含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

HBsAg S与GM—CSF融合基因在L929细胞中的表达

将乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）主蛋白的编码基因Ｓ与人ＧＭ－ＣＳＦ基因融蛤 后,插入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ１中,经质粒酶切鉴定及ＤＮＡ序列分析证明,目的基因插入ｐｃＤＮＡ１的ＣＭＶ启动子下降。以获得的重组质粒ｐＳＧＭ转染Ｌ９２９细胞,经ＲＴ－ＰＣＲ及细胞原位杂交证实目的基因的转录。     

E—选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定，将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入一以天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ＾－１４３细胞，用     

逆转录病毒载体介导的同种MHC基因在小鼠胸腺的 …

通过胸腺内注射质粒ＰＸＮ（Ｎ２－Ｂ１９－Ｈ－２Ｋ＾ｂ），表达外源性主要组织相容性抗原复合物（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏ－ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）抗原，为下一步诱导异基因小鼠器官移植耐受作准备。方法：通过ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠有腺内注射射质粒ＰＸＮ（Ｎ２－Ｂ１９－Ｈ－２Ｋ＾ｂ），将外源性的编码Ｃ５７ＢＬ／６小鼠ＭＨＣⅠ类抗原的Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ转移到ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠胸腺，用聚合酶链反     

骨骼肌注射乙型肝炎表面抗原基因在小鼠体内诱发乙肝表面抗…

将含有乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因的重组质粒ｐＡｃｔ－ＭＳ直接注入小鼠骨骼肌中，２周后加强免疫１次。免疫后４￣９周间，每周检测小鼠血清中ＨＢｓ。结果表明实验组６／８只小鼠ＨＢｓ为阳性，对照组８只小鼠均未检测到ＨＢｓ。本实验证实直接注射质粒ＤＮＡ外源基因能获得表达，并能引起免疫反应。     

骨骼肌注射乙型肝炎表面抗原基因在小鼠体内诱发乙肝表面抗原特异的免疫反应

将含有乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因的重组质粒ｐＡｃｔ－ＭＳ直接注入小鼠骨骼肌中，２周后加强免疫１次。免疫后４～９周间，每周检测小鼠血清中ＨＢｓ。结果表明实验组６／８只小鼠ＨＢｓ为阳性，对照组８只小鼠均未检测到ＨＢｓ。本实验证实直接注射质粒ＤＮＡ外源基因能获得表达，并能引起免疫反应。     

恶性疟原虫海南分离株FCC1／HN有性期特异抗原Pfs48／45基 …

采用基因工程技术,将编码恶性疟原虫有性期特异抗原Ｐｆｓ８／４５的基因克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３,并进行ＤＮＡ序列测定,再通过磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｐＦＳ４８／４５导入Ｈｅｌａ细胞,建立稳定分泌Ｐｆｓ４８／４５蛋白的阳性克隆株,结果显示,我国海南ＦＣＣ１／ＨＮ株Ｐｆｓ４８／４５抗原基因序鲁与ＨＦ５４株者高度同源,提示该基因在不同虫株高度保守,是研制疟疾疫苗的理想靶抗原     

E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

人细胞间粘附分子1基因功能区Ⅰ,Ⅱ的克隆及高效表达

用ＰＣＲ聚合酶链反应技术从人细胞间粘附分子１（ＩＣＡＭ－１）ｃＤＮＡ中获取了其编码细胞外氨基端功能区Ⅰ、Ⅱ１８５个氨基酸的ＤＮＡ序列，构建了重组质粒ｐＥＴ／ｒｓＩＣＡＭ－１。经转化宿主菌，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，薄层扫描和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ，证明目的基因在大肠杆菌中获得了高效表达。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核 …

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶ Ｃ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表达的核心抗原     

HL-60细胞中IL6基因的克隆及鉴定

目的：为探索性构建重组人白细胞介素６－绿脓杆菌外毒素融合蛋白（ＩＬ６－ＰＥ４０）以选择性杀伤高表达ＩＬ６受体（ＩＬ６Ｒ）的白血病细胞,本研究试图从人急性早幼粒细胞白血病细胞株（ＨＬ－６０）中克隆Ｎ－末端缺失２４个氨基酸的人ＩＬ６基因（ＩＬ６ｃＤＮＡ）并构建含此基因的重组质粒。方法：根据ＩＬ６基因序列设计合成可扩增ＩＬ６ｃＤＮＡ的特异性引物;利用基因重组技术,构建含ＩＬ６基因的重组质粒ｐＵＣ－ＩＬ６。结果与结论：本文首次从ＨＬ－６０中扩增出预期４８０ｂｐ的ＩＬ６ｃＤＮＡ,将其克隆至ｐＵＣ１８质粒中,命名为ｐＵＣ－ＩＬ６,并经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ双酶切电泳及序列分析鉴定加以确证,为进一步构建重组人ＩＬ６－ＰＥ４０奠定了坚实基础。     

人核糖体磷酸蛋白P2基因的克隆及鉴定

利用聚合酶链式反应技术（ＰＣＲ），从人肺巨细胞癌ＰＬＡ－８０１母系细胞系统克隆化高转移细胞株Ｄ中特异性扩增Ｐ２ ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ２ ｇｅｎｅ ｃＤＮＡ），并将扩增产物克隆入ｐＧＥＭ－３Ｚ载体，获得了重组质粒ｐＭＰ２，对其中两个克隆ｐＭＰ２－１、ｐＭＰ２－２的Ｐ２ ｃＤＮＡ进行了序列分析。结果表明：ｐＭＰ２－１的Ｐ２ｃＤＮＡ序列与文献报道基本     

恶性疟原虫海南分离株FCC1/HN有性期特异抗原Pfs48/45基因的克隆与表达

采用基因工程技术,将编码恶性疟原虫有性期特异抗原Ｐｆｓ８／４５的基因克隆到真核表达质粒ｐｃＤ－ＮＡ３,并进行ＤＮＡ序列测定,再通过磷酸钙—ＤＮＡ共沉淀转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｐＦＳ４８／４５导入ＨｅＬａ细胞,建立稳定分泌Ｐｆｓ４８／４５蛋白的阳性克隆株。结果显示,我国海南ＦＣＣ１／ＨＮ株Ｐｆｓ４８／４５抗原基因序列与ＮＦ５４株者高度同源,提示该基因在不同虫株间高度保守,是研制疟疾疫苗的理想靶抗原;在ＨｅＬａ细胞中表达的Ｐｆｓ４８／４５蛋白分子量约为４６／４３．５ｋＤａ双联体蛋白,其表达量占细胞培养上清蛋白总量的１８．２７％。经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析显示,表在蛋白能被配子体免疫鼠血清特异性识别,提示表达的重组蛋白Ｐｆｓ４８／４５具有免疫活性。真核表达系统ｐｃＤＮＡ３／Ｐｆｓ４８／４５／ＨｅＬａ的建立为进一步研究重组Ｐｆｓ４８／４５抗原的免疫原性和保护性奠定基础。     

p53基因诱导G1停滞研究进展

ｐ５３基因可与其专一的ＤＮＡ交感结合部位结合，通过活化含有此反应元件的ＣＤＫ抑制剂ｐ２１＾ｗａｆ－１／ｃｉｐ－１／ｃｄｉ－１及ｇａｄｄ４５基因的转录，使ＤＮＡ受损伤的细胞生长停滞在Ｇ１关卡。ｐ５３基因还可和ＴＡＴＡ结合蛋白结合，抑制细胞增殖的速发早期基因ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、ＰＣＮＡ等的转录，抑制细胞增殖。ｐ５３蛋白还可和复制因子Ａ相互作用，抑制ＤＮＡ复制。Ｇ１停滞在细胞对ＤＮＡ损伤的修复中有重     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶＣ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的核心抗原。结果：用限制性内切酶酶切后，片段大小与计算值相符。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，表达抗原的Ｍｒ约为２２０００。结论：ＨＣＶＣ基因能够插入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，并使其在真核细胞中表达，为进一步ＨＣＶ基因疫苗的研制和探讨抗ＨＣＶ感染打下了基础。     

p53基因诱导G_1停滞研究进展

ｐ５３基因可与其专一的ＤＮＡ交感结合部位结合，通过活化含有此反应元件的ＣＤＫ抑制剂ｐ２１ｗａｆ－１／ｃｉｐ－１／ｃｄｉ－１及ｇａｄｄ４５基因的转录，使ＤＮＡ受损伤的细胞生长停滞在Ｇ１关卡。ｐ５３基因还可和ＴＡＴＡ结合蛋白结合，抑制细胞增殖的速发早期基因ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、ＰＣＮＡ等的转录，抑制细胞增殖。ｐ５３蛋白还可和复制因子Ａ相互作用，抑制ＤＮＡ复制。Ｇ１停滞在细胞对ＤＮＡ损伤的修复中有重要意义。     

人白细胞介素ⅡcDNA表达载体的构建

为开展人白细胞介素Ⅱ（ＩＬ－２）质粒基因肿瘤疫苗的研究,将经改造的人ＩＬ－２ｃＤＮＡ与真核细胞表达ｐｃＤＮＡ３重组保到表达载体ｐｃＤＮＡ３／ＩＬ－２,该质粒转化大肠杆菌后,小量抽提获得的质凿经酶切分析显示长的６８０ｂｐ的目的ＤＮＡ（ＩＬ－２）已插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,说明成功构人白细胞介素ⅡｃＤＮＡ表达载体。     

应用重组PCR技术克建人单链白细胞介素12融合基因

目的 构建人单链白细胞介素１２（ｈｓｃＩＬ－１２）融合基因并在真核细胞中进行表达,为进一步研究ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法 应用重组ＰＣＲ技术将ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位两段编码序列的ｃＤＮＡ通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３碱基序列进行前后拼拼（ＩＬ－１２ｐ４０－多肽接头－ｐ３５）,构建ｈｓｃＩＬ－１２融合基因,并进行核苷酸序列测定,进一步将ｈｓｃＩＬ－１２融合基因插入ｐｃＤＮＡ３．１真核表达载体中,转染ＣＯＳ－７细胞表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白,并行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 该融合基因经ＤＮＡ序列分析表明：ｐ４０、ｐ３５、ｌｉｎｋｅｒ的连接顺序、方向及序列完全正确,融合基因可在ＣＯＳ－７细胞中表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示该融合蛋白分子     

DNA修复蛋白MGMT基因的克隆及转导脐血CD23^＋细胞后耐药特征的研究

目的：增强脐血ＣＤ３４＾＋造血细胞对化疗药物的耐药表型,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率和耐药基因特性,以及在脐血造血干细胞保护性基因治疗中的作用和意义。方法：应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从人肝细胞中获得编码六氧甲基鸟嘌呤－ＤＮＡ－甲基转移酶（Ｏ＾６－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ－ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ,ＭＧＭＴ）ｃＤＮＡ;利用基因重组技术,将其克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ质粒载体并构建了逆转录病毒载体Ｇ１Ｎａ－ＭＧＭＴ;应用脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ基因转移法将后者导入ＧＰ＋Ｅ８６和ＰＡ３１７病毒包装细胞,以卡氮芥１,３－Ｂｉｓ（２－Ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）－１－Ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＢＣＮＵ）加压筛选后的阳性克隆上清经乒乓效应后继而感染脐血ＣＤ３４＾＋细胞。应用ＰＣＲ,Ｓｏｕｔｈ     

人白细胞介素6逆转录病毒表达载体的构建

实验以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌｋｓ质粒为载体，构建了人白细胞介素６次级克隆ｐＢＩＬ－６。用限制性内切ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＩＬ－６，分离并回收了ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段，并在其平未端加入了ＢａｍＨＩ接头。实验将带有ＢａｍＨＩ粘性末端的ＩＬ－６全基因片段插入到了逆转录病毒载体ｐＺＬＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１的ＢａｍＨＩ位点上，构建了重组质粒ｐＺＬＰＩＬ－６。经对重组予ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳、限制住内切酶分析和核酸杂交鉴定，筛选出了含有ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段及插入方向正确的ｐＺＬＰＩＬ－６。