接受骨髓单个核细胞移植慢性肾损伤大鼠肾脏转化生长因子β1和结缔组织生长因子的表达

背景：近年来干细胞移植在肾脏病领域取得了一定进展，但多局限于急性肾损伤，涉及慢性肾损伤方面的报道较少，且肾脏保护机制不清楚。 目的：观察同种异体骨髓单个核细胞移植后慢性肾损伤大鼠尿蛋白排泄、肾功能的变化，以及对肾组织转化生长因子β1和结缔组织生长因子表达的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2008-05/10在解放军沈阳军区总医院动物实验中心完成。 材料：健康SPF级雌性SD大鼠30只，随机分为3组：正常对照组、模型组、细胞移植组，10只/组。另取雄性SD大鼠10只用于骨髓单个核细胞的制备。 方法：模型组、细胞移植组大鼠采用改良肾脏5/6切除术建立慢性肾损伤模型，造模成功后10周，细胞移植组大鼠心脏内注射骨髓单个核细胞悬液1.0 mL，细胞数1×108个/只，治疗4周；模型组心脏内注射等量生理盐水。 主要观察指标：24 h尿蛋白定量及肾功能变化，肾组织病理学变化，肾组织转化生长因子β1及结缔组织生长因子蛋白的表达。 结果：①与正常对照组比较，模型组、细胞移植组大鼠尿蛋白排泄量及血清尿素、肌酐浓度均显著升高(P < 0.01)，但细胞移植组升高幅度明显低于模型组(P < 0.01或P < 0.05)。②苏木精-伊红染色及PAS染色后，与模型组比较，细胞移植组肾小球基质相对面积、肾小球硬化指数均明显减小(P < 0.05)。③与正常对照组比较，模型组、细胞移植组转化生长因子β1及结缔组织生长因子的表达均显著增强(P < 0.01)，但细胞移植组增强幅度显著低于模型组(P < 0.01)。 结论：同种异体大鼠骨髓单个核细胞移植可以减少肾大部切除慢性肾损伤大鼠尿蛋白排泄，降低血清肌酐水平，抑制肾组织转化生长因子β1和结缔组织生长因子表达，减轻肾组织病理改变，起到肾脏保护用。     

高糖状态下小鼠肾小球足细胞凋亡和组成型光形态建成1蛋白的表达

背景：组成型光形态建成1蛋白与细胞凋亡有关。 目的：观察高糖对体外培养的小鼠肾小球足细胞凋亡和组成型光形态建成1蛋白表达的影响。 方法：将不同浓度葡萄糖溶液分别加入体外培养的条件永生性小鼠肾小球足细胞株培养液中，培养不同时间后检测肾小球足细胞凋亡指数和死亡指数，以筛选最佳剂量效应葡萄糖浓度。用30 mmol/L葡萄糖溶液干预小鼠肾小球足细胞(高糖组)，并设立对照组和采用30 mmol/L甘露醇干预的甘露醇组。 结果与结论：在一定浓度范围内，葡萄糖呈时间和剂量依赖性诱导肾小球足细胞凋亡和死亡(P < 0.05)，随着葡萄糖浓度的进一步加大，肾小球足细胞死亡指数明显升高，而凋亡指数变化不大。与对照组比较，高糖组凋亡指数显著增加(P < 0.05)，其COP1 mRNA及蛋白表达水平均明显下降(P < 0.05)。 结果证实，高糖可诱导肾小球足细胞的凋亡，其机制可能与其下调COP1的表达有关。     

单侧输尿管梗阻模型大鼠肾间质纤维化过程中血小板衍生生长因子D的表达

背景：血小板衍生生长因子在肾间质中通过诱导肾小管间质细胞增生、表型转化、炎性细胞浸润等导致肾小管间质纤维化。 目的：观察血小板衍生生长因子D在单侧输尿管梗阻模型大鼠肾脏组织中的表达水平及随时间的演变情况。 方法：将成年健康雄性SD大鼠60只随机分为模型组及假手术组,将模型组大鼠左侧输尿管结扎剪断建立单侧输尿管梗阻模型,假手术组大鼠不结扎剪断仅游离左侧输尿管。术后3,7,14,21,28 d,通过免疫组化检测血小板衍生生长因子D在肾脏组织中的表达分布情况,实时荧光定量RT-PCR方法检测血小板衍生生长因子D mRNA的表达水平及变化。 结果与结论：假手术组血小板衍生生长因子D仅少量表达于肾小球系膜细胞及血管平滑肌细胞,而在模型组,血小板衍生生长因子D同时表达于肾间质纤维化区域,随纤维化程度加重,表达增多。同时模型组血小板衍生生长因子D mRNA表达量较假手术组显著增多(P < 0.05),且表达随时间延长逐渐增多。提示血小板衍生生长因子D在单侧输尿管梗阻模型肾间质纤维化过程中发挥着促纤维化的重要意义。     

结缔组织生长因子及其胶原在硬皮病组织中的表达

背景：近年来，大量文献报道结缔组织生长因子作为转化生长因子β的下游效应因子，是最重要的致纤维化生长因子，在多种纤维化疾病中高表达。 目的：观察结缔组织生长因子在硬皮病组织中的表达情况及与其上、下游效应基因表达的关系，探讨结缔组织生长因子在硬皮病组织中的促纤维化机制。 设计、时间及地点：对照观察实验，于2008-05/11在解放军广州军区广州总医院医学实验科完成。 材料：组织标本均来源于解放军广州军区广州总医院整形外科患者，正常皮肤来自整形手术中切除的多余皮肤。 方法：收集硬皮病皮肤组织、增生性瘢痕组织及正常皮肤组织标本，免疫组化检测结缔组织生长因子的表达，反转录-聚合酶链式反应方法检测结缔组织生长因子、转化生长因子β1、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA表达，Western blotting检测结缔组织生长因子蛋白的表达。 主要观察指标：①结缔组织生长因子蛋白在硬皮病皮肤组织中的表达和定位情况。②结缔组织生长因子、转化生长因子β1、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的相对表达量。③比较增生性瘢痕、硬皮病和正常皮肤组织中结缔组织生长因子蛋白表达量的情况。 结果：免疫组织化学染色发现，结缔组织生长因子在基底细胞和角质形成细胞中有强阳性表达，在真皮成纤维细胞中亦有阳性表达。硬皮病皮肤组织及增生性瘢痕组织中结缔组织生长因子、转化生长因子β1、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA过表达，而正常皮肤组织无或仅有极弱表达。Western blotting结果显示硬皮病皮肤组织有明显的结缔组织生长因子蛋白表达带。 结论：在硬皮病纤维化过程中，结缔组织生长因子可能是重要的调控因子之一，结缔组织生长因子可能与转化生长因子β1协同作用促进细胞外基质合成。     

人肾小球系膜细胞原代培养方法的改进

背景：肾小球系膜细胞原代培养成功率低,生存时间短,传代次数少。其中分离提取肾小球一直是培养高纯肾小球系膜细胞的最大瓶颈。 目的：建立一种操作简单、成功率高、重复性好的人肾小球系膜细胞原代培养方法。 方法：取自愿水囊引产的胎儿肾,采用肾皮质组织块法合优生选择法培养人肾小球系膜细胞。相差显微镜、透射电镜观察系膜细胞形态,免疫荧光技术鉴定细胞表型,激光共聚焦显微镜观察波形蛋白的表达。 结果与结论：培养的肾小球系膜细胞呈梭形/不规则星形和细长形,胞质中各种细胞器丰富,细胞突起明显,胞膜上有很多微绒毛,细胞表达α-肌动蛋白、肌球蛋白、波形蛋白、结蛋白,而不表达细胞角蛋白、Ⅷ因子,激光共聚焦显微镜下发现系膜细胞波形蛋白表达阳性并具有特征性纤维束。说明培养的系膜细胞符合肾小球系膜细胞的生物学特征。肾皮质组织块法合优生选择法是一种简单、高效的培养人肾小球系膜细胞的方法。     

无血清培养肾癌干细胞及其鉴定

背景：肿瘤干细胞理论的产生,对肿瘤的发生、发展及其发病机制有了更新的认识,为肿瘤研究提供了新的方向,通过无血清培养技术已从许多肿瘤中分离并鉴定出特定的肿瘤干细胞。目前,无血清培养已成为培养肿瘤干细胞的经典培养方法。 目的：运用无血清培养的方法从肾癌细胞中获取肾癌干细胞,并进行鉴定。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-02/2009-02在江苏大学完成。 材料：肾癌细胞株OS-RC-2由上海中科院细胞库提供。 方法：取处于对数生长期的肾癌细胞OS-RC-2,悬浮于预先配好的DMEM/F12无血清培养基中(含表皮生长因子20 μg/L,碱性成纤维细胞生长因子20 μg/L),观察生长情况,培养7 d后运用流式细胞仪测定CD133及CD34的表达。以不含细胞因子的高糖DMEM/F12培养液培养细胞作为阴性对照。另外收集无血清培养7 d的肾癌细胞球,重悬于含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM/F12培养基中,进行干细胞分化实验观察。 主要观察指标：①倒置显微镜下观察肾癌干细胞生长情况。②流式细胞仪检测肾癌干细胞及肾癌细胞中CD133及CD34的表达。③收集无血清培养7 d后的肾癌干细胞重新常规培养并观察其分化情况。 结果：①肾癌细胞接种于含细胞因子的无血清培养基2 d后可见有细胞球生成,7 d后细胞球明显增多,体积增大。对照组肾癌细胞则贴壁生长,未见细胞球生成。②流式细胞仪检测显示,肾癌细胞球中CD133+CD34-表达率(8.33±1.26)%,对照组肾癌细胞表达率(1.24±0.36)%(t =-19.71,P < 0.05)。③肾癌细胞球重新悬浮于含体积分数为10%胎牛血清的培养液2 d后可见细胞球分散为单个细胞,恢复原来贴壁生长特点,CD133及CD34表达与阴性对照相同。 结论：利用含细胞因子表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子无血清培养的方法可以从肾癌细胞中获取肾癌干细胞。     

高糖对心肌微血管内皮细胞表达神经调节蛋白1的影响

背景：糖尿病心肌病的发病机制尚不清楚,神经调节蛋白1具有促进血管再生等作用,糖尿病心肌病的发病是否和心肌微血管内皮细胞表达神经调节蛋白1下降有关值得进一步研究。 目的：观察高糖对心肌微血管内皮细胞表达神经调节蛋白1的影响。 方法：取生长良好的第2代心肌微血管内皮细胞,高糖组加入10 mmol/L的葡萄糖,高糖+胰岛素组加入10 mmol/L的葡萄糖及10-5 U/L的胰岛素,对照组正常培养。培养24 h后收集细胞,RT-PCR及Western blot方法检测神经调节蛋白1 mRNA和蛋白的表达。 结果与结论：与对照组比较,高糖组心肌微血管内皮细胞神经调节蛋白1 mRNA和蛋白的表达明显下降(P < 0.05);与高糖组比较,高糖+胰岛素组心肌微血管内皮细胞神经调节蛋白1 mRNA和蛋白的表达明显升高(P < 0.05),与对照组间差异无显著性意义(P > 0.05)。说明高糖可抑制心肌微血管内皮细胞表达神经调节蛋白1 mRNA和蛋白,而胰岛素可拮抗此作用。     

小鼠结缔组织生长因子基因克隆及其真核表达载体构建

背景：研究证实结缔组织生长因子在动脉粥样硬化血管平滑肌中呈高表达,构建结缔组织生长因子真核表达载体以特异性上调结缔组织生长因子在血管平滑肌内的表达是进一步通过细胞及动物实验研究其作用机制的基础。 目的：克隆小鼠结缔组织生长因子基因、构建其真核表达载体,并在血管平滑肌细胞中瞬时表达。 设计、时间及地点：单一样本观察,实验于2007-09/2008-04在辽宁医学院省高校分子细胞生物学与新药开发重点实验室完成。 材料：1个月龄昆明小鼠10只。真核表达载体pcDNA3.1(+)由辽宁医学院分子生物学实验室保存。 方法：以小鼠肾脏总RNA为模板,通过反转录-聚合酶链反应方法获得结缔组织生长因子(CTGF)目的基因,连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定测序,克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体。 主要观察指标：酶切测序鉴定重组体pcDNA3.1(+)-CTGF。将pcDNA3.1(+)-CTGF转入血管平滑肌细胞,Western观察结缔组织生长因子蛋白表达。 结果：酶切、测序鉴定证实成功扩增出小鼠结缔组织生长因子目的基因并构建其真核表达载体,Western检测证实,重组体转入血管平滑肌细胞后,细胞内高表达结缔组织生长因子蛋白。 结论：成功克隆小鼠结缔组织生长因子目的基因并构建其真核表达载体,重组体能在血管平滑肌中表达。     

炒麦芽含药血清对MMQ大鼠垂体瘤细胞NGF、PRL分泌的影响

目的了解炒麦芽含药血清对体外培养的MMQ大鼠垂体瘤细胞神经生长因子（NGF）、催乳素（PRL）分泌表达的影响。方法应用血清药理学的方法，以不同剂量、15％给药比例的家兔炒麦芽含药血清和阳性对照药物溴隐停含药血清及正常血清对体外培养的MMQ大鼠垂体瘤细胞进行干预，连续检测4d，以放射免疫法检测细胞培养液上清中NGF和PRL分泌量，并对实验结果进行统计分析。结果炒麦芽各剂量含药血清组、溴隐停组与空白对照组相比培养液中NGF和PRL含量具有显著性差异（P〈0．05），其中，正常血清组和空白对照组之间无统计学意义（P〉0．05）。随炒麦芽含药血清剂量的增加，MMQ垂体瘤细胞NGF分泌量逐渐升高，并伴随着PRL分泌量逐渐下降，炒麦芽剂量、NGF、PRL分泌量三者间呈显著相关（P〈0．05）；阳性对照药物溴隐停含药血清对NGF和PRL的分泌均具有抑制作用（P〈0．01）。结论低剂量炒麦芽促进PRL分泌和高剂量炒麦芽抑制PRL分泌的双向调控机制可能是通过影响NGF分泌实现的．溴隐停抑制PRL激素分泌的原因可能与NGF分泌无关。     

再生丝素膜对Ad-VEGF165转基因成纤维细胞基因表达的影响

背景：前期实验已证实再生丝素膜可促进pcDNA3.0-VEGF165转染的L929细胞表达血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)。 目的：进一步观察再生丝素膜对经腺病毒介导的人VEGF (Ad-VEGF165)转基因成纤维细胞基因转录表达的影响。 设计、时间及地点：对比观察细胞基因工程实验，于2007-11/2008-04在苏州大学细胞与分子生物实验室完成。 材料：再生丝素膜由苏州大学材料工程学院李明忠教授提供。 方法：将Ad-VEGF165腺病毒感染培养在再生丝素膜、聚氯乙烯膜及聚乙烯膜上的QBI-293A人胚肾和WI-38人胚肺成纤维细胞，以空载体Ad-GFP腺病毒和未接种病毒的PBS组为对照。 主要观察指标：通过实时定量RT-PCR法检测不同材料对成纤维细胞VEGF mRNA转录的影响；ELISA法检测其对VEGF、血管生成素1、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子表达的影响。 结果：再生丝素膜组成纤维细胞VEGF mRNA呈高水平表达，但聚氯乙烯膜组转录水平明显下降(P < 0.05)。再生丝素膜组Ad-VEGF165转基因293A细胞及WI-38细胞不仅目的基因VEGF细胞因子的分泌呈高水平表达，并可促使血管生成素1基因表达水平明显提高(P < 0.05)，而且再生丝素膜还可使成纤维细胞自身分泌的碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子呈现正常表达水平。 结论：再生丝素膜不仅利于VEGF目的基因在成纤维细胞中呈现高效表达，并促进血管生成素1基因的表达，而且能维持成纤维细胞自身分泌的与组织损伤修复相关基因碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子的正常表达。     

视频脑电图在小儿癫痫诊断中的应用

目的评价视频脑电图(video-EEG)在小儿癫诊断中的应用价值。方法对126例具有发作性症状的患儿进行连续8h的包括清醒、睡眠、诱发试验及必要的认知测验的视频脑电图监测。结果经发作期视频脑电图证实,39例初诊为癫性发作的患儿中14例(35%)为非癫性发作;15例其他症状发作中13例(86%)为非癫性发作。64例样放电患儿中51例(80%)确定发作类型,22例(34%)确定癫类型。视频脑电图可发现短暂轻微的癫发作及样放电引起的一过性认知损伤。结论视频脑电图在排除非癫性发作、确定癫性发作的类型、评价脑电-临床关系方面可提供准确可靠的证据,进一步提高癫的临床诊断水平。     

Role of glutathione in repair of free radical damage in hippocampus in vitro.

Depletion of glutathione (GSH), an intrinsic antioxidant, increases vulnerability to free radical damage in a number of cell systems. This study investigates the role of GSH in limiting electrophysiological damage and/or recovery from free radical exposure in slices of guinea pig hippocampus. Synaptic potentials (PSPs) and population spikes (PSs) were recorded from field CA1. Free radicals were generated from 0.006% peroxide through the Fenton reaction. Analysis of the input-output curves showed that peroxide treatment decreased PSPs and impaired ability of the PSPs to generate PSs as previously reported. Recovery was nearly total within a half hour. Treatment with 5 mM buthionine sulfoximine (BSO) for 2 h depleted hippocampal GSH to 79.2% of control values. The extent of free radical damage was not increased. Recovery, however, was only partial. GSH was further depleted by oxidation with diamide or covalent bonding with dimethyl fumarate (DMF) immediately before and during the peroxide treatment. Neither diamide nor DMF treatment in BSO-incubated tissue enhanced peroxide-induced electrophysiological deficits. Following these treatments, however, tissue showed little recovery from free radical damage. We conclude that glutathione is essential for repair processes in hippocampal neurons exposed to oxidative damage.     

Neuroprotective properties of memantine in different in vitro and in vivo models of excitotoxicity

The pathogenesis of stroke, trauma and chronic degenerative diseases, such as Alzheimer's disease (AD), has been linked to excitotoxic processes due to inappropriate stimulation of the N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA-R). Attempts to use potent competitive NMDA-R antagonists as neuroprotectants have shown serious side-effects in patients. As an alternative approach, we were interested in the anti-excitotoxic properties of memantine, a well-tolerated low affinity uncompetitive NMDA-R antagonist presently used as an anti-dementia agent. We explored in a series of models of increasing complexity, whether this voltage-dependent channel blocker had neuroprotective properties at clinically relevant concentrations. As expected, memantine protected neurons in organotypic hippocampal slices or dissociated cultures from direct NMDA-induced excitotoxicity. However, low concentrations of memantine were also effective in neuronal (cortical neurons and cerebellar granule cells) stress models dependent on endogenous glutamate stimulation and mitochondrial stress, i.e. exposure to hypoxia, the mitochondrial toxin 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) or a nitric oxide (NO) donor. Furthermore, memantine reduced lethality and brain damage in vivo in a model of neonatal hypoxia-ischemia (HI). Finally, we investigated functional rescue (neuronal capacity to migrate along radial glia) by memantine in cerebellar microexplant cultures exposed to the indirect excitotoxin 3-nitropropionic acid (3-NP). Potent NMDA-R antagonists, such as (+)MK-801, are known to block neuronal migration in microexplant cultures. Interestingly, memantine significantly restored the number of neurons able to migrate out of the stressed microexplants. These findings suggest that inhibition of the NMDA-R by memantine is sufficient to block excitotoxicity, while still allowing some degree of signalling.     

Storage of lipofuscin in neurons in mucopolysaccharidosis

Summary A histochemical and ultrastructural study was made on the brain of a 23-year-old man with Sanfilippo's syndrome. In accordance with previous reports the cortical nerve cells contained a PAS-positive lipid storage substance. This showed intense autofluorescence in UV-light and was positive with various stains for lipofuscin. The storage material appeared ultrastructurally as inclusion bodies composed of short lamellated membranes, granular material, and vacuoles. In addition, concentrically and transversely lamellated membranous cytoplasmic bodies were observed in the nerve cells. It is concluded that the PAS-positive lipid storage material in the neurons was composed partly of lipofuscin in addition to other lipids presumably glycosphingolipids.Supported by a grant from the Expressen Prenatal Research Foundation