制备脂质体包裹的99m锝标记c-myc mRNA反义寡聚核苷酸的研究

探讨脂质体包裹的 99m-锝标记 c- myc m RNA反义寡聚核苷酸的制备方法 ,为反义显像和反义治疗的实验研究奠定基础。合成 15 bp的反义寡聚核苷酸 (DNA)和双功能螯合剂 -联肼尼克酰胺衍生物 ,DNA与双功能螯合剂偶联后 ,用 99m锝标记 ,然后用 C1 8Sep- Pak反相柱进行纯化 ,根据纯化结果 ,绘制淋洗曲线 ,计算标记率。再用阳离子脂质体对纯化产物进行包裹 ,获得脂质体包裹的 99m锝 - DNA。用纸层析测定脂质体包裹的 99m锝 - DNA的放射性化学纯度及与水、血清孵育后的稳定性。结果 ,不同放射性活度的 99m Tc O4 - 标记时的标记率为 :14 80 MBq时为 6 3.37%± 3.5 1% ,74 0 MBq时为 6 2 .5 2 %± 3.6 9% ,5 92 MBq时为 5 9.82 %± 5 .12 % ,经 χ2检验无显著性差异。脂质体包裹 99m Tc- DNA的放射化学纯度 =96 .4 7%± 3.0 1% ,与水、血清孵育后脱落的 99m Tc极少 ,可见 99m Tc- DNA的稳定性极好。由此可见 ,以脂质体作载体 ,联肼尼克酰胺衍生物作为双功能螯合剂 ,可制备脂质体包裹的 99m锝标记的单链寡聚核苷酸     

空肠弯曲菌外膜蛋白亚单位疫苗的研制及免疫原性研究

目的 探索用脂质体包裹空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,CJ)Mr 28 000～31 000外膜蛋白制备安全、稳定、有效的CJ亚单位脂质体佐剂疫苗及其免疫原性、免疫剂量和途径.方法 采用薄膜-超声-冻融法制备阴离子脂质体(AL)、阳离子脂质体(CL)CJ疫苗后对其进行质量鉴定;用ELISA(间接法)检测经CJ疫苗免疫后的新西兰兔血清IgG抗体水平.结果 ①疫苗无菌试验及热原质试验均合格,均无明显不良反应;②阴、阳离子脂质体疫苗冻融前包裹率分别为32.1%、22.5%,冻融后分别是38.3%、28.4%;③CJ阴离子组比CJ阳离子组血清IgG的OD值显著增高(P<0.01),与CJ弗氏组无统计学差别(P0.1);CJ阴、阳离子组0.50 mg/kg的免疫剂量血清IgG的OD值最大;CJ阳离子皮下注射组与肌肉注射组IgG的OD值无统计学差别(P0.1);特异性IgG抗体经6个月动态观察,5个月后抗体效价下降.结论 ①采用薄膜-超声-冻融法制备CJ亚单位佐剂疫苗安全、稳定,冻融法可以提高脂质体疫苗包裹率;②同一剂量的阴离子脂质体疫苗血清抗体水平明显高于阳离子脂质体疫苗;③脂质体疫苗最佳接种剂量为0.50 mg/kg,肌肉注射与皮下注射免疫效果无显著差异;④较高水平的特异性抗体维持5个月,6个月后应加强免疫.     

用B7~ 瘤细胞诱导抗肿瘤CTL及其杀伤活性的测定

目的和方法 :研究利用脂质体转染的方法 ,将小鼠Ｂ7基因导入Ｃ57ＢＬ小鼠大肠癌细胞株ＣＭＴ93细胞 (弱免疫原性 )。用 80 0 μｇ/ｍＬ的Ｇ41 8筛选得到阳性克隆 ,免疫组织化学检测发现Ｂ7分子得到充分表达 ,主要以细胞膜染色为主 ,也有部分细胞浆着色。将 5× 1 0 6Ｂ7 ＣＭＴ93细胞接种于Ｃ57ＢＬ小鼠背部皮下 ,以相同细胞数的野生型瘤细胞接种为阴性对照。结果 :实验组小鼠 (ｎ =4)第 2周开始肿瘤的体积逐渐缩小 ,至第 4周末肿瘤全部消失 ,而对照组肿瘤呈进行性生长 (ｎ =3) ,至第 4周末肿瘤大小为 ( 1 7654± 0 4963)ｃｍ2 (长径×短…     

有机磷半抗原诱导的抗神经性毒剂单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备新化合物1-羟基—1—对胺基苯基甲磷酸单频哪基醇酯(P4)的单克隆抗体(mAb)。方法：以P4为半抗原，与血蓝蛋白(LPH)化学偶联制备人工抗原(P4—LPH)，并以其免疫BALB／c小鼠，制备抗P4的mAb。用竞争抑制酶免疫分析法，测定mAb对梭曼等7种配体的结合活性，结果以mAb与P4-BSA的结合被抑制50％时的配体浓度(IC50)，表示mAb的交叉反应性。结果：建立了9株对P4-BSA阳性反应的mAb，它们分属3种Ig亚类；6株(2B2、3A10、3D5、4F1、6C9和6H4)为IgGl，1株(3B9)为IgG2b，2株(1B3和6H5)为IgM。9株mAb中，8株具有与半抗原P4的结合的特异性。4株(1B3、2B2、3D5和4F1)具有梭曼结合活性，其IC50值分别为10^-3、10^-3、10^-5和10^-6mol/L；1株(4F1)具有与对氧磷结合的特异性，其IC50值为10^-5mol/L。4株腹水的mAb鼠滴度高，分别达10^-6(1B3和2B2)和10^-3(3D5和4F1)。结论：用新的半抗原P4成功地制得抗梭曼和抗对氧磷的mAb，可用于梭曼抗体酶、梭曼的免疫抗毒和免疫检测研究。     

不同方法制备脂质体125I-IL-8包封率的比较

本文用四种不同的方法制备脂质体,同时包裹^125I-IL-8。对不同方法制备的脂质体包裹^125I-IL-8的包封率进行对比。结果表明：机械分散法、钙融合法、反相蒸发法制备的脂质体对^125I-IL-8的包封率依次增大。而用反相蒸发法和钙融合法联合制备的脂质体对^125I-IL-8的包封率为最大。     

甘丙肽对GT1-7细胞GnRH释放的调节作用

目的：GT1-7细胞是替代研究GnRH神经元的理想细胞模型。本实验研究甘丙肽1型，2型受体mRNA在GT1-7细胞中的表达及对GnRH的调节作用。方法：（1）采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法观察甘丙肽受体mRNA在GT1-7中的表达；（2）将不同浓度的甘丙肽以不同时间与GT1-7细胞卵育，用RIA法测定细胞上清液中GnRH含量。结果：（1）GT1-7细胞同时表达甘丙肽1型和2型受体mRNA;(2)甘丙肽能刺激GnRH释放，且呈明显的量效关系。结论：甘丙肽可通过其受体直接作用下丘脑GnRH神经元，而对生殖功能起调节作用。     

G145R突变后HBsAg"a"决定簇合成肽的免疫学特性分析

目的研究G145R突变后乙肝表面抗原(HBsAg)"a"决定簇合成肽的免疫学特性改变情况. 方法首先合成2条短肽P1-wt和P2-145R,分别代表野毒株和G145R突变后HBsAg"a"决定簇合成肽.然后用β-巯基乙醇(2-ME)变性试验以及用乙肝疫苗标准品制备的小鼠多抗血清研究2条合成肽的空间构象以及抗原性异同.最后用等量合成肽免疫小鼠,用酶免疫法、竞争抑制试验和Western blot试验等研究G145R突变后"a"决定簇合成肽的免疫原性改变.结果合成肽P1-wt和P2-145R用2-ME温和变性后,PAGE结果表现为相对分子质量(Mr)为4×103左右的单一条带,而变性前2条合成肽均表现为Mr是从4×103到30×103的弥漫条带,主带位置在5×103和10×103,分别相当于二聚体和四聚体位置;用HBsAg的多克隆抗体(anti-HBs)检测合成肽的抗原性,结果在固定抗原量的前提下,在抗体1∶32 000稀释时仍可检测到P1-wt的阳性结果,而当同一抗体稀释到1∶8000时,P2-145R检测结果即为阴性.合成肽P2-145R免疫小鼠产生的抗体与P1-wt合成肽的反应滴度比与P2-145R合成肽本身的反应低4～8倍. 结论针对HBsAg"a"决定簇合成肽可自发形成一定的空间构象,G145R突变株的HBsAg"a"决定簇的抗原性和免疫原性与野毒株相比发生了明显改变,为正确评价G145R变异株的流行危害以及现行疫苗的保护效果提供了实验依据.     

分子识别理论在促甲状腺激素受体系统的应用

目的:观察促甲状腺激素受体(TSHR)分子上的特定片段-TR1(aa37-45)、TR2(aa353-366)和TR3(aa648-655)与其相应的反义肽- RT1(aa45-37)、 RT2(aa366-353) 和RT3(aa655-648)之间的选择性识别。方法:制备固相反义肽亲和层析柱-RT1-sepharose 4B, RT2-sepharose 4B和RT3-sepharose 4B,采用阶段洗脱法,观察相应天然肽- TR1、TR2 和TR3 在柱上的滞留行为。结果: TR1、TR2和 TR3与其相应的反义肽之间存在选择性识别,而反义肽RT1且能识别TSHR大分子; 此外, 牛促甲状腺激素(bTSH)蛋白还能被TR1识别。 结论:本实验证实了分子识别理论在促甲状腺激素受体系统的存在,它可能用于生物大分子蛋白质的分离、促甲状腺激素(TSH)与受体(TSHR)结合位点的测定,并用于实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠的实验性治疗。     

新型阳离子脂质体制备及其体外转基因特征

背景:阳离子脂质体及胶束、纳米粒等转基因载体是目前非病毒转基因载体领域研究热点;而目前市售转基因试剂盒价格昂贵,并且基本上都是进口商品,如果能够开发一种价廉,转基因效率高,具有自主知识产权的转基因试剂盒将展现广阔市场前景。目的:合成一种新型阳离子脂质复合物,并制备相应阳离子脂质体,对其体外转基因效率进行考察。方法:以1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺、胆固醇、丁二酸酐为原料合成阳离子脂质复合物,采用薄层色谱、红外光谱等方法对产物进行结构表征。然后用薄膜分散法,将适当比例的二油酰磷脂酰乙醇胺和阳离子脂质复合物混合制备成阳离子脂质体,并用其包封含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFPC1,对人宫颈癌Hela细胞株进行体外转染。结果与结论:通过两步法合成了一种全新的阳离子脂质复合物——胆固醇-丁二酸酯-1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺,薄层色谱及红外光谱结果表明合成了预期产物。薄膜分散法制得阳离子脂质体,其中以这种阳离子脂质复合物和二油酰磷脂酰乙醇胺摩尔比为1:1左右所制备的脂质体颗粒较为均匀、细小,形态基本呈圆形。体外对质粒包裹实验结果表明,阳离子脂质体与质粒比为5:3,可完全包封质粒。用该阳离子脂质体对Hela细胞进行转染,24h后,瞬时转染效率达35.6%。从初步实验结果看,所合成的阳离子脂质复合物结构总体与市售阳性成分结构类似,合成方法简单、廉价,体外对质粒DNA有很好包裹性能,细胞毒性低,然而体外对Hela细胞的转染效率还明显偏低。     

包裹天然骨架CpG ODN和HBsAg的非磷脂脂质体疫苗的免疫效果

非磷脂脂质体NovasomeR○(Np )是由Brij5 2、胆固醇和油酸组成 ,可作为同时传递佐剂和抗原的载体。我们将HBsAg与天然骨架CpGODN (phosphodiesterCpGODN ,pdCpGODN )包裹于Np后免疫BALB/c小鼠 ,检测其免疫效果。结果显示 ,包裹pdCpGODN和HBsAg的Np在小鼠中诱导了很高滴度的抗 HBs抗体产生并诱生了HBsAgS2 8 3 9特异性的CTL ,而铝佐剂组和仅包裹HBsAg的Np组诱生的抗体滴度较低 ,未检测到CTL活力。抗体亚类分析结果表明包裹pdCpGODN和HBsAg的Np诱生的免疫应答类型与pdCpGODN剂量有关 ,较低剂量 (2 4 μgpdCpGODN )诱生的为IgG2a为主的Th1型应答 ,而较高剂量(4 7μgpdCpGODN )诱生的是Th1/Th2混合型应答。铝佐剂和仅包裹HBsAg的Np组诱生的是以IgG1为主的Th2型应答。此外 ,包裹pdCpGODN和HBsAg的Np免疫小鼠脾淋巴细胞在体外HBsAg刺激培养后特异性增殖并分泌高水平的IFN γ。这些结果表明包裹pdCpGODN和HBsAg的Np能增强HBsAg的免疫原性 ,诱生体液 /细胞免疫均衡应答 ,有可能发展为慢性乙肝的治疗性疫苗