组织工程膀胱细胞外基质生物相容性的实验研究

目的 制备兔膀胱细胞外基质材料,检测其生物相容性,探讨其作为组织工程泌尿道修复重建支架材料的可行性.方法 联合应用渗透溶液法-酶消化法-去垢剂洗涤法制备兔膀胱细胞外基质,将体外培养的兔膀胱移行上皮细胞与其复合培养,观察细胞在材料表面的黏附、生长、增殖情况;MTT法检测材料浸提液对膀胱移行上皮细胞的细胞毒性;将材料植入兔背部皮下检测其组织相容性.结果 兔膀胱细胞外基质冻干后呈白色半透明薄膜状,扫描电镜观察材料一面呈纤维网状结构,另一面呈平坦致密结构,两面均无细胞残留.膀胱移行上皮细胞能够在材料表面正常黏附、生长、增殖,细胞形态良好.MTT法检测材料细胞毒性分级为0级或1级.皮下植入实验中动物无异常反应,材料能在体内逐渐降解并引导新生组织长入.结论 本研究制备的兔膀胱细胞外基质已完全除去组织中的细胞成份,同时保留了细胞外基质的纤维网状结构,具有良好的细胞相容性和组织相容性,可以作为组织工程泌尿道修复重建的支架材料.     

尿道脱细胞基质修复兔尿道缺损的实验研究

目的 制备兔尿道脱细胞基质(UAMG),检测其生物相容性,并探讨其修复兔尿道缺损的效果.方法 制备兔UAMG,光镜和扫描电镜下观察其结构特点.将体外培养的兔膀胱平滑肌细胞与UAMG体外复合培养,观察细胞在材料表面的生长增殖情况.MTT法检测UAMG材料浸提液对膀胱平滑肌细胞的细胞毒性.将UAMG植入兔背部皮下检测其生物相容性.取24只雄兔,随机分为实验组(n=12)和对照组(n=12).实验组手术切除2 cm尿道缺损,应用UAMG修复;对照组切除2 cm尿道缺损后即关闭切口依靠尿道自体组织再生修复缺损.实验兔分别在术后2、4、8、12周取材.进行组织学和免疫组织化学检测.结果 兔UAMG为胶原纤维网状结构,无细胞残留.兔膀胱平滑肌细胞能够在UAMG表面正常生长,细胞形态良好.UAMG材料细胞毒性分级为0级或1级,皮下植入实验中动物无异常反应,材料能在体内逐渐降解,生物相容性好.UAMG修复兔尿道缺损后12周,修复区再生出结构完整的新尿道组织,与正常兔尿道组织近似.结论 UAMG具有良好的生物相容性,能够诱导尿道上皮细胞和平滑肌细胞再生,可以作为尿道修复重建的替代材料.     

组织工程猪膀胱无细胞基质的制备

目的探讨猪膀胱无细胞基质制备的方法及其作为生物支架材料应用于组织工程膀胱构建的可行性。方法分别采用酶消化法和去污剂洗涤法对新鲜猪膀胱进行脱细胞处理并进行HE染色及电镜检查。应用MTT法进行细胞毒性测定。对5只新西兰兔行大部分膀胱切除术后,采用异种膀胱无细胞基质修补,6周后取材观察修复组织再生情况。结果两种方法均能去除膀胱中细胞成分,光镜及电镜观察无细胞成分残留,细胞毒性测定为1级,细胞相容性好。兔膀胱修补后6周支架材料上有移行上皮及肌肉组织生长。结论经脱细胞处理的猪膀胱无细胞基质具有良好的组织相容性,有作为组织工程膀胱支架材料的应用前景。     

兔髁突细胞与可吸收明胶海绵复合培养的研究

目的: 研究明胶海绵作为颞下颌关节组织工程支架材料应用的可行性.方法: 采用胶原酶阶段消化法获取兔髁突软骨中的纤维软骨细胞,取经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)扩增的第3代细胞与已用多聚赖氨酸修饰的明胶海绵复合培养,进行噻唑蓝(MTT)比色及光镜、扫描电镜观察.结果: 纤维软骨细胞于明胶海绵孔壁内牢固粘附,5 d开始增殖,4 W时有大量细胞生长于明胶海绵上.结论: 明胶海绵表现出良好的亲水性、细胞吸附性和体外生物相容性,可作为组织工程细胞培养支架材料用.     

兔髁突软骨细胞与羊膜间生物相容性研究

目的: 研究羊膜作为颞下颌关节组织工程支架材料应用的的可行性.方法:采用Ⅱ型胶原酶消化解离兔髁突软骨中的纤维软骨细胞,取经TGF-β1扩增的第二代细胞与羊膜复合培养,进行MTT、光镜、扫描电镜观察.结果:髁突细胞于羊膜上牢固黏附,第3天开始增殖,3周时已有大量细胞生长于羊膜上.结论:羊膜表现出良好的吸水性、细胞吸附性和体外生物相容性,髁突细胞可在其上黏附、增殖,羊膜适于作为髁突组织工程支架材料.     

PEGPU3-D多孔支架在膀胱组织工程中的初步应用评价

目的 探讨膀胱上皮细胞、平滑肌细胞在聚乙二醇聚氨酯(PEGPU)3 D多孔支架的生长增殖能力,对PEGPU 3-D支架在膀胱组织工程中的潜在应用进行评价.方法 鼠成纤维细胞接种于乳液同含量(m/m)为8％、12％、16％、20％(即孔径为90.8、76.7、40.9和39.6 μm)的PEGPU 3-D聚氨酯多孔支架后,采用异硫氰酸荧光素(FITC)与4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)免疫荧光共染观察支架表面与支架内部细胞生长情况.采用免疫组织化学染色(检测α-actin与f-actin的表达)鉴定原代培养人膀胱平滑肌细胞.将人膀胱平滑肌细胞、上皮细胞和鼠成纤维细胞接种于PEGPU 3-D聚氨酯多孔支架后,采用胆囊收缩素八肽(CCK-8)检测法绘制细胞生长曲线.结果 鼠成纤维细胞可在PEGPU 3-D多孔支架粘附、增殖,在平均孔径为40.9 μm的3-D多孔支架上鼠成纤维细胞可获得最佳的生长、增殖状态.膀胱平滑肌细胞在平均孔径为90.8 μm的3-D支架生长状态最佳,膀胱上皮细胞在平均孔径为39.6 μm的3D支架生长状态最佳.结论 3-D多孔PEGPU支架可支持膀胱上皮细胞与平滑肌细胞生长、增殖,具有膀胱组织工程应用的潜力.     

诱导向尿路上皮分化的脂肪干细胞与膀胱脱细胞基质支架的生物相容性研究

目的 探讨脂肪干细胞向尿路上皮细胞分化的可行性,并将诱导后细胞与膀胱脱细胞基质复合培养,评价细胞与支架材料的生物相容性,为进一步构建组织工程化组织提供实验基础。 方法 取6只8周龄雄性新西兰大白兔的腹股沟脂肪组织和膀胱组织,通过胶原酶消化法分离脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),同时通过胰蛋白酶消化的方法获取尿路上皮细胞,流式细胞鉴定后将第3代脂肪干细胞与尿路上皮细胞间接共培养2周,并对分化后细胞进行表型鉴定。随后将分化后细胞种植在膀胱脱细胞基质上,通过扫描电镜、组织学切片观察诱导后细胞在膀胱脱细胞基质上的生长情况。 结果 脂肪干细胞培养成功并在体外扩增,流式术检测表面抗原CD分子,细胞高表达CD29(99.6%)、CD44(98.2%);低表达CD31(1.9%)及CD45(1.6%)。通过间接共培养诱导分化后,细胞免疫荧光、Western blotting检测到尿路上皮标志物UPIa的表达,而未诱导的脂肪干细胞无表达。扫描电镜提示诱导后细胞在膀胱脱细胞基质上生长,黏附较好。组织学检查可见膀胱脱细胞基质表面细胞平铺生长。 结论 脂肪干细胞向尿路上皮诱导分化后可作为泌尿系组织工程的种子细胞,可能是尿路上皮细胞之外的又一新选择。膀胱脱细胞基质能支持诱导后的脂肪干细胞良好的生长,该支架可作为载体材料用于泌尿系组织工程的修复与重建。      

兔脂肪干细胞(ADSCs)与聚羟基乙酸/壳聚糖(PLGA/CS)支架材料生物相容性研究

 目的  探讨兔脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)作为种子细胞复合新型聚羟基乙酸(polylactic-co-glycolic acid,PLGA)/壳聚糖(chitosan,CS)支架材料的生物相容性,为进一步构建组织工程化脂肪组织提供实验依据。方法  取雄性新西兰大白兔腹股沟脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化分离出ADSCs进行培养,贴壁细胞至3~5代,评价其多向分化能力。将干细胞收集重悬后,以l×107/mL的密度接种于多孔PLGA/CS支架,形成细胞 支架材料复合物。培养7天后,扫描电子显微镜观察细胞在支架材料上的黏附生长和基质分泌情况,评价细胞与支架材料的生物相容性;Dil荧光标记检测细胞在支架材料上的分布;Hochest 33258检测细胞在支架上的生长情况。接种1和7天后,分别对细胞 材料复合物行Annexin V/PI双染色法检测材料对细胞的毒性作用。用成脂诱导条件培养基诱导分化ADSCs及ADSCs支架材料复合物,7天后,尼罗红荧光染色液检测ADSCs在不同环境下的成脂分化能力。结果  原代培养的ADSCs呈成纤维细胞样外观,在相应诱导条件下能够分化为脂肪细胞和骨细胞。细胞接种于PLGA/CS支架材料上第8天分裂增殖达到高峰,扫描电子显微镜下提示ADSCs在支架表面贴附生长良好,并向孔隙内壁充分延伸,细胞周围形成丰富的基质成分。活死双染结合共聚焦显微镜显示材料对细胞活性无影响,尼罗红染色可见成脂诱导后的ADSCs细胞质内有红色脂滴颗粒形成。结论  多孔PLGA/CS支架与兔ADSCs具有良好的生物相容性,可作为构建组织工程脂肪组织的支架材料。     

牙周膜成纤维细胞与静电纺丝纳米纤维的生物相容性研究

目的 研究不同比例的静电纺丝聚乳酸/聚己内酯(PLA/PCL)纳米纤维与牙周膜成纤维细胞(PDLF)的生物相容性,探索其作为牙周膜组织工程支架的可行性.方法 聚乳酸(PLA)和聚己内酯(PCL)分别按重量比75:25、50:50和25:75制成混合溶液,应用静电纺丝技术制成3种比例的纳米纤维支架.将PDLF接种于3种比例的支架上,经细胞培养,通过光学显微镜观察PDLF在3种支架上的形态;MTT法检测PDLF在支架上的增殖,荧光显微镜下计数细胞,检测粘附能力;活死细胞染色法比较PDLF在3种比例支架上的活力.结果 在体外培养条件下,PDLF在3种比例支架上均能生长,其中50:50支架上的PDLF增殖曲线最接近常规培养细胞的曲线,明显较其他2种支架上PDLF数量多;50:50支架对PDLF的粘附作用明显强于另外2种;50:50支架对PDLF活性的影响最小,优于其他比例的支架.结论 PDLF能在不同比例的PLA/PCL纳米纤维上生长,其中,按重量比为50:50合成的支架在与牙周膜成纤维细胞共培养时体现出较好的生物相容性,可作为牙周膜组织工程候选支架材料.     

一种新型肝组织工程支架的制备及生物相容性评价

目的:构建一种新型肝组织工程支架,并对其生物相容性进行评价,探讨其作为肝组织工程支架的可行性.方法:选用壳聚糖及明胶材料,通过微制造技术制备一种新型壳聚糖/明胶肝组织工程支架,并与大鼠原代肝细胞共培养,采用HE染色、扫描电镜、MTT法及肝细胞功能学指标等多种检测方法,对支架的细胞毒性及生物相容性进行评价.结果:成功制备了一种新型壳聚糖/明胶复合肝组织工程支架,其孔隙率高、表面积大,有利于肝细胞的黏附与生长,种植在新型壳聚糖/明胶肝组织工程支架上的肝细胞呈现良好的生长增殖趋势,保持良好的生理功能,新制备的支架呈缓慢匀速降解,保持良好的空间结构.结论:制备的壳聚糖/明胶肝组织工程支架具有良好的生物相容性及低细胞毒性,满足肝组织工程的要求.     

Differences in the primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta

Objective: To investigate the differences of primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta. Methods: Endothelial cells were obtained using the vascular ring adherence, collagenase digestion method and an improved vascular ring adherence method, while smooth muscle cells were separated from tissue sections of rat aorta. Clones of endothelial cells were selected by limiting dilution assay. Both cell types were identified using specific cell immunofluorescent markers,and phase contrast microscopy was used to observe the morphological disparity between endothelial cells and smooth muscle cells at the single cell and colony level. Cell proliferation was determined by the cell counting kit-8. Differences between endothelial cells and smooth muscle cells were evaluated in trypsin digestion 6me, attachment time and recovery after cryopreservation. Results: Endothelial cells were obtained by all three methods. The improved vascular ring method provided the most reproducible results. Cells were in good condition, and of high purity. Smooth muscle cells were cultured successfully by the tissue fragment culture method. Clonal expansion of singleendothelial cells was attained. The two cell types expressed their respective specific markers, and the rate of proliferation of smooth muscle cells exceeded that of endothelial cells. Endothelial cells were more sensitive to trypsin digestion than smooth muscle cells. In addition, they had a shorter adherence time and better recovery following cryopreservation than smooth muscle cells. Conclusion: The improved vascular ring method was optimal for yielding endothelial cells. Limiting dilution is a novel and valid method for purifying primary endothelial cells from rat aorta. Primary rat endothelial cell and vascular smooth muscle cell cultures exhibited different morphological characteristics, proliferation rate, adherence time, susceptibility to trypsin digestion and recovery after cryopreservation. Our research can be a good foundation for further application in the regeneration of blood vessel.     

一氧化氮对血管平滑肌细胞增殖的影响及与细胞周期调节的关系

目的 :评价NO供体 (DETANO)抑制血管平滑肌细胞增殖的效应及其抗增殖效应与细胞周期抑制蛋白P2 7kip1的关系。方法 :将DETANO(10 -5～ 10 -3 mol·L-1)、DETA(10 -3 mol·L-1)及阴性对照 (DMSO)作用于体外培养的血管平滑肌细胞 ,观察不同处理因素的抗增殖效应。应用蛋白杂交方法分析G0 期、增殖期和DETANO作用的平滑肌细胞中P2 7的表达水平。结果 :DETANO能抑制血管平滑肌细胞的增殖 ,以 10 -3 mol·L-1浓度的DETANO效果最显著 ,而单纯DETA对细胞增殖无抑制效应。而且DETANO和DETA无细胞毒性效应。蛋白印迹分析表明处于G0期的细胞P2 7高水平表达 ,给予 10 %胎牛血清刺激 2 4h后 ,P2 7水平迅速下降。若预先给予DETANO(10 -3 mol·L-1)干预 ,则P2 7蛋白水平下调的效应减弱。结论 :DETANO能抑制血管平滑肌细胞增殖 ,其抗增殖机制与细胞周期调控和上调P2 7kip1相关。     

不同浓度雌激素对大鼠膀胱颈平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨不同浓度17β-雌二醇(E2)对大鼠膀胱颈平滑肌细胞(BSMC)增殖与凋亡的影响。方法:无菌切取大鼠膀胱颈,应用酶消化法行原代细胞培养。取3-4代传代细胞,用α-平滑肌肌动蛋白抗体免疫组织化学法鉴定细胞成分,选取平滑肌成分大于85%者,分别加入不同浓度E2(0.1-100 nmol/L)。于处理72 h后收获细胞,应用流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡及其相关蛋白CyclinD1,应用Western blotting法检测Bcl-2和Bax表达。结果:E2(0.1-10 nmol/L)促进BSMC从G1期向S过渡(G0/G1期比率显著低于对照组细胞,而S期和G2/M期比率显著高于对照组细胞,P<0.05),并伴随Cyclin D1蛋白表达显著增高。而大剂量E2(100 nmol/L)则使细胞凋亡率显著升高,并伴随Bax表达显著增加。结论:小剂量E2能够促进合成型BSMC增殖,其机制是影响Cyclin D1表达,加速G1期向S过渡;大剂量E2则通过增加Bax促进细胞凋亡。     

A study of endothelium-dependent proliferation of pulmonary smooth muscle cells in vitro

Summary The direct effect of hypoxia and the effect of hypoxic endothelial cells conditioned medium on cultured pulmonary arterial smooth muscle cells in vitro were studied with phase contrast microscopy,³H-thymidine labelled technique and flow cytometric measurements. The results showed that direct hypoxia inhibited proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells, retained pulmonary arterial smooth muscle cells in the Go/G₁ phase and decreased³H-thymidine incorporation into pulmonary arterial smooth muscle cells and that hypoxic endothelial cells conditioned medium stimulated proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells, promoted pulmonary arterial smooth muscle cells from G₀/G₁ phase to S phase and increased³H-thymidine incorporation into pulmonary arterial smooth muscle cells. It was reasonable to believe that hypoxia might enable pulmonary arterial endothelial cells to secrete some growth factors which could stimulate proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells, thereby playing an important role in structural remodeling of the pulmonary arteries and in the development of hypoxic pulmonary hypertension.     

抗增殖蛋白抑制转化生长因子-β1诱导的肾脏成纤维细胞增殖和表型改变

目的 研究抗增殖蛋白（prohibitin,PHB）在肾间质纤维化发生中的作用。方法（1）检测48例原发性肾小球肾炎患儿肾组织中PHB蛋白表达,并比较其与肾小管间质损伤程度的相关性。（2）观察PHB在大鼠肾脏成纤维细胞（NRK-49F）中亚细胞定位,以Western印迹和RT-PCR测定NRK-49F受到转化生长因子B1（TGF-β1）刺激后PHB表达的变化。（3）构建PHB表达质粒并转染,观察PHB对NRK-49F细胞周期以及表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白质和mRNA的影响。结果 （1）PHB蛋白主要表达于肾间质细胞和肾小管上皮细胞的胞质,随肾小管间质损伤程度加重而逐渐减弱（组间比较,均P〈0．01）,PHB表达量与肾小管间质损伤程度显著负相关（r=-0．802,P〈0．01）。（2）激光共焦显微镜下见PHB主要分布于NRK49F的细胞质,细胞核亦有较弱表达。TGF-β1刺激后PHB蛋白和mRNA表达均下调,呈现时间和剂量依赖关系（组间比较,P〈0．01）。（3）成功构建PHB真核表达质粒,转染48h细胞中PHB蛋白量升高约2．54倍（与未转染组比较,P〈0．01）。（4）转染PHB基因明显抑制TGF—β1所诱导的细胞增殖,使更多的细胞处于G0／G1期（与TGF-β1组比较,P〈0．01）,而对未受刺激的细胞无影响（P〉0．05）。（5）转染PHB基因明显抑制TGF—β1所诱导的α-SMA蛋白质和mRNA表达（与TGF-β1组比较,P〈0．01）,而对α-SMA基础表达无影响（与TGF-β1组比较,P〉0．05）。结论 PHB在肾组织中的表达水平可以反映肾小管间质损伤程度．外源性PHB显著抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖和表型改变。     

明胶改性聚β-羟基丁酸酯与鼠肾上腺细胞的生物相容性

目的 :探索明胶改性的聚 β-羟基丁酸酯 (PHB)与鼠肾上腺细胞的生物相容性 ,为以PHB为细胞载体进行肾上腺细胞移植提供实验依据。方法 :以明胶为改性材料对PHB进行改性 ,并将材料与肾上腺细胞共同培养 ,通过观察PHB与明胶对肾上腺细胞的形态学、增殖 (MTT法 )与分泌功能 (放免法 )的影响 ,来评价明胶改性的PHB与鼠肾上腺细胞的生物相容性。结果 :5 %浓度的明胶改性效果较好 ;明胶改性的PHB内可见细胞呈团簇状聚集生长 ,未改性的PHB内无细胞生长 ;PHB及改性材料明胶对体外培养的肾上腺细胞增殖活性 (1.87± 0 .0 3vs1.91± 0 .0 4 ,P >0 .0 5 )以及分泌功能均无影响 [(36 .4 3± 3.6 5 ) pg·ml-1vs (31.72± 2 .4 9) pg·ml-1,P >0 .0 5 ]。结论 :明胶可增加PHB的亲水性能 ;PHB及明胶对肾上腺细胞的生长、增殖、分泌功能无影响 ;以PHB为载体的肾上腺细胞移植治疗肾上腺皮质功能不全具有临床可行性。     

在动态旋转系统中构建小口径组织工程化血管的实验研究

目的探索在动态旋转系统中构建小口径组织工程化血管的可行性。方法将新型可降解材料聚羟基丁酸酯（PHB）做成多孔状PHB＋胶原包埋管形支架。采用酶消化法和组织块法分别培养人脐静脉血管内皮细胞、人脐动脉血管平滑肌细胞和人成纤维细胞的混合细胞悬液接种于胶原包埋的PHB内腔面,采用动态旋转系统下培养3周,行大体观察和扫描电镜观察。结果在动态旋转系统中构建的小口径组织工程化血管,在细胞结构上形成均匀血管组织。结论在动态旋转系统下构建组织工程化血管是可行的,为下一步行混合种植后行组织工程化血管移植试验打下基础。     

采用组织工程技术建造人工膀胱组织的实验研究

目的　通过将扩增的膀胱种子细胞与一定形状聚合材料复合后植入裸鼠体内进行培育 ,尝试采用组织工程技术建造人造膀胱组织的可行性。方法　从幼兔取膀胱 ,机械分离与酶消化获取上皮细胞和平滑肌细胞 ,在体外培养并扩增细胞 ,之后将上皮细胞和平滑肌细胞分别接种到聚合材料的内外表面 ,将其植入到裸鼠体内进行培育。对植入术后4、8周的标本取材 ,进行大体、组织学观察及免疫组化检测。结果　培育的细胞材料复合体的内壁可形成数层移行上皮细胞层 ,外壁由数层平滑肌细胞层构成。随着聚合材料的降解 ,移行上皮细胞与平滑肌细胞不断增殖并达汇合。结论　采用组织工程技术可再造出类似于正常膀胱壁的人造膀胱组织     

负载抗sca-1抗体和碱性成纤维细胞生长因子的脱细胞膀胱基质的生物性能研究

目的 观察负载抗sca-1抗体(anti-sca-1)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)-脱细胞膀胱基质(urinary bladder matrix,UBM)生物支架的生物学性能,探讨其作为新型盆底修复材料的可能性.方法 通过双特异性化学交联试剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-l-carboxylate,sulfosmcc)将anti-sca-1和bFGF特异性结合到UBM上,得到anti-sca-1/bFGF-UBM生物支架.通过扫描电子显微镜观察生物支架表面结构,CCK-8(cell counting kit-8)间接检测体外富集sca-1阳性细胞情况,免疫荧光观察支架诱导小鼠骨髓间充质干细胞(mouse mesenchymal stem cells,mMSCs)分化成熟情况.结果 扫描电子显微镜显示anti-sca-1和bFGF能特异性的结合到UBM上.anti-sca-1和bFGF组荧光强度明显高于对照组(P＜0.05).anti-sca-1/bFGF-UBM生物支架富集的sca-1阳性细胞明显较对照组多(P＜0.05).免疫荧光观察结果提示anti-sca-1/bFGF-UBM生物支架可以促进mMSCs向平滑肌细胞分化.结论 anti-sca-1/bFGF-UBM生物支架显示出了良好的生物性能,既能富集sca-1阳性细胞,又能进一步促进细胞分化成熟.