金黄金葡萄球菌肠毒素基因定研究

对４０株产１种或１种以上肠毒素的金黄色葡萄球菌（以下简称金葡菌）进行分析，结果全部金葡菌肠毒素Ａ（ＳＥＡ，１２／１２）、金葡菌肠毒素Ｃ（ＳＥＣ，１９／１９）、大部分金葡菌肠毒素Ｂ（ＳＥＢ，２３／２８）的产生不因质粒的消除而消失，说明ＳＥＡ、ＳＥＣ的基因位点在染色体上。有５株金葡菌因质粒消除而推动产ＳＥＢ的能力，其基因位点，可能在质粒或染色体上。４株金葡菌亦均因质粒消除失去产金葡菌肠毒素Ｄ的能力，其     

金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因的检测

[摘要]目的 检测临床分离的金黄色葡萄球菌肠毒素基因,了解肠毒素基因的携带情况。方法 根据Genbank的序列设计合成金黄色葡萄球菌肠毒素基因A-F的引物,采用聚合酶链反应方法对随机收集的124株金黄色葡萄球菌肠毒素基因进行检测,并进行序列分析。结果 在124株受检的金黄色葡萄球菌中,116株检出肠毒素基因,检出率为93.5%,其中SEA、SEB、SEC、SED和SEF的检出率分别为90.5%、6.9%、61.3%、5.2%和25.9%,未检测出SEE基因。同时检出2种及2种以上的肠毒素基因的菌株有78株（67.2%）,以携带SEA+SEC、SEA+SEF和SEA+SEC+SEF基因为主,检出率分别为33.6%,7.8%,13.8%。序列分析显示所检出的肠毒素基因与Genbank上登陆的参考序列的同源性为97%～100%。结论 金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因携带率高,其中以携带SEA、SEC、SEF基因为主。     

金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因的调查分析

摘要：目的检测临床分离的金黄色葡萄球菌（SA）肠毒素基因,了解肠毒素基因的携带情况与SA耐药的关系。方法采用聚合
酶链反应检测SA mecA基因和肠毒素基因,了解肠毒素基因在SA中分布的状况,并对其进行耐药性分析。结果67株甲氧西
林耐药的SA（MRSA）和57株甲氧西林敏感的SA（MSSA）肠毒素基因携带率（100% vs 83.5%）无明显差异（χ2=0.203,P>0.05）。
肠毒素基因检出率为93.5%（116株）,其中SEA、SEB、SEC、SED和SEF的检出率分别为90.5%、6.9%、61.3%、5.2%和25.9%,未
检测出SEE基因。同时检出2种及2种以上的肠毒素基因的菌株有78株（67.2%）,以携带SEA+SEC、SEA+SEF和SEA+SEC+
SEF基因为主,检出率分别为33.6%、7.8%和13.8%。与携带一种肠毒素基因的菌株耐药率相比,携带多种肠毒素基因的菌株耐
药率呈上升趋势,其中携带SEA+SEC+SEF的菌株对复方新诺明的耐药率为75.0%,高于单独携带SEA（28.6%）、SEA+SEC
（38.7%）的耐药率,具有统计学差异（P<0.05）。携带SEA+SEC+SEF、SEA+SEF、SEA的菌株对阿米卡星耐药率分别为75.0%、
77.0%和21.5%,前两者与携带SEA的菌株相比有显著差异（P<0.05）。结论临床分离的SA中携带多种肠毒素基因的菌株在耐
药率上高于只携带一种肠毒素基因的菌株,提示肠毒素在SA耐药中起重要作用。
     

金黄色葡萄球菌L型产B型肠毒素及其基因的研究

目的: 探讨金黄色葡萄球菌(金葡菌)L型肠毒素B的产生量及其基因存在情况。方法: 将金葡菌诱导成稳定L型后,用ELISA法检测葡萄球菌肠毒素B(SEB),用PCR法检测SEB基因。结果: 金葡菌L型SEB的产生量与原菌比差别无显著性(P>0.05),PCR发现478bp的阳性条带。结论: 金葡菌变异为L型后SEB产生量不变,其基因也未丢失。     

临床标本金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布及耐药性

目的 了解临床分离的金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布及耐药情况。 方法 对金黄色葡萄球菌进行分离鉴定。采用聚合酶链反应检测肠毒素基因 (SEA~SEE),采用K-B法进行药敏试验。 结果 共收集到138株金黄色葡萄球菌,其中74株分离自痰液标本,占53.62%;从年龄≥50岁患者中分离得到102株菌株,占73.91%;金黄色葡萄球菌中肠毒素阳性为120株,检出率为86.96%,SEA、SEB、SEC和SEE阳性率分别为63.33%、46.67%、45.00%和37.50%,未检测出SED基因,分离自痰液标本菌株以携带SEA和SEC为主,而分离自创面分泌物菌株则以携带SEB和SEE为主;药敏 结果 显示金黄色葡萄球菌对青霉素（96.67%）、红霉素（81.67%）、氯霉素（74.17%）、四环素（71.67%）耐药较为严重,对呋喃妥因（6.67%）、复方磺胺甲恶唑（16.67%）、阿莫西林/克拉维酸钾（4.17%）则比较敏感,所有菌株对万古霉素、替考拉宁均敏感。 结论 临床分离的金黄色葡萄球菌肠毒素基因携带率较高;不同标本来源的金黄色葡萄球菌携带肠毒素基因型存在差异,对于临床金黄色葡萄球菌的感染治疗应根据药敏结果选择合理的抗生素。     

金黄色葡萄球菌SEB基因的克隆及其系统发生分析

目的克隆和测定金黄色葡萄球菌深圳分离株S4070肠毒素B（SEB）基因序列,并作系统发生分析。方法采用PCR法从金黄色葡萄球菌S4070基因组中扩增出SEB基因片段,纯化后与pMD-18T载体连接构建重组子pMD-18T-SEB,并转化E.coli DH5α;阳性克隆质粒经双酶切法鉴定后,采用双脱氧末端终止法作序列测定,并以BLAST和MEGA4软件分析其分子特征。结果从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出约704bp的基因片段,阳性克隆质粒鉴定结果与预期一致;序列测定结果显示,所克隆的SEB基因片段含704个碱基,与GenBank中17株金黄色葡萄球菌SEB基因序列比对,无碱基的插入或缺失,同源性均为98%以上;基于SEB基因序列,采用邻位连接法（Neigh bor-joining）构建系统发生树,深圳S4070株与日本分离株NN35、NN37、NN41-F1D、NN41-F1F和NN41-F1G以及印度分离株DQ535901、DQ535902的遗传距离小,同处在一个分支群上。结论实验成功克隆了金葡菌深圳株S4070 SEB基因,不同分离株间SEB基因序列相对保守,本分离株与日本和印度分离株遗传关系较近。     

一起食物中毒中金黄色葡萄球菌的分子特征分析

目的利用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术对一起食物中毒中检出的金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)进行分子分型,了解毒株的肠毒素类型,为金葡菌的分子溯源研究提供实验室数据。方法 mini VIDAS全自动荧光酶标免疫测试仪检测样品中葡萄球菌肠毒素。按照GB 4789.10-2010对样品进行菌株分离和生化鉴定,应用MLST方法对分离出的金葡菌进行基因分型,酶联免疫吸附法对分离株进行葡萄球菌肠毒素分型。结果分别从病人的呕吐物、食堂师傅手涂抹物、厨房刀涂抹物中检出金葡菌,呕吐物中检出葡萄球菌肠毒素;可疑食物中未检出金葡菌,葡萄球菌肠毒素为阴性。中毒毒株MLST分析得到4个ST序列型,ST5、ST15、ST59和ST338,其中ST5型金葡菌产肠毒素C、肠毒素D和肠毒素E; ST15型菌产肠毒素E; ST59型和ST338型菌产肠毒素B和肠毒素C。结论此食物中毒由不同MLST型别的金葡菌引起,毒株产葡萄球菌肠毒素的类别也不同。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因克隆、表达及其抗血清在食物中毒快速检测上的应用

目的克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因,制备金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）的多克隆抗体,应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的诊断。方法用核酸扩增技术从金黄色葡萄球菌菌株中分离产生肠毒素B的标准菌株,采用高保真PCR技术从金黄色葡萄球菌野生株中扩增全长SEB,目的片段经TA克隆后DNA序列测定,重组质粒pGEM—SEB经酶切获得的SEB基因片段与真核表达载体pGEX-4T-3连接,将重组真核载体pGEX-4T-3-SEB转化人E．coli BL21（DE3）株,在0．1mmol／LIPTG诱导下,诱导SEB基因在E-coli BL21（DE3）株中表达,用谷光苷肽Sepharose4B柱分离纯化GST融合蛋白,用SDS—PAGE检测重组SEB（rSEB）的表达,重组蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清,并用抗血清与天然的SEB和rSEB进行Westembolt分析。结果成功克隆了822bpSEB基因,编码272个氨基酸,在E．coli BL21（DE3）株中表达了rSEB,分离纯化的rSEB能够诱导小鼠产生IgG抗体,此抗体不仅能够与rSEB反应,而且能够与天然的SEB特异性的反应。结论重组SEB具有抗原特性,制备的特异性抗体可应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的快速诊断,将能够建立特异性强、敏感性高的金黄色葡萄球菌的诊断体系,同时也有助于对SEB在抗肿瘤机制、炎症过程中的作用等方面研究。     

不鼻息肉中金葡菌及其毒素B测定临床意义

目的探索鼻息肉形成与金葡菌感染之间的关系。方法选择鼻息肉病人和对照组病人各50例作为研究对象。分别于每位患者后鼻腔取分泌物做细菌培养,同时采血血清ELISA法测定金葡菌肠毒素B（Staphylococcal enterotoxin B,SEB）。结果（1）50例鼻息肉标本中有21例于分泌物中培养出金葡菌菌落,50例对照组标本中有8例培养出金葡菌菌落。经χ^2检验检出率不同有统计学意义。（2）以30例鼻息肉和30例肥厚性鼻炎病人进行SEB抗体（ELISA法）滴度测定,前者平均值高于后者。经两独立样本的t检验证明2组SEB抗体滴度的差异有统计学意义。结论结果显示鼻息肉的形成与金葡菌的感染可能有一定关系。     

金黄色葡萄球菌肠毒素的检测和耐药性分析

目的了解临床分离的金黄色葡萄球菌(SA)产肠毒素(SE)的情况及耐药现状。方法对从临床标本中分离出的260株SA,用反向间接血凝试验检测其肠毒素,按2005年美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的标准,用K-B法对260株SA进行药物敏感性试验,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检测分别用检测头孢西丁及乳胶凝集检测PBP2a方法进行。结果260株SA中有172株携带肠毒素,占66.2%,主要为SEA型10.8%(28/260)、SEB型14.6%(38/260)、SEC型10.0%(26/260),同时携带二种或二种以上肠毒素的占23.8%(62/260);其中MRSA134株,全部携带肠毒素,且以SEA、SEB和SEC为主,分别为19.4%、16.4%和13.4%;甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)126株,携带肠毒素率为30.0%(38/126),以SEB为主,占9.5%。用头孢西丁及检测PBP2a的方法检测MRSA,检出率无显著意义(P>0.05);SA对临床常用的抗菌素除万古霉素及替考拉宁较敏感(100.0%敏感),其它的抗菌素存在多重耐药性,且MRSA的耐药性比MSSA的强。结论临床分离的SA株大部分都携带肠毒素,MRSA的带毒率及耐药性均高于MSSA;临床应重视SA肠毒素和MRSA的检测,合理使用抗菌素。     

金黄色葡萄球菌毒素基因的检测及临床应用

目的:了解医院获得性金黄色葡萄球菌(HA-SA)和社区获得性金黄色葡萄球菌(CA-SA)所携带肠毒素、表皮剥脱性毒素(ETs)、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)及杀白细胞素基因(PVL)的特点. 方法:应用PCR法检测肠毒素A、B、C、D、E基因,ETs A、B基因,TSST-1以及PVL. 结果:116株金黄色葡萄球菌中,85株为HA-SA,检出肠毒素A基因6株,肠毒素C基因1株,肠毒素D基因1株,PVL2株;31株为社区获得性金黄色葡萄球菌,检出肠毒素A基因1株,肠毒素B基因1株,肠毒素D基因1株,PVL7株;所有菌株均未检测到肠毒素E、ETs A、B和TSST-1基因. CA-SA PVL检出率显著高于HA-SA,两者比较差异有统计学意义(P＜0.005),而肠毒素、ETs和TSST-1基因检出率比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:金黄色葡萄球菌可分泌多种毒素,在分离金黄色葡萄球菌的同时,应注意其毒素检测.     

负载超抗原SEB/SEC的树突状细胞体外抗肝癌实验研究

目的　研究负载金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcalenterotoxinB ,SEB)和金黄色葡萄球菌肠毒素C(staphylococcalenterotoxinC ,SEC)的DC在体外对T细胞的活化能力及其对肝细胞癌HcaF细胞的杀伤作用。 方法　以SEB/SEC负载DC刺激T细胞 ,流式细胞仪 (flowcytometer ,FCM )检测T细胞受刺激后其早期活化标志CD69表达情况和IL 2水平 ,采用MTT法检测T细胞增殖水平和其对HcaF细胞的杀伤效应。结果　SEB/SEC联合DC在体外能明显激活T细胞 ,以浓度为 10 0ng/ml时作用最强 ;SEB/SEC联合DC可以使T细胞活化、增殖并大量分泌IL 2 ,对HcaF细胞的杀伤率高达 83 .2± 12 .8%。以SE作为刺激物负载的DC较以Tag作为刺激物负载的DC有更强的活化T细胞的能力 ;结论　根据以上结果 ,可以认为SEB/SEC联合DC具有很强的刺激T细胞活化的能力 ;其活化的T细胞具有很强的杀瘤作用 ,在肿瘤免疫治疗方面展现出良好的潜在应用前景。     

Effect and Mechanism of Superantigen Staphylococcal Enterotoxin Therapy for Mouse Gastric Tumor

Summary:The anti-tumor effect and mechanism of the staphylococcal enterotoxin A(SEA)werestudied.The mouse gastric tumor model was produced by subcutaneously inoculating gastric tumorcells(MGC80-3).The experimental group was treated with SEA,and the control group was treatedwith normal saline.The percentage of tumor generation and tumor mass was measured.The resultsshowed that the percentage of the tumor tumor generation in the SEA-treated mice was lower than in thecontrol group,but there was no significant difference(P>0.05).However,the tumor mass in theexperimental group was significantly lighter than in the control group,with the difference bing verysignificant(P<0.001).There were more CD_4~+ T cells and CD_8~+ T cells in the tumor of the micetreated with SEA than those of the control group.SEA has an obvious anti-tumor effect on mice gas-tric tumor.The mechanism might be that SEA induces the effect of superantigen-dependent cell me-diated cytotoxicity to the tumor cells.     

金黄色葡萄球菌肠毒素B对小鼠淋巴细胞产生肿瘤坏死因子-α的影响

目的　观察金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对淋巴细胞产生肿瘤坏死因子 (TNF)-α的影响。方法　密度梯度离心法获得鼠脾淋巴细胞 ,不同时间和浓度的SEB处理 ,流式细胞仪检测产生TNF -α的淋巴细胞阳性率。结果　TNF -α的产生在 5d和 10 0ng·ml-1时达到高峰。结论　SEB能有效刺激淋巴细胞产生TNF -α。     

妊娠母鼠静脉注射葡萄球菌肠毒素B对胎鼠胸腺发育的影响

目的: 观察妊娠母鼠静脉注射葡萄球菌肠毒素B (SEB)对胎鼠胸腺发育的影响。方法: 将孕鼠随机分为实验组及对照组,每组12只;实验组和对照组孕鼠在妊娠第16天分别尾静脉注射SEB 15 μg和等体积的生理盐水;于妊娠21天打开母鼠腹腔取出胎鼠,称量胎盘、胎鼠及其胸腺的湿重和干重;胎鼠胸腺细胞以抗CD4-APC及抗CD8-PE双标染色后用流式细胞仪检测T淋巴细胞各亚群。结果: 妊娠母鼠静脉注射SEB后可明显减少胎鼠胸腺的湿重和干重(P < 0.01),减少CD4-CD8+、CD4+CD8+T细胞(P < 0.01和P < 0.05),但明显增加CD4+CD8-T细胞(P < 0.01);胎鼠和胎盘的干、湿重与对照组差异均无统计学意义(P > 0.05)。结论: SEB可明显影响胎鼠胸腺的发育。     

ccr重组酶基因介导SCCmec基因岛的剪切功能研究

目的 构建携带ccrC和ccrAB重组酶基因的载体质粒,并导入耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中,验证ccrC重组酶具有把Ⅴ型SCCmec基因岛从细菌染色体上特异性剪切下来的功能.方法 以携带Ⅴ型SCCmee基因岛的菌株81/0342的染色体DNA为模板,应用PCR法扩增ccrC基因,再以携带Ⅱ型SCCmec基因岛的菌株N315的染色体DNA为模板,应用PCR法扩增ccrAB基因,分别克隆到温度敏感质粒pYT3上构建重组质粒pSRSC和pSR2AB,电穿孔技术交又导入原野生菌株81/0342和N315中构建6株细菌转化株,在适宜温度培育下充分表达质粒,应用PCR法检测SCCmec基因岛从染色体上脱落,并连续10 d传代培养细菌,应用影印实验检查细菌的药物敏感性变化.结果 ccrC重组酶基因的PCR扩增产物为1.9 kb,小于Ⅱ型SCCmec基因岛上携带的ccrAB重组酶基因.经鉴定证实成功构建了重组质粒pSR5C和pSR2AB,当菌株81/0342中导入重组质粒pSR5C和pSR2AB后,81/0342所携带的Ⅴ型SCCmec基因岛能从染色体上剪切下来,并以环状DNA结构存在于细菌中,而只有当N315中导入重组质粒pSR2AB时,N315所携带的Ⅱ型SCCmec基因岛才能脱落下来,SCCmec基因岛脱落的细菌成为对妥布霉素和头孢唑肟药物敏感的菌株.结论 ccrC重组酶与ccrAB一样具有特异性剪切酶的功能,可单独介导Ⅴ型SCCmec基因岛的脱落,从而为社区MRSA所携带的Ⅴ型SCCmec基因岛在金黄色葡萄球菌之间的广泛传播提供了实验依据.