超声辐照微泡声学造影剂增强脂质体介导肝细胞基因转染的体外实验研究

目的研究超声破坏微泡声学造影剂提高脂质体介导肝细胞生长因子质粒（plRES—EGFP—HGF）在肝细胞中转染率的可行性。 方法将培养的肝细胞分为4组：（1）单纯对照组，（2）脂质体转染组，（3）超声辐照脂质体转染组，（4）超声辐照微泡＋脂质体转染组。第（4）组按照每孔加入造影剂剂量又分为1）10μl组，2）20μl组，3）30μl组，4）40μl组4亚组。超声辐照微泡＋脂质体转染组在脂质体介导肝细胞生长因子转染肝细胞1h后，在24孔板中每孔加入微泡声学造影剂10，20，30或40μl，超声辐照60s。24h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况、MTT法检测肝细胞增殖率和流式细胞仪检测基因转染率。 结果超声频率1MHz，功率0．5W／cm。辐照60S，每孔加入造影剂30μl时肝细胞基因转染效率最高，与脂质体转染组比较有显著性。 结论在一定条件下，超声辐照微泡声学造影剂可明显提高脂质体介导肝细胞基因转染效率，为基因治疗提供了新的思路。     

超声辐照SonoVue增强脂质体介导pEGFP-N1转染乳腺癌细胞

目的 探讨超声辐照SonoVue介导增强型绿色荧光蛋白报告基因质粒(pEGFP-N1)转染乳腺癌MCF-7细胞的最优条件以及超声联合微泡造影剂增强脂质体转染的效果.方法 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞,按照不同的辐照条件分组:不处理组,超声辐照十质粒组,微泡浓效组,超声声张组,辐照时间组及工作周期组.分别进行超声辐照,辐照后以MTT法测细胞存活度,流式细胞仪测pEGFP-N1瞬时转染率,取得最佳的辐照条件.重新准备细胞后先以脂质体转染细胞,2 h后加入超声微泡并以最佳条件辐照,用同样的方法测细胞存活率及转染率.结果 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期(占空比)为超声辐照SonoVue介导pEGFP-N1转染MCF-7细胞的最优条件,转染率为(14.21±2.55)%,细胞存活率为(84.60±2.85)%.在增强脂质体转染的实验中,超声微泡脂质体组的转染率最高(22.15±2.69)%,与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.05),此时细胞存活率为(80.13±3.61)%.结论 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期是MCF-7细胞的最佳转染条件,超声联合微泡能够增强脂质体转染的效果.     

微泡造影剂及超声促进绿色荧光蛋白质粒在人肝癌细胞HepG2内表达的实验研究

目的研究微泡造影剂与超声辐照是否能提高绿色荧光蛋白质粒在人肝癌细胞HepG2中的转染率。方法将培养的HepG2细胞分为四组：第一组为对照组；第二组以脂质体转染；第三组加入微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照；第四组加入脂质体和微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照．将合有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人肝癌细胞HepG2，24小时后以荧光显微镜观察人肝癌细胞HepG2中的绿色荧光蛋白表达情况，并用流式细胞仪测算转染率。结果脂质体转染组与微泡造影剂＋超声辐照组有显著性差异（P〈0．05）。脂质体＋微泡造影剂＋超声辐照组与微泡造影剂＋超声辐照组有显著性差异（P〈0．01）结论微泡造影剂和超声辐照协同脂质体能提高目标基因在肝癌细胞内的转染率。     

超声波与微泡声学造影剂增强基因定位转染动物实验研究

目的观察经静脉注射基因与微泡声学造影剂,同时经皮超声辐照肝脏方式能否增强小鼠肝脏基因定位转染及其转染效率.方法昆明种小白鼠24只,随机分为4组,每组6只.第1组为单纯质粒转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg乙型肝炎核心抗原(pcDNA3.1/HBV)质粒的生理盐水溶液.第2组为单纯微泡转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的微泡声学造影剂.第3组为单纯超声转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的生理盐水溶液,同时采用频率为1 MHz、声强为0.5 W/cm2的超声波经小白鼠体表肝区辐照1 min.第4组为超声与微泡转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的微泡声学造影剂,同时经小白鼠体表肝区局部采用相同剂量超声辐照1 min.7天后处死小鼠,分别取肝、肾、肺、心、脾、骨骼肌组织进行pcDNA3.1/HBV免疫组化检测,记录不同组织每高倍视野(×400)pcDNA3.1/HBV表达阳性细胞数.结果第1、2组肝、肾组织内偶见pcDNA3.1/HBV表达弱阳性细胞,肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达阳性细胞.第3组肝组织内可见少量pcDNA3.1/HBV阳性细胞,每高倍视野表达阳性细胞(26.5±3.9)个.肾、肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达.第4组肝组织内pcDNA3.1/HBV表达最强,每高倍视野表达阳性细胞(84.2±4.4)个,为第3组的约3.2倍.肾、肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达.结论静脉注射黏附质粒的微泡声学造影剂同时经体表给予一定强度的超声辐照,能显著增强辐照部位局部组织的基因转染与表达,有望成为一种安全、高效的体内基因定位转染新技术.     

不同转染方法对荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞影响的实验研究

目的:探讨荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的最佳转染方法.方法:以脂质体转染法、超声辐照法、微泡造影剂SonoVue联合超声辐照及脂质体中加入微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照4种转染方法,将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人胚肾293T细胞,48 h后以荧光显微镜观察293T细胞中的绿色荧光蛋白表达情况并用流式细胞仪测算转染率.结果:脂质体 SonoVue 超声辐照法的转染效果最好(23.10±2.11%).脂质体 SonoVue 超声辐照法的转染率分别与脂质体转染法、超声辐照法、微泡造影剂SonoVue联合超声辐照法的转染率比较均有显著差异(P<0.01).结论:脂质体中加入微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照能显著提高荧光蛋白质粒在人胚肾293T细胞中的转染效果.     

超声微泡造影剂介导pEGFP-N1转染小鼠角膜的实验研究

目的 探讨微泡造影剂声诺维联合超声介导绿色荧光蛋白质粒转染小鼠角膜的转染效率和安全性.方法 小鼠眼前房分别注射生理盐水、质粒+生理盐水、质粒+造影剂、脂质体+质粒等,以50 Hz,2 W/cm2的脉冲波超声辐照质粒+生理盐水和质粒+造影剂眼10 min.术后第1 d、第3 d、第7 d、第14 d和第21 d荧光体视镜观察眼表EGFP表达出现情况,冰冻切片荧光显微镜观察阳性细胞的分布,病理切片观察组织有无损伤.结果 造影剂联合超声辐照组小鼠眼表出现绿色荧光蛋白的弥漫性表达,明显高于单纯超声辐照组和脂质体转染组,其余对照各组眼表均未见绿色荧光.第3 d时的病理切片各组均无异常.结论 声诺维联合超声辐照在体能安全、有效地介导基因转染眼组织.     

超声联合微泡增强脂质体介导基因转染RPE细胞的实验研究

目的 比较声诺维联合超声与脂质体法介导基因转染RPE细胞的转染率和安全性,探讨超声联合微泡增强脂质体转染率的可行性.方法 RPE细胞培养在24孔板,质粒用量2 μg/孔,分为对照组、超声辐照组、超声联合微泡组(包括2 W/cm2和3 W/cm2两个亚组)、脂质体组、脂质体+超声+微泡组5组,每组10孔细胞.荧光显微镜观察基因转染情况,流式细胞仪检测基因转染率,Annexin Ⅴ-FITC和PI双染流式细胞法检测凋亡率.结果 单纯超声辐照组基因转染率为(1.06±0.13)%,超声联合微泡组分别为(15.81±1.70)%和(20.86±2.63)%,脂质体组为(30.06±3.49)%,明显高于超声联合微泡组(P<0.05).脂质体+超声+微泡组为(44.51±1.28)%,明显高于脂质体组(P<0.05).结论 脂质体介导EGFP转染RPE细胞的效率高于超声联合微泡的转染率.超声联合微泡能明显提高脂质体的转染率.     

共聚物P85联合超声微泡介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨共聚物P85与黏附增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresent protein,EGFP)质粒的微泡造影剂(microbubble,MB)结合后联合一定强度的超声(ultrasound,US)辐照,是否增强人肝癌细胞(HepG2)的质粒转染及表达.方法 以人肝癌细胞(HepG2)为研究对象,质粒DNA是可表达绿色荧光蛋白的pEGFP,添加微泡造影剂或共聚物P85后进行脉冲多普勒超声辐照(频率1 MHz,声强1 W/cm2,工作周期20%,时间20 s).24 h后台盼蓝染色评价细胞存活率,荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞的基因转染率.结果 有超声辐照组的pEGFP转染率明显高于无超声辐照组(P＜0.01),有超声辐照组中pEGFP+30%MB+P85+US组转染效率(22.14±3.06)%优于单独使用微泡组(11.34±2.2)%或P85组(9.72±1.21)%(P＜0.01).结论 微泡造影剂与共聚物P85结合同时给予超声辐照可增强基因转染效率,在基因治疗上有待于进一步关注和研究.     

超声辐照联合微泡造影剂介导人血管生成素-1基因体外转染293T细胞的研究

目的 探讨超声辐照联合微泡造影剂的基因转染系统介导人血管生成素-1(hAng-1)基因转染人胚肾293T细胞的转染效率.方法 将六孔板中的293T细胞悬液分为4组:A组,超声+质粒组,每孔加入10 μg目的 基因质粒;B组,超声+微泡+质粒组,每孔加入微泡和质粒混合液,终浓度分别为质粒10 μg/孔,微泡200 μl/孔;C组,脂质体+质粒组,每孔加入4 μl脂质体和5 μg质粒;D组,对照组,每孔仅加入10 μg目的 基因质粒.A组和B组均接受超声辐照,照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,作用时间为30 s.转染后48 h用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性、定量观察基因的转染效率.结果 48 h后,荧光显微镜下观察到转染成功的细胞胞浆内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组、D组的基因转染效率分别为(3.5±0.4)%、(20.8±1.2)%、(18.0±0.9)%和(0.2±0.1)%.结论 超声本身即有促进基因转染的作用,超声辐照联合微泡造影剂后则增强了这种作用,明显增加了基因的转染效率.     

脉冲超声辐照微泡增强脂质体介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨脉冲超声辐照微泡超声造影剂提高脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒在肝癌,细胞(HepG2)中转染率的可行性.方法 将HepG2接种在24孔板中,随机分为以下6组:①空白对照组;②质粒+脂质体组;③超声+质粒组;④超声+质粒+微泡组;⑤超声+质粒+脂质体组;⑥超声+质粒+脂质体+微泡组.荧光显微镜及流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白表达及转染效率;MTT法检测此转染方法对HepG2生长活性的影响.结果 超声+质粒+脂质体组的转染效率最高,并对细胞活性无明显影响;而超声+质粒+脂质体+微泡组转染效率与超声+质粒+脂质体组比较差异无统计学意义(P＞0.05),但细胞活性与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 脉冲超声辐照可介导基因转染,并能提高脂质体基因转染效率.同时,在一定条件下,超声微泡造影剂可提高超声介导基因转染效率,此方法可为基因转染提供新的思路.