四种多肽负载的自体树突状细胞治疗恶性黑色素瘤近期疗效观察

目的探讨MAGE-3、Tyrosinase、MART-1、Gp-100等4种多肽负载的自体树突状细胞（DCs）治疗恶性黑素素瘤的安全性和近期疗效。方法分离患者外周血单核细胞,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和白细胞介素-4（rhIL-4）体外诱导DCs,MAGE-3、tyrosinase、MART-1、Gp-100等4种多肽负载自体DCs,对10例HLA-A2阳性的恶性黑色素瘤患者进行4次DCs免疫治疗,观察其安全性、免疫功能和临床疗效。结果治疗中未出现明显不良反应,治疗后血清中IL-2、IL-12和IFN-γ水平呈明显上升趋势（P〈0.05）,6例患者的DTH检测阳性;7例有淋巴结转移的患者中,2例淋巴结转移消失,2例淋巴结肿大减小,3例淋巴结肿大稳定。结论多肽负载的自体DCs治疗恶性黑色素瘤可改善患者的免疫功能,激发特异性免疫反应,缓解病情,且不良反应少,为恶性黑色素瘤的免疫治疗提供了一条新途径。     

异种黑色素细胞疫苗诱导小鼠抗恶性黑色素瘤免疫反应的机理研究

目的　研究异种黑色素细胞疫苗诱导小鼠抗恶性黑色素瘤免疫反应的机理。方法　制备异种黑色素细胞疫苗 ,免疫小鼠。采用间接 EL ISA法检测小鼠抗肿瘤抗体滴度及抗体亚型 ,纯化免疫球蛋白及进行体外抗肿瘤增殖 ,采用 Western blot法分析交叉抗原蛋白质。接种恶性黑色素瘤 ,观察肿瘤生长 ,采用免疫细胞去除法分析NK细胞及 T细胞亚群对疫苗抑瘤效应的影响。结果　异种疫苗免疫后 2周小鼠体内出现抗自身肿瘤抗体 ,产生的抗体以 Ig G为主 ,抗体认别的猪眼黑色素细胞及恶性黑色素瘤细胞交叉抗原为相对分子质量达 180× 10 3的蛋白质 ,纯化的免疫球蛋白在体外能抑制恶性黑色素瘤细胞增殖。异种疫苗诱导特异性保护性免疫反应使 90 %小鼠恶性黑色素瘤生长受到抑制 ,去除 NK细胞不影响疫苗抑瘤效应 ,去除 CD4 + T细胞使疫苗抑瘤效应消失 ,去除CD8+ T细胞 70 %小鼠恶性黑色素瘤生长仍受到抑制。结论　异种黑色素细胞疫苗诱导特异性体液免疫及细胞免疫反应 ,抑制恶性黑色素瘤的生长 ,CD4 + T细胞在这一过程中发挥了关键性作用。     

乳腺癌干细胞样细胞mRNA致敏的树突状细胞疫苗免疫治疗研究

目的观察乳腺癌干细胞样细胞核酸抗原致敏的树突状细胞疫苗体外诱导免疫反应作用。方法利用含有生长因子的无血清培养基悬浮培养法富集MCF-7乳腺癌干细胞样细胞,经单克隆形成、表面标记检测、NOD-SCID小鼠成瘤等实验鉴定后,采用T7mMessage mMACHINE试剂盒进行mRNA体外扩增并转染人外周血树突状细胞,MTT法体外检测转染后的树突状细胞诱导的细胞毒活性。结果无血清培养的方法能够富集乳腺癌干细胞样细胞,含CD44+/CD24-型的乳腺癌干细胞样细胞高达(90.17%);经鉴定在NOD/SCID小鼠体内具有强致瘤性;负载后DCs高表达树突状细胞特异性标志CD80/CD83/CD86及HLA-DR;与已分化贴壁乳腺癌细胞相比,悬浮培养的未分化状态的乳腺癌干细胞样细胞mRNA转染的树突状细胞靶向杀伤肿瘤干细胞样细胞的能力更强(P0.01)。结论乳腺癌干细胞样细胞mRNA致敏的树突状细胞疫苗在体外可诱导强的杀伤乳腺癌干细胞样细胞的CTL细胞能力,为乳腺癌临床免疫治疗提供了新的靶点。     

体外树突状细胞疫苗策略抗肿瘤免疫治疗研究进展

树突状细胞(DCs)在激活天然的免疫反应和获得性免疫反应中具有独一无二的作用,应用DCs为基础的肿瘤免疫治疗已成为肿瘤治疗的研究焦点.改善DCs疫苗的效能的方法有体外DCs策略和体内DCs策略.本文就体外DCs疫苗策略在肿瘤免疫治疗中的研究进展做一综述.     

肿瘤抗原脉冲致敏的树突状细胞疫苗抗肿瘤作用的实验研究

目的：进一步研究体外肿瘤抗原脉冲致敏的骨髓树突状细胞瘤苗主动免疫诱导小鼠体内抗肿瘤免疫应答,并观察其抵抗野生性肿瘤攻击的免疫保护作用及对荷瘤小鼠模型的免疫应答。方法：采用本室建立的骨髓树突状细胞分离与细胞因子体外扩增培养方法,并在体外经灭活ＮＳ１骨髓瘤细胞及其裂解产物脉冲刺激后直接作为疫苗,然后进行免疫预防与治疗的在体动物实验。结果：可从１只小鼠股骨中获得（３～５）×１０５个树突状细胞（ＤＣ）,其纯度为９５％以上,对混合Ｔ淋巴细胞具有强刺激活性。主动免疫同系健康ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠的试验显示,ＤＣ疫苗能诱导抗原特异的细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）活性,免疫１次的动物首次受到肿瘤攻击后诱发肿瘤形成率为０％,再次攻击的肿瘤形成率为２０％;而免疫３次的动物两次攻击的肿瘤形成率皆为０％。主动免疫治疗同种荷瘤动物的试验表明,ＤＣ疫苗也能抑制肿瘤生长,荷瘤动物存活率提高及生存期明显延长。结论：肿瘤抗原体外致敏的树突状细胞能诱导宿主体内的抗肿瘤免疫保护性反应,且对荷瘤模型动物具有明显的免疫治疗作用。     

HPV16 E7多肽冲击的树突状细胞治疗尖锐湿疣的临床初步观察

目的观察人乳头瘤病毒16型(HPV16)E749-57多肽冲击的树突状细胞(DCs)治疗复发性尖锐湿疣的疗效.方法 32例复发3次以上的尖锐湿疣患者,治疗组11例(HPV16 、HLA-A2 )给予HPV16E7多肽冲击的树突状细胞免疫治疗,对照组21例给予干扰素治疗.所有患者随访6个月,观察治疗前后皮损的病理变化、外周血T淋巴细胞亚群的变化及治疗效果.结果抗原肽冲击的树突状细胞治疗后,部分尖锐湿疣皮损变小或消退,局部空泡细胞减少,真皮内有中等密度淋巴细胞浸润.治疗前后外周血T淋巴细胞亚群未见明显变化.复发率由常规治疗的61.9%降至18.2%.结论 运用抗原肽冲击的树突状细胞对复发性尖锐湿疣进行治疗,可以改善病变局部的免疫状态,并能够显著降低复发率.     

人乳头状瘤病毒16型E6基因转染人外周血树突状细胞的体内抗宫颈癌研究

目的：观察人乳头状瘤病毒（HPV）16型E6基因转染人外周血来源的树突状细胞（DC）制备的疫苗，在严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠体内对人宫颈癌（CaSki）细胞的免疫治疗和免疫保护作用。方法：细胞因子扩增人外周血DC，脂质体（Lipofeetamine）转染HPV16E6制备HPV16E6-DC疫苗。进行致瘤性检测，并观察在SCID小鼠体内疫苗抗人CaSki细胞的免疫保护及对荷瘤小鼠的免疫治疗作用。结果：①ttPV16E6-DC疫苗接种于小鼠体内未见肿瘤形成，脾、肺、肝和肾等器官未出现肿瘤病变。②在免疫治疗组，用HPV16E6．DC疫苗治疗的荷瘤小鼠，肿瘤生长速度较对照组慢，瘤体积小于对照组，瘤重量较对照组明显减轻（P〈0．01）。③在免疫保护组，经HPV16E6-DC疫苗免疫的小鼠，CaSki细胞攻击后，肿瘤潜伏期较对照组明显延长（P〈0．01），瘤体积明显小于对照组，瘤重量也轻于对照组（P〈0．01）。结论：人外周血来源的HPV16E6．I）12疫苗无体内致瘤性。且能在一定程度上抑制人CaSki细胞在SCID小鼠体内的生长，抵抗肿瘤细胞的攻击，对机体具有相应的抗肿瘤免疫治疗及保护作用。     

人乳头瘤病毒16 E6转染冻融人外周血树突状细胞疫苗体外抗宫颈癌作用

目的：制备来源于人外周血并转染人乳头瘤病毒（HPV）16 E6基因的冻融树突状细胞（DC）疫苗，检测其细胞形态。转染情况及体外诱导的免疫效应。方法：细胞因子扩增人外周血DC，低温-70℃冻存；Lipofectamine转染HPV16 E6制备DC疫苗。动态形态学观察，免疫细胞化学检测E6分子表达，体外诱导并测定细胞毒性T淋巴细胞活性。结果：转染E6基因的人外周血冻融DC呈形态迥异的多突起状，免疫细胞化学染色显示E6蛋白表达阳性；MTT法检测人宫颈癌细胞株（CaSKIi细胞）的杀伤活性明显高于对照组（P〈0．01），与新鲜DC疫苗比无统计学意义（P〉0．05）。结论：转染历基因的人外周血冻融DC疫苗保持了功能成熟DC的形态特征，且内源性表达E6蛋白，并在体外诱导出高效特异性的抗宫颈癌免疫反应，为宫颈癌的主动特异性免疫治疗提供了理想的疫苗和实验依据。     

转FL基因树突状细胞疫苗治疗小鼠Lewis肺癌的研究

目的 探讨转FL基因树突状细胞疫苗在小鼠体内抗肿瘤的作用.方法 应用腺病毒为载体,将表达FL可溶性蛋白的基因片段转入小鼠外周血来源的DCs.将疫苗经腹腔注射,观察抑瘤率及生存时间.结果 转FL基因的DCs上清液IFN-γ表达量高于空载体组,激发T细胞能力也高于对照组;对小鼠Lewis肺癌移植瘤进行免疫治疗后,该组的抑瘤率、生存时间及一般状况明显高于对照组.结论 通过FL基因转染的DCs可以进一步增加抗肿瘤的能力.     

树突状细胞诱导肺癌特异性免疫应答治疗裸鼠移植瘤的实验研究

目的 利用树突状细胞递呈肿瘤抗原的能力诱导出肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL),用其治疗人肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤.方法 外周血单个核细胞体外经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4诱导产生树突状细胞,负载A549肺癌细胞裂解物诱导自体CTL,经细胞毒试验和EUSA测定CTL杀伤活性和细胞因子的分泌.同时制备荷瘤裸鼠模型,不同分组裸鼠一次或多次皮下注射CTL.结果 A549冻融抗原能促进CTL增殖,可诱导产生CTL对A549细胞的特异杀伤,在效靶比为40∶1时杀伤率可达79.6%;一次接种后荷瘤裸鼠肿瘤生长减缓,多次接种肿瘤明显缩小且生存时间较对照组显著延长,具有明显的保护作用.结论 树突状细胞能有效递呈肺癌冻融抗原,诱导产生具有一定治疗功效的抗肿瘤特异性CTL,提示临床应用以树突状细胞为基础的肺癌疫苗免疫治疗具有广阔前景.     

IL-12 基因修饰树突状细胞诱导的抗胃癌效应研究

目的研究rhscIL-12基因修饰的树突状细胞疫苗特异性抗胃癌免疫反应。方法构建rhscIL-12和逆转录病毒载体的重组体,脂质体介导转染人外周血来源DCs,制备负载MNK45胃癌抗原的rhscIL-12基因修饰的DCs疫苗,以流式细胞仪分析细胞表型改变,ELISA检测IL-12和IFN-γ的水平,用Cyto Tox 96检测其对MNK45细胞体外杀伤效应。结果rhscIL-12转染DCs后可进一步上调DCs表面分子的表达,IL-12的分泌量明显提高,效应细胞IFN-γ的分泌量明显上升,对MN K45细胞具有强烈的杀伤作用,杀伤活性显著高于未转染DCs组（P〈0.05）。结论rhscIL-12基因修饰的树突状细胞可诱导产生高效和特异的抗胃癌效应,可作为胃癌免疫治疗的一种有效方法。     

Monocyte-derived dendritic cells from primary Sj(o)gren′s syndrome patients were hypersensitive to polyinosinic polycytidylic acid stimulation

目的 观察原发性干燥综合征(pSS)患者外周血单核源性树突状细胞在聚肌苷酸胞苷酸(polyI:C)刺激下释放干扰素等炎性因子的能力.方法 用白细胞介素(IL)-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子从pSS患者外周血单核细胞中诱导出树突状细胞,并用50 μg/mL polyI:C进行刺激,在刺激后第6、12、24小时以ELISA法检测细胞培养基上清液中干扰素(IFN)-α、IFN-β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和IL-23的浓度,以RT-PCR检测树突状细胞内Toll样受体3(TLR3)分子的表达.结果 在polyI:C作用下,pSS患者单核源性树突状细胞释放IFN-α、IFN-β及TNF-α等因子的能力显著强于来自健康个体的单核源性树突状细胞.虽然pSS患者及健康个体单核源性树突状细胞内TLR3的表达在polyI:C刺激作用下均随时间逐渐降低,但pSS患者TLR3的降低相对缓慢.结论 pSS患者单核源性树突状细胞对polyI:C刺激呈现高反应性,且这种高反应性可能与TLR3信号作用异常有关.单核源性树突状细胞的这种特征可能与pSS的发病机制有关.     

脐带源间充质干细胞可增强自然杀伤细胞对树突状细胞的杀伤活性

目的观察脐带源间充质干细胞对自然杀伤细胞杀伤树突状细胞的影响,初步探讨其作用机制。方法胶原酶消化整个
脐带组织,体外培养间充质干细胞;分离健康人外周血单个核细胞,磁珠分选树突状细胞。在白介素-4和粒单-集落刺激因子共
同作用下获得大量未成熟树突状细胞,将脐带源间充质干细胞与未成熟树突状细胞共培养2 d,同时加入肿瘤坏死因子α,诱导
树突状细胞成熟。流式细胞术检测诱导后树突状细胞CD11c和CD86的表达,ELISA法检测培养液中白介素-12的含量,乳酸
脱氢酶释放法检测自然杀伤细胞对树突状细胞的杀伤活性,流式细胞术检测树突状细胞表面自然杀伤细胞活化性受体的配体
（MICA/B和ULBP1-3）的表达。结果与单纯细胞因子诱导比较,脐带源间充质干细胞诱导后树突状细胞CD11c的表达无明显
差异,但CD86的表达降低,IL-12的分泌量降低。自然杀伤细胞对脐带源间充质干细胞诱导后的树突状细胞的杀伤效率明显高
于单纯细胞因子诱导后的树突状细胞。与单纯细胞因子诱导比较,脐带源间充质干细胞诱导后的树突状细胞活化性受体的配
体（MICA和MICB）的表达增高。结论脐带源间充质干细胞能增强自然杀伤细胞对树突状细胞的杀伤活性,这可能与脐带源
间充质干细胞抑制树突状细胞成熟,上调树突状细胞表面自然杀伤细胞活化性受体的配体有关。
     

负载肿瘤抗原的树突状细胞疫苗诱导CTL的抗肿瘤效应

目的:探讨负载肿瘤抗原的树突状细胞(DC)疫苗诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的体外杀瘤作用及对荷瘤小鼠的治疗作用.方法:体外培养的小鼠骨髓树突状细胞用小鼠结肠腺癌细胞株CT26细胞抗原冲击致敏制备负载肿瘤抗原的DC疫苗;负载肿瘤抗原的DC疫苗激活同源T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL),采用乳酸脱氢酶(LDH) 4 h释放法检测CTL在体外对CT26细胞的杀伤活性;建立CT26荷瘤小鼠模型,应用CTL治疗荷瘤小鼠,观察肿瘤大小和小鼠存活期.结果:负载CT26肿瘤抗原的DC疫苗能够诱导T细胞增殖分化为肿瘤特异CTL,该CTL对CT26细胞有高效而强烈的杀伤作用,杀伤率为(83.95±11.25)%,而对B16细胞、3LL Lewis 细胞无明显杀伤作用,杀伤率分别为(12.75±5.36)%和(11.38±4.57)%.应用CTL治疗荷瘤小鼠能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠存活期.结论:负载肿瘤抗原的DC疫苗能够诱导高效而特异的CTL杀瘤活性并能治疗荷瘤小鼠.提示负载肿瘤抗原的DC疫苗诱导的CTL可能在肿瘤的免疫治疗中发挥重要作用.     

原发性宫颈恶性黑色素瘤11例临床病理分析

目的 探讨原发性宫颈恶性黑色素瘤的临床病理特点.侧重于诊断和鉴别诊断.方法 收集11例官颈原发性恶性黑色素瘤.对其临床资料、组织学形态及随访结果进行分析.结果 11例患者.平均年龄46.9岁,临床表现为不规则流血或排液,妇检示宫颈菜花状或黑色结节状,组织学形态:肿瘤细胞异型性大.细胞形态多样而结构复杂,表现为痣样细胞、上皮样细胞、梭形细胞或混合细胞.免疫组织化学S-100、HMB45、Vimentin均呈阳性表达.结论 原发性宫颈恶性黑色素瘤恶性程度高,预后差.s-100、HMB45检测对于确诊恶性黑色索瘤具有重要意义.对于早期患者,手术应作为首选治疗手段,而辅助性化疗及免疫治疗有可能改善其预后.     

妇科肿瘤疫苗的研究进展

肿瘤疫苗是妇科恶性肿瘤免疫治疗研究的热点之一。卵巢癌疫苗均为治疗性疫苗,主要包括克隆抗原疫苗、肿瘤细胞疫苗、基因工程肿瘤细胞疫苗、树突状细胞疫苗、抗独特型疫苗。子宫颈癌疫苗包括以人乳头瘤病毒为基础的多肽疫苗、载体疫苗、融合蛋白疫苗和嵌合疫苗及树突状细胞疫苗等治疗性疫苗和人乳头瘤病毒预防性疫苗。而子宫内膜癌疫苗报道很少。     

树突细胞疫苗与恶性黑色素瘤免疫治疗研究进展

以免疫治疗为代表的生物治疗日益受到重视。树突细胞（DC）是体内抗原提呈功能最强的细胞,在肿瘤免疫治疗中占重要地位。DC具有加工、提呈抗原的功能,同时DC在启动特异性抗肿瘤免疫反应中发挥着关键性作用。通过不同形式的抗原修饰的DC可增强其抗肿瘤的免疫原性。就DC疫苗与恶性黑色素瘤的免疫治疗研究进展做一综述。     

CIK与DC细胞联合治疗145例晚期恶性实体瘤

目的 研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)和树突状细胞(DC)联合治疗晚期肿瘤. 方法 从外周血分离单个核细胞,体外经GM-CSF和白细胞介素4(IL-4)诱导产生DC细胞,淋巴细胞经干扰素γ(IFN-γ)、IL-2、CD3单抗和IL-1α体外诱导产生CIK细胞,采用流式细胞术检测CIK的表型,并回输患者进行治疗,至少接受3次治疗. 结果 82例可评价病灶的患者中,3例完全缓解(CR),7例部分缓解(PR);31例不可评价病灶的患者中,7例患者胸腹水消失,与治疗前相比,治疗后患者CD3 和 CD8 明显升高(P＜0.05). 结论 CIK细胞治疗晚期恶性实体瘤有一定的临床疗效,为该类患者的治疗提供一种有效的免疫治疗手段.     

黑色素瘤抗原-A3致敏的树突状细胞对人肝癌细胞的体外杀伤作用

【目的】观察经黑色素瘤抗原-A3(melanoma antigen gene,MAGE-A3)致敏树突状细胞(dendritic cells,DCs)活化的淋巴细胞对人肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞的体外杀伤作用。【方法】采用粒—巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和白介素-4(interleukin-4,IL-4)从人外周血中诱导树突状细胞,经MAGE-A3抗原致敏后与T淋巴细胞共培养,以淋巴细胞为效应细胞,分别以表达MAGE-A3抗原的肝癌细胞株H4M、不表达MAGE-A3抗原的正常肝细胞为靶细胞,收集T淋巴细胞进行肿瘤细胞杀伤试验。【结果】负载MAGE-A3抗原的DCs激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肝癌细胞有明显的杀伤作用,其对肝癌细胞的杀伤率显著性高于正常肝细胞对照组(P<0.05)。【结论】MAGE-A3蛋白抗原致敏的树突状细胞疫苗可激活特异性的CTL,在体外诱导出较强的对人肝癌细胞株的细胞毒作用。     

肺癌细胞裂解物刺激树突状细胞诱导产生免疫应答的实验研究

目的采用肺癌细胞裂解物致敏树突状细胞（DCs）的方法制备肺癌疫苗并进一步通过实验验证其疗效。方法利用外周血的单个核细胞经粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子（GM-CSF）和人白细胞介素4（IL-4）体外诱导产生树突状细胞,用A549（人肺腺癌细胞系）细胞冻融抗原对其进行冲击诱导自体细胞毒T淋巴细胞（CTLs）产生。通过细胞毒试验及ELISA测定细胞因子的分泌和CTLs杀伤活性。制备荷瘤裸鼠模型,不同分组裸鼠经过一次或多次皮下注射CTLs。结果 A549冻融抗原致敏的DCs增加CTLs增殖,诱导的CTLs对A549细胞产生特异性杀伤,经过一次及多次接种后荷瘤裸鼠肿瘤生长减缓,并且肿瘤变小及生存时间较对照组明显延长,起到抑制肿瘤生长和延长生存时间的作用。结论通过实验证实了肺癌细胞裂解物抗原来刺激树突状细胞治疗肺癌A549荷瘤裸鼠模型是安全有效、可行的。为临床应用以树突状细胞为基础的肺癌疫苗免疫治疗提供了实验依据。