免疫磁珠捕获联合PCR-ELISA定量检测结核分枝杆菌的方法学研究

目的采用免疫磁珠捕获(IMC)联合双内标PCR-ELISA(IMC-PCR-ELISA)技术,建立定量检测结核分枝杆菌的方法。方法制备能够特异性捕获结核分枝杆菌的免疫磁珠(Dynabeads)。并根据结核分枝杆菌Mtp40基因序列以及结核分枝杆菌复合体群IS6110序列,设计2对特异性引物(上游引物的5′端用生物素修饰),以及2条与PCR扩增片段等长的内参照片段(其与扩增模板在引物区的序列相同)和3套捕获探针(3′端用地高辛标记)。先通过免疫磁珠特异性捕获结核分枝杆菌,再联合双内标PCR-ELISA技术检测结核杆菌。结果采用IMC-PCR-ELISA技术定量检测结核分枝杆菌,全过程约4h,检测限为5×103 copies/mL,当低内标模板浓度在30~70copies/mL,高内标模板浓度在8 000~12 000copies/mL时,计算出的浓度与实际加入的目的模板浓度之间有良好的线性关系(r2=0.998),未发现非特异性反应。结论成功建立了IMC-PCR-ELISA定量检测结核分枝杆菌的方法,此方法具有快速、灵敏、特异、可定量的特点。     

宋内志贺菌中ESBLs的检测

目的了解宋内志贺菌中ESBLs的基因型别。方法琼脂稀释法测定3株宋内志贺菌对8内酰胺类等抗菌药物的耐药性，改良三维试验进行产ESBLs菌株的表型鉴定，并进行转移接合试验；采用TEM、SHV、CTX—M-1组、CTX-M-2组、CTX-M-13组β内酰胺酶基因通用引物以及TEM、CTX—M-β组全编码基因引物进行PCR检测和DNA序列分析；同时对这些菌株进行指纹分析脉冲场电泳（PFGE）检测。结果3株宋内志贺菌对青霉素类、第一、二代头孢菌素以及庆大霉素、四环素、复方磺胺甲嗯唑显著耐药，对第三代头孢菌素中头孢曲松、头孢噻肟中度敏感，对亚胺培南、头孢美唑、氟喹诺酮类、头孢噻肟-克拉维酸、头孢他啶-克拉维酸显示敏感。这些菌株均为产ESBLs菌株，ESBLs基因型别为CTX-M-14，并同时产生TEM-1型广谱β内酰胺酶；CTX-M-14编码基因可以接合方式发生水平转移；3株菌株的PFGE谱型相同。结论3株宋内志贺菌产生CTX—M-14型ESBLs，引起对多种β内酰胺类抗生素耐药，并存在克隆传播，应加强监测。     

磁珠捕获法在去除残留消毒剂中的应用

目的研究磁珠捕获法在化学消毒剂杀菌效果试验中去除残留消毒剂的应用。方法通过中和剂鉴定试验程序,采用活菌计数法,评价磁珠捕获法去除残留消毒剂的效果。结果裸磁珠Ⅱ的吸附性能最佳,吸附率>99.25%。0.03 mol/L PBS溶液较大得削弱了裸磁珠的吸附性能,其余溶液几乎无影响。磁珠捕获法与中和剂法结合后,能进一步去除残留消毒剂。结论磁珠捕获和中和剂结合法能有效降低中和剂筛选的难度和复杂度,是一种较实用有效的评价化学消毒剂杀菌效果的方法 。     

志贺菌与大肠杆菌进化关系的研究进展

志贺菌属(Shigella)细菌(旧称痢疾杆菌),是一类具有高度传染性、危害严重的革兰阴性肠道致病菌,由其临床感染所导致的志贺菌性痢疾(shigellosis)是世界上,尤其是发展中国家重要的传染病之一。全球每年的志贺菌性痢疾病例近1．65亿,其中1．63亿发生在发展中国家,并导致110万患者死亡,60％以上为5岁以下的儿童。     

志贺菌的菌型分布与耐药性分析

目的了解上海地区近年来志贺菌的菌型分布与耐药现状,指导临床合理用药。方法对临床分离的120株志贺菌进行生化鉴定、血清学分型和Kirby-Bauer纸片扩散法（K-B法）药物敏感性试验。结果120株志贺菌中,福氏志贺菌62株占51．7％（包括福氏变异株7株,占总数的5．8％）,宋内志贺菌58株占48．3％。志贺菌对多种常用抗菌药物呈高度耐药,且多为多重耐药,对第三代头孢菌素的耐药率最低,其次为氟喹诺酮类。福氏志贺菌与宋内志贺菌对多种药物的耐药率差异有显著性。结论上海地区检出的志贺菌以福氏和宋内志贺菌为主,福氏志贺菌中以福氏2型居多（占67.7％）,其次为福氏1型（占14．5％）;志贺菌尤其是福氏志贺菌对某些抗生素的耐药率有上升趋势,应引起临床重视,根据药敏试验结果合理用药。     

60株志贺菌耐药性分析

目的了解我院肠道志贺菌的常见耐药谱,指导临床医生合理使用抗生素.方法收集我院2001年7～9月份肠道60株志贺菌,并用K-B法检测其对7种抗生素的药物敏感试验.结果 60株志贺菌中,宋内志贺菌27株(45%),福氏志贺菌33株(55%).志贺菌属对复方新诺明耐药率最高(81.7%),其次为氨卞西林(61.0%),对三代头孢和氧氟沙星耐药率最低.结论志贺菌对某些抗生素的耐药率正在上升,临床应加强对肠道志贺菌耐药性的监控 .     

福氏志贺菌4c型的检测分析与体会

志贺菌属是引起细菌性痢疾的主要病原菌，我国以福氏志贺菌为最多，宋内氏次之，该病不仅能通过食物或水传播，还可由人接触性传播。[第一段]     

免疫磁珠法在肾移植HIL快速分型中的应用

临床为了尽快选配供受者,常常需要快速分离纯化Ｔ、Ｂ淋巴细胞,进行ＨＩＬ快速分型。应用免疫磁珠法与传统方法从等待肾移植的肾脏病患者和供体捐献者的静脉或腹腔血中分离Ｔ、Ｂ淋巴细胞,进行ＨＩＬ－Ｉ、Ⅱ类抗原组织配型。结果显示,在ＨＩＡ组织分型中免疫磁珠法操作简单快速,分离的淋巴细胞纯度高、活力强、实验结果准确、分型抗原易于指定,有利于临床快速选配供受体等特点。在肾移植组织配型中可取代传统的方法。     

志贺氏菌属菌群菌型的动态学分析

对我市急性腹泻患者粪便中所分离的 30 1株志贺氏菌属的分布及药敏情况进行动态分析如下。1　对象和方法1.1　对象　 1997～ 2 0 0 2年 7～ 9月份我市部分医院肠道门诊及住院处急性腹泻患者粪便。1.2　方法　 1培养基 :SS琼脂平板及克氏双糖铁 (为我院细菌室制备 ) ;生化反应培养基购自上海医化所。 2诊断血清 :购自北京卫生部生物制品检定所。 3分离方法 :按肠道菌常规方法进行。4药敏试验 :按 K- B法试验。纸片由上海医化所和北京天坛药物技术开发部生产。2　结果2 .1　志贺氏菌菌群分布　 1997～ 2 0 0 2年共检出 30 1株志贺氏菌 ,其中…     

免疫磁珠与荧光定量逆转录聚合酶链反应在胃癌患者外周血癌细胞检测中的应用价值

目的研究免疫磁珠和荧光定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测胃癌患者外周血癌细胞的应用价值。方法将不同浓度的人胃腺癌细胞系MGC803细胞加入到健康人血中,经淋巴细胞分离液收集单核细胞后,等分4份。其中1份直接用于提取RNA(方法Ⅰ)、其他分别用阴性磁珠(方法Ⅱ)、阳性磁珠(方法Ⅲ)及联用阴性和阳性磁珠(方法Ⅳ)富集癌细胞。然后,以癌胚抗原(CEA)mRNA作为分子标志物进行荧光定量RTPCR检测其相对拷贝数;并检测45例胃癌、30例胃溃疡患者和30名健康人外周血CEAmRNA。结果方法Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ测得的CEAmRNA相对拷贝数与癌细胞数间有良好的相关性(方法Ⅱ和ⅢP<005;方法ⅣP<001),尤以Ⅳ方法为佳,可检测出每毫升血中含有的1个胃癌细胞。Ⅰ～Ⅳ方法检测胃癌患者阳性率分别为4222%、5333%、5111%和6444%;方法Ⅳ与方法Ⅰ比较,差异有显著意义(P<005)。用方法Ⅳ检测30例胃溃疡患者均为阴性,而其他3种方法检出2例阳性;30名健康人中4种方法均未检出扩增产物。结论免疫磁珠与荧光定量RTPCR法可提高胃癌患者外周血CEAmRNA的检出率。     

免疫磁珠法检测外周血微转移前列腺癌细胞的方法学探讨

目的:探讨前列腺癌外周血微转移免疫磁珠检测方法学的建立及其意义。方法:体外培养前列腺癌LNCaP细胞,将其分别与外周血单个核细胞(PBMC)及全血细胞混合,混合细胞悬液和事先已与单克隆抗体(鼠抗人PSMA单抗)预孵育的包被人抗鼠IgG抗体的磁珠作用,在磁架上分离,显微镜观察,计算玫瑰花环形成率,并进行灵敏度的检测。台盼蓝染色检测分选前后癌细胞存活率。结果:免疫磁珠检测法敏感性高,当PBMC与LNCaP细胞比例为106:1时可以检测到癌细胞,检测灵敏度为20个肿瘤细胞/mL外周血。分选后癌细胞活率较之分选前未明显改变。结论:免疫磁珠法是一种简便、快速、灵敏并且临床实用价值高的检测技术,可为临床早期发现前列腺癌微小残留提供新的思路,有助于前列腺癌的治疗和预后判断。     

用免疫磁珠法检测抗白念珠菌烯醇化酶抗体

摘要：目的：建立检测人血清抗白念珠菌烯醇化酶(Eno)IgG类抗体的免疫磁珠法,并评估其在念珠菌血症诊断中的价值。 方法：将Eno重组蛋白耦联至磁性微珠上,以辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人IgG为二抗,优化免疫磁珠法的反应条件,考察其精密度和特异性。收集经血培养确诊的念珠菌血症患者（n=113）、念珠菌定植者（n=50）、细菌菌血症患者（n=30）和健康人对照者（n=100）血清,用免疫磁珠法测定抗Eno抗体,并与ELISA法结果进行比较。 结果：免疫磁珠法测定抗Eno抗体的批内、批间变异系数（CV）分别为8.2%和14.2%,重组Eno抗原对相应抗体的阻断率为91.6%。以吸光度（A）值0.29为cut off值时,诊断念珠菌血症的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为80.5%、92.3%、90.1%和84.5%。免疫磁珠法的敏感性和特异性与ELISA法比较无统计学差异,但检测流程从37 ℃ 2.5 h缩短至常温1 h。 结论：免疫磁珠法检测抗Eno IgG类抗体简便、快捷、可靠,在侵袭性念珠菌感染研究中具有潜在的应用价值。     

免疫磁珠技术在病原微生物检测中的应用前景

免疫磁珠是磁性微球与免疫配体结合而成的一种免疫学技术.1979年挪威科学家John Ugelstad通过显微镜首次看到自己制备的尺度均一的聚苯乙烯微球时,可能不会料到这些微球经过磁化在此后30年间引发了一场生物分离技术革命[1].免疫磁珠不仅能分离和检测几乎所有骨髓及血细胞、肿瘤细胞,还可分离细菌等多种微生物,在免疫学检测、生物大分子纯化等方面应用甚广.     

志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光聚合酶链反应快速检测方法的应用研究

目的建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术,为从患者、食品和环境中快速分离和鉴定志贺菌提供技术支撑。方法根据志贺菌ipaH基因序列设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针;通过对PCR扩增体系和反应条件的优化,建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法;用添加已知志贺菌浓度的样本验证方法敏感性;用志贺菌标准菌株、分离株以及大肠埃希菌、沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性。结果用本研究建立的志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法检测志贺菌,其Ct值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系（Y=-3.93×log（X）＋37.34,R=0.999）,最低检测浓度为30cfu/ml,3株志贺菌标准株,30株志贺菌分离株检测结果均为阳性;而沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等91株其他细菌的Ct值均〉35或扩增曲线成一平滑直线。与常规分离鉴定方法比较差异无统计学意义（P〉0.05,χ^2=0.27）。对于纯菌和食品样品整个检测过程仅需2h和10h。结论志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术具有特异性强,敏感性高,易操作等优点,有很好的应用前景和研究价值。     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应（PCR）技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8h内同时检测3种目的菌,通过检测其他9种常见食源性致病菌,结果表明该方法特异性好,多重PCR检测灵敏度分别为：沙门菌10^4cfu／mL,志贺菌10^2cfu／mL,副溶血性弧菌10^4cfu／mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应(PCR)技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8 h内同时检测3种目的菌,通过检测其他9种常见食源性致病菌,结果表明该方法特异性好,多重PCR检测灵敏度分别为:沙门菌104cfu/mL,志贺菌102cfu/mL,副溶血性弧菌104cfu/mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

氟喹诺酮耐药志贺菌中质粒介导qnr基因的检测

目的检测志贺菌对氟喹诺酮抗菌药物的耐药情况,探讨氟喹诺酮耐药与志贺菌携带质粒介导qnr基因的关系。方法用纸片扩散法对100株志贺菌（福氏志贺菌50株,宋内志贺菌50株）进行耐药性检测,聚合酶链反应（PCR）检测志贺菌质粒介导qnr基因并进行DNA测序,分析qnr基因的存在与药敏结果的关系。结果 100株志贺菌中有9株检出qnr基因,检出率为9%（9/100）,福氏志贺菌为4%（2/50）,宋内志贺菌为14%（7/50）;qnr基因阳性菌株对氧氟沙星的耐药率（11.1%）高于阴性菌株（5.5%）,但差异无统计学意义。qnr基因阳性菌株对5种氟喹诺酮药物的抑菌圈中位数比较均缩小。结论宋内志贺菌质粒介导氟喹诺酮耐药qnr基因的携带率明显高于福氏志贺菌;志贺菌若携带质粒介导qnr基因则会导致对氟喹诺酮药物的敏感性下降。     

改良TT增菌液在分离肠道致病菌沙门菌和志贺菌的应用评价

目的分析改良TT增菌液在分离肠道致病中沙门菌和志贺菌的效果评价。方法采用常规接种麦康凯平板及SS平板,同时另外加种改良TT增菌液(硫代硫酸钠碳酸钙增菌液)两种不同方法筛查沙门志贺菌,并参考该院历年菌株分离情况进行血清凝聚。采用SPSS18.0统计软件包处理数据,比较两种不同粪便培养方法对沙门菌和志贺菌的分离率之间差异。结果 2013~2015年纳入统计分析粪便培养标本790例,采用常规方法分离出沙门菌属30例,阳性率3.80%;志贺菌属5例,阳性率0.63%;而采用改良TT增菌培养方法分离出沙门菌属77例,阳性率9.75%,志贺菌属7例,阳性率0.89%;采用改良TT增菌液培养方法沙门菌检出率是常规培养方法2.57倍,志贺菌属是1.41倍,两种方法对沙门志贺菌属的分离差异均有统计学意义(P0.05)。结论改良TT增菌液能够显著地提高粪便培养沙门菌和志贺菌的阳性分离率,为临床医生正确诊治患者提供较大帮助。     

流式微球检测超敏C反应蛋白方法学的建立及性能评价

目的建立流式微球分析技术（CBA）检测人血清中超敏C反应蛋白（hs—CRP）的方法并对其进行系统性评价。方法将hs—CRP鼠抗人单克隆抗体包被在已激活的羧基化聚苯乙烯微球上,用正交试验对试验条件进行优化选择,并应用美国临床实验室标准化协会的有关规则进行方法学评价。结果试验选择hs—CRP鼠抗人单克隆抗体的加入量为10μg,生物素标记的羊抗人单克隆抗体的稀释倍数为1：540,第一次反应时间为2h、洗涤2次,PE标记亲和素的稀释倍数为1：1000,第2次反应1h洗涤1次。方法学评价显示,CBA检测hs—CRP的分析灵敏度为0．03ng／mL,线性范围为0．03～333．33ng／mL,批内变异系数为2．70％～4．44％,批间变异系数为4．99％～9．52％,准确度相对偏倚为2．17％～4．39％,回收率为98．31％～104．60％。高浓度的三酰甘油、胆固醇和胆红素对3种因子有一定的干扰率,低浓度的三酰甘油、胆固醇和胆红素对3种因子干扰较小。分别与免疫荧光方法比较差异无统计学意义。结论自建的hs—CRP流式微球检测技术性能指标满足公认的质量指标,可拓展流式细胞分析技术,值得临床推广使用。