药对人食管癌Eca-109细胞逆转化的作用。方法将培养的Eca-109细胞随机分为4组:①8-Br-cAMP组(Br):加终浓度为2×10-5mol/L8-Br-cAMP;②槲皮素组(Q):加槲皮素终浓度为43μmol/L;③8-Br-cAMP和槲皮素共同作用组(Br+Q):加终浓度为2×10-5mol/L8-Br-cAMP和终浓度为43μmol/L的槲皮素;④对照组(C):仅加DMEM培养液(含10%胎牛血清)。同时培养48h后分别对以上4组细胞制备细胞滴片及硝酸纤维素膜滴膜两种标本,进行Caspase-3和PCNA的免疫组化和免疫斑点印迹实验;应用完整细胞原位斑点印迹杂交技术检测c-myc、野生型p53(wtp53)、p16和EGFR的基因表达;并进行分化细胞/增殖细胞计数。结果8-Br-cAMP与槲皮素联合或单独应用均可上调Caspase-3免疫反应信号的表达,下调PCNA免疫反应信号的表达;同时上调wtp53和p16基因的表达,下调c-myc和EGFR基因的表达;且分化细胞的比率显著提高。结论8-Br-cAMP与槲皮素联合用药或单独用药均可通过调控人食管癌Eca-109细胞癌基因和抑癌基因的表达对Eca-109细胞起到生长抑制和促分化的作用。     

双氧水加顺铂腹腔灌洗对肿瘤细胞的影响

目的: 探讨双氧水加顺铂腹腔灌洗对肿瘤细胞的影响,为临床腹腔灌洗防治胃癌腹腔种植奠定实验基础.方法: 利用胃癌细胞的形态学改变和腹水癌小鼠的平均存活期来观察不同处理因素(双氧水组、DMEM对照组、顺铂组和双氧水加顺铂组)腹腔灌洗对肿瘤细胞的影响.结果: 经双氧水加顺铂组处理的细胞核改变的比率明显高于对照组、双氧水组和顺铂组.双氧水加顺铂腹腔灌洗组的小鼠平均存活期14.1d,明显长于对照组的4.5d、双氧水组的8.4d和顺铂组9.3d.结论: 双氧水加顺铂腹腔灌洗对胃癌细胞具有杀伤作用,能明显延长腹水癌小鼠的平均存活期.     

咖啡酸苯乙酯通过Nrf-2途径抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡

目的 探讨Nrf-2途径在咖啡酸苯乙酯(CAPE)抑制地塞米松(DEX)诱导成骨细胞凋亡中的作用.方法 用细胞贴壁法培养小鼠颅顶前骨细胞(MC3T3-E1),采用10μmol/L DEX建立细胞损伤模型,以不同浓度CAPE(0.05、0.25、1μmol/L)预处理细胞2h后加入地塞米松共孵育24h;细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖活性;依据CCK-8检测结果确定药物浓度后将实验分为对照组、咖啡酸苯乙酯组(CAPE组)、地塞米松组(DEX组),咖啡酸苯乙酯+地塞米松组(CAPE+DEX组);DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3酶活性,Western blot法检测Nrf-2 途径相关蛋白Nrf-2和血红素氧合酶1(heme oxygenase,HO-1)蛋白表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 10μmol/L DEX作用下细胞形态发生明显变化,损伤作用明显.与对照组相比,DEX组内细胞存活率显著下降(P＜0.01),而细胞内 ROS水平、细胞凋亡率及Caspase-3酶活性显著增加(P＜0.01);同时,Nrf-2途径相关蛋白 Nrf-2及HO-1表达量减少,差异有统计学意义(P＜0.01).与DEX组相比,CAPE+DEX组细胞存活率显著上升(P＜0.01),Nrf-2途径相关蛋白 Nrf-2及HO-1表达明显增加(P＜0.01);此外,CAPE+DEX组细胞内 ROS 水平、细胞凋亡率及Caspase-3酶活显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 咖啡酸苯乙酯可以通过Nrf-2途径降低细胞内ROS水平进而减轻地塞米松诱导的氧化应激所致细胞损伤及凋亡.     

小鼠3T3-L1前脂肪细胞培养与诱导分化方法的建立

目的建立小鼠3T3-L1前脂肪细胞的培养及诱导分化为成熟脂肪细胞的方法。方法使用含10%胎牛血清（FBS）的高糖达氏修正伊氏培养基（DMEM）-F12液体培养基在体积分数5%二氧化碳（CO2）、37℃条件下常规培养3T3-L1细胞,2~3 d换液1次;诱导分化培养基Ⅰ培养2 d,诱导分化培养基Ⅱ培养2 d;基础培养基培养4~6 d,1~2 d换液1次。结果小鼠3T3-L1前脂肪细胞状态良好,成铺路石状生长,布满培养瓶底,3 d传代1次。90%以上细胞诱导分化成功,细胞呈圆形,有大量酯滴聚集,油红O染色呈橘红色。结论建立了小鼠3T3-L1前脂肪细胞的培养方法和诱导分化方法,为肥胖相关药物研究奠定了方法基础。     

H_2O_2预处理对多巴胺损伤PC12细胞的适应性保护作用

目的探讨H2O2预处理对多巴胺(dopamine,DA)损伤PC12细胞的适应性保护作用。方法透射电镜、Hoechst染色和PI染色流式细胞仪(flowcytometry,FCM)观测细胞凋亡,MTT代谢率法观察细胞线粒体氧化磷酸化功能状态,Rh123染色FCM检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)。结果50μmol·L-1DA作用PC12细胞24h后,电镜可观察到PC12细胞体积缩小,核染色质浓缩、边集,核碎裂等细胞凋亡征象。Hoechst33258染色显示,DA(50μmol·L-1)作用24h后,经H2O2预处理的PC12细胞的凋亡量较未预处理的明显减少。50、100和200μmol·L-1DA作用24h后,PC12细胞的凋亡率分别为(20.9±1.8)%、(40.5±6.4)%、(88.1±3.9)%,而经H2O2预处理的PC12细胞的凋亡率分别下降至(4.9±2.9)%、(12.0±1.4)%、(61.5±3.4)%(P<0.01)。20、40、80μmol·L-1DA作用细胞24h后,细胞MTT代谢率明显下降,而H2O2预处理抑制20、40、80μmol·L-1DA引起的PC12细胞MTT代谢率的下降(P<0.01)。50μmol·L-1DA作用24h后,PC12细胞的平均Rh123荧光强度由正常对照的(46.87±0.33)下降至(4.39±2.93),而经H2O2预处理的PC12细胞,其平均Rh123荧光强度仅下降到(10.50±0.28),下降程度明显减轻(P<0.01)。结论H2O2预处理对DA损伤PC12细胞具有适应性保护作用。     

过氧化氢对FRTL细胞线粒体膜电位和超氧化物生成的影响

目的:探讨外源性过氧化氢(H2O2)对Fisher大鼠甲状腺细胞系(FRTL)线粒体膜电位(△ψ)和超氧化物生成的影响.方法:用1 mmol/L H_2O_2处理FRTL细胞10 min、30 min、24 h后,利用MitoSOX,通过活细胞影像法、流式细胞术检测线粒体超氧化物生成;利用罗丹明123(rh123),通过荧光分光光度计和荧光显微镜检测△ψ;MTT比色法检测细胞活力;光镜观察细胞形态学变化;吖啶橙(AO)染色检测细胞凋亡.结果:与对照组相比,1 mmol/L H_2O_2处理的FRTL细胞10 min、30 min、24 h,细胞内MitoSOX荧光强度明显增强,rh123荧光强度和MTT吸光度明显下降(P＜0.01),光镜下可见细胞脱壁、破碎,AO染色可见核变小、变圆,染色质浓缩、边集,核碎裂改变.结论:1 mmol/L H_2O_2急性处理(10 min,30 min)和慢性处理(24 h)均能明显增加FRTL细胞线粒体超氧化物生成,降低线粒体膜电位,造成细胞坏死和凋亡.     

自由基清除剂依达拉奉对H_2O_2损伤的PC12细胞释放谷氨酸的影响

目的:探讨H_2O_2对PC12细胞谷氨酸(GLU)释放的影响及依达拉奉的阻断作用。方法:用H_2O_2处理体外培养的PC12细胞建立细胞损伤模型,并加入不同剂量的依达拉奉(10~(-3),10~(-4),10~(-5),10~(-6), 10~(-7)mol·L~(-1)),显微镜下观察PC12细胞形态,MTT法检测活细胞存活率,GLU试剂盒测定细胞培养液中GLU的含量。结果:H_2O_2处理24 h后,细胞形态发生明显改变,胞体变小、突起缩回。MTT吸光值减小,活细胞数减少。GLU释放含量明显增加。依达拉奉组细胞形态明显改善,MTT吸光值显著增加, GLU释放含量明显降低。结论:在H_2O_2的作用下,PC12细胞GLU释放增加,加入依达拉奉后PC12细胞的GLU释放量减少。