肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞异体移植修复烧伤创面

背景：经携带人肝细胞生长因子的重组腺病毒（adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor，Ad—HGF）修饰的骨髓间充质干细胞创面移植后，可分化为“修复细胞”，并能够在创面持续释放肝细胞生长因子。目的：观察Ad—HGF基因转染的骨髓间充质干细胞异体移植对大鼠烧伤创面愈合的影响。设计、时间及地点：随机对照动物观察，于2006—02／2007—03在解放军兰州军区兰州总医院临床实验科和烧伤整形科实验室完成，材料：Wistar大鼠40只，由解放军兰州军区兰州总医院动物实验科提供。Ad—HGF与携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒（adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor，Ad-GFP）颗粒均由哈小琴博士惠赠。方法：取雄鼠10只，Percoll密度梯度离心法体外分离培养骨髓间充质干细胞，并行Ad—HGF转染。取雌鼠30只，随机分为未转染细胞组、Ad-HGF转染细胞组、Ad-GFP转染绌胞组、Ad-HGF对照组、假伤组，6只／组。前4组大鼠复制背部深Ⅱ度烧伤模型，并分别于创面真皮层下方多点注射对应的细胞悬液或病毒悬液1mL；假伤组大鼠背部剃毛后浸入37℃温水12S模拟烧伤，同法注射等量生理盐水。主要观察指标：对采集的创面标本行组织学观察和羟脯氨酸含量测定，采用免疫组化分析创面肝细胞生长因子的表达。结果：苏木精-伊红染色结果显示，Ad—HGF转染细胞组移植后7d创面表皮化优于其他组，至21d再生表皮明显厚于其他组，并可见真皮钉脚下伸。胶原特殊染色结果显示，Ad—HGF转染细胞组移植后7，21d创面中的胶原排列较其他组整齐。移植后7d，Ad—HGF转染细胞组羟脯氨酸含量显著低于其他组（F=3．216，P〈0．01）。移植后21d，Ad—HGF转染细胞组愈合创面中肝细胞生长因子的阳性表达位于真皮层，表达强度明显强于其他组。结论：Ad-HGF基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞异体移植后，对烧伤创而愈合存在一定的促进作用。     

骨髓间充质干细胞与急性皮肤放射损伤的修复

背景:皮肤放射性损伤难治愈易复发常成为临床上难以解决的问题.随着干细胞丁程与组织学工程的进展,骨髓间充质干细胞实际应用研究日益受到重视,特别是其多向分化的潜能,显示了在创伤修复领域诱人的应用前景.目的:观察骨髓间充质干细胞对皮肤局部急性放射损伤的修复作用.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-06/08在苏州大学附属第二医院血液病实验室完成.材料:雄性昆明小鼠46只,体质量(25+2)g,其中40只用于建立皮肤局部Ⅲ度放射损伤模型.方法:随机选取40只小鼠以3.6%水合氯醛腹腔麻醉,以能量为4 MeV的电子线(1 Gy/min)照射小鼠臀部皮肤,面积为2.0 cm×1.5 cm,总吸收剂量为40 Gy,后将小鼠随机分为实验组和对照组,每组20只.实验组照射后即刻经尾静脉注射经CFDA SE标记的骨髓间充质干细胞注射液0.1 mL(浓度为2×1010 L-1),对照组注射等量生理盐水,剩余6只不做照射处理,仅经尾静脉注射等量骨髓间充质干细胞.主要观察指标:实验组与对照组小鼠创面损伤情况及照射后2,3周皮肤病理变化,免疫组织化学分析皮肤新生血管;观察不同时间骨髓间充质干细胞在实验组小鼠皮肤及其他组织的分布情况.结果:将骨髓间充质干细胞经尾静脉移植入实验组小鼠后,实验组皮肤创面愈合速度比对照组快4～6 d.实验组创面损伤面积较对照组小,病理表现中表皮、毛囊、皮脂腺及胶原纤维的损伤程度均较同时期的对照组小鼠轻.皮肤创面中的新生毛细血管数高于对照组.实验组骨髓间充质干细胞在皮肤及其他组织中广泛分布且数量明显高于未照射的小鼠.结论:骨髓间充质干细胞对局部皮肤放射损伤创面有明显有效的修复作用,其作用是在干细胞与创伤局部微环境相互作用下实现的.     

大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景:提供肝细胞生长因子的微环境可体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞。目的:实验拟验证并简化成年大鼠骨髓间充质干细胞体外向肝细胞的诱导分化。设计、时间及地点:观察实验,于2006-10/2008-05在北华大学完成。材料:实验动物为成年SD大鼠,雌雄不限,体质量180~230g。方法:采用Percoll梯度离心方法获取骨髓间充质干细胞,调整细胞密度为1×108L-1,加入含有20μg/L肝细胞生长因子培养液培养,定期更换培养液。主要观察指标:流式细胞仪检测细胞表面标志和碱性磷酸酶染色鉴定细胞类型。倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。培养的1,3,7,14,21,28d以细胞免疫组织化学检测细胞甲胎蛋白、细胞角蛋白18和清蛋白的表达。结果:接种后,细胞体积增大,形态多样贴壁细胞分化为体积较大的多角形和部分梭形,胞浆丰富,可见多核,接种早期细胞生长比接种晚期生长较快。分离纯化的SD大鼠骨髓间充质干细胞的表面标志为CD29 ,CD44 ,CD34-,CD45-和CD90 ,细胞的碱性磷酸酶染色阴性,细胞纯度达98%以上。骨髓间充质干细胞的甲胎蛋白细胞免疫组织化学染色培养第7天即出现阳性,第14天清蛋白和细胞角蛋白18免疫组织化学染色阳性。结论:成年大鼠骨髓间充质干细胞在20μg/L肝细胞生长因子的诱导下,可分化为肝细胞。     

转染血管内皮生长因子基因的骨髓间充质干细胞修复糖尿病大鼠足背创面

背景：糖尿病足溃疡严重威胁患者的健康甚至生命,其治疗仍是国际性难题,目前缺乏良好有效的治疗手段,而基因疗法和干细胞疗法在创伤修复领域展现出独特的优势和潜力。目的：探索转染人血管内皮生长因子165（human vascular endothelial growth factor 165, hVEGF165）基因的骨髓间充质干细胞对大鼠糖尿病足背创面的治疗效果。方法：体外构建hVEGF165基因的腺病毒表达载体,转染第3代大鼠骨髓间充质干细胞;将120只雄性Wistar大鼠分成正常溃疡对照组、模型组、基因治疗组、干细胞治疗组和基因转染干细胞治疗组。后4组大鼠经腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病,在所有大鼠的后足背切取一3 mm×7 mm矩形全层皮肤制成足背创面模型。各组大鼠均在足背创缘皮下分点注射移植,距创缘5 mm处、等距6点,正常溃疡对照组和模型组各点均注射50μL的PBS,基因治疗组各点注射50μL的腺病毒悬液（1×1013 pfu/L）,干细胞治疗组各点注射50μL的干细胞悬液（1×1010 L-1）,基因转染干细胞治疗组各点注射50μL的病毒转染后的干细胞悬液（1×1010 L-1）。结果与结论：与模型组、基因治疗组、干细胞治疗组相比,基因转染干细胞治疗组大鼠创面愈合率、血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达水平、局部毛细血管数量均有显著提高（P〈0.05）,但较正常溃疡对照组差（P〈0.05）。说明 hVEGF165基因联合骨髓间充质干细胞疗法能够促进大鼠糖尿病足背创面的愈合,其主要机制为促进局部血管的生成及血管内皮生长因子的表达。     

重组腺病毒介导的肝细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞

背景:肝细胞生长因子可促进血管内皮细胞增生及新生血管形成,已广泛应用于病理性瘢痕、心肌缺血等的实验性治疗.目的:鉴于重组腺病毒的宿主范围广,探讨重组腺病毒介导的入肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞转染效率、日的蛋白表达及细胞活性的影响.设计、时间及地点:2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院完成的细胞对比实验.材料:清洁级2月龄Wistar大鼠25只用于制备骨髓间充质干细胞.携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒毒株、重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子由解放军兰州军区兰州总医院博士后科研工作站哈小琴博士惠赠.方法:向体外培养至第3代的骨髓间充质干细胞中加入含地塞米松、IBMX、牛胰岛素、吲哚美辛、胎牛血清的L-DMEM进行成脂诱导.以不同感染强度的携带绿色荧光蛋白基因重组腺病毒转染诱导后的脂肪细胞.重组腺病毒介导人肝细胞生长因子以最佳感染强度转染诱导后的脂肪细胞.主要观察指标:油红O染色检测成脂情况.流式细胞仪计数绿色荧光蛋白阳性表达,计算转染效率.EUSA法检测转染上清中肝细胞生长因子的表达,MTT法检测转染脂肪细胞的活性.结果:①骨髓间充质干细胞成脂诱导后胞质内富含橙红色的脂滴,成脂率(97.31±0.46)%.②以100 pfu/cell携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒转染脂肪细胞72 h后,绿色荧光蛋白表达量达高峰,此时转染效率为65.39%.③以100 pfu/cell作为最佳感染强度转染脂肪绌胞72 h后,肝细胞生长因子的表达量为峰值.与未转染空白对照比较,转染后24,48,72,96,168 h脂肪细胞活性均无明显变化(t=0.024～0.092,P>0.05).结论:重组腺病毒可介导肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞,有效表达目的蛋白,且转染该基因对脂肪细胞的活性无影响.     

构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景:超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因.目的:构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率.设计、时间及地点:细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供.携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存.腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司.方法:质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;1-Ceu Ⅰ+1-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率.结果:构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp(pshutIle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用Xho Ⅰ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×10~(11) PFU/mL.成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%.结论:实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞.     

腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死

背景：骨髓间充质干细胞可以分化为心肌细胞,促进血管再生,但在移植早期其自身分泌的细胞因子不足以维持良好的分化和再生。目的：验证腺病毒介导的肝细胞生长因子和血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植对新西兰兔梗死心肌组织的修复重建和血管再生的影响。方法：腺病毒介导肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染BrdU标记的新西兰兔骨髓间充质干细胞。取新西兰兔50只建立急性心肌梗死模型,4周后随机分为5组,分别于梗死心肌内注射：①骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子。②骨髓间充质干细胞/Ad.肝细胞生长因子。③骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子。④骨髓间充质干细胞。⑤对照组注射等量无血清IMDM培养液。移植4周后观察移植细胞的分化和新生血管的形成,并通过超声多普勒检测心功能变化。结果与结论：除对照组外,其余4组兔心功能都较移植前有明显改善（P〈0.05）,其中移植双基因转染骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组兔的心功能改善程度要明显高于其他3组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞,参与构成了梗死区域的新生毛细血管。与对照组比较,其余4组都有明显的血管新生（P〈0.05）,而以骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组最显著。提示肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植于梗死心肌可以促进心肌再生和新生血管的形成,明显改善心功能。     

白细胞介素12重组腺病毒质粒转染骨髓间充质干细胞

背景:有研究表明,骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达,且具有较弱的免疫抗原性和免疫调节功能,强大的迁移力和趋瘤性,因而逐渐显露其具有作为抗肿瘤基因治疗负载体系的优越性.目的:拟应用白细胞介素12重组腺病毒质粒AdEasy-R细胞介素12转染骨髓间充质干细胞,构建表达外源性白细胞介素12的骨髓间充质干细胞.设计、时间及地点:以细胞为对象的开放性实验,于2008-06在辽宁医学院实验中心及中国医科大学实验中心完成.材料:原代骨髓间充质干细胞由辽宁医学院外科学实验室构建,白细胞介素12重组腺病毒载体AdlL-12由辽宁医学院分子生物学实验室构建.方法:分离培养SD大鼠骨髓间允质干细胞,免疫组织化学及流式细胞技术鉴定细胞表面标志物,应用腺病毒介导白细胞介素12基因转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:以反转录聚合酶链反应及Western Blotting技术检测转染后的骨髓间充质干细胞的白细胞介素12基因mRNA及蛋白表达. 结果:腺病毒介导白细胞介素12基因转染骨髓间充质干细胞后,通过反转录-聚合酶链反应及Westem Blotting技术检测,结果证实白细胞介素12基因在mRNA及蛋白水平均有表达,而未经转染的骨髓间充质干细胞内无白细胞介素12基因及蛋白表达.结论:应用白细胞介素12重组腺病毒质粒成功构建了在mRNA及蛋白水平表达外源性白细胞介素12基因的骨髓间充质干细胞.     

肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

骨髓间充质干细胞的增殖、分化及迁移等生物学特性受骨髓微环境的调节.肝细胞生长因子（HGF）是骨髓微环境分泌的主要因子之一,但它对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响并不清楚.本研究目的是观察重组人HGF对骨髓MSC生物学特性的影响.用免疫组织化学方法检测c-Met的表达,用MTT法测定细胞增殖,定量测定ALP的活性,进行细胞迁移分析和失巢凋亡（anoikis）诱导MSC凋亡分析.结果表明,重组人HGF不影响骨髓间充质干细胞的增殖和向成骨细胞的分化,但可明显促进骨髓间充质干细胞的迁移并抑制anoikis诱导的细胞凋亡;PI-3K和MAPK途径参与了HGF促进细胞迁移的作用.结论：肝细胞生长因子通过受体c-Met影响骨髓间充质干细胞的生物学特性.     

重组腺病毒Ad-LMP-1感染大鼠骨髓间充质干细胞

背景:LIM矿化蛋白1(LIM Mineralization protein,LMP-1)是一种细胞内非分泌蛋白,可以通过招募众多的成骨因子共同参与成骨细胞的分化.LMP-1在成骨上游水平发挥的强大作用提示了其在骨骼重建方面具有巨大的应用潜力.目的:观察重组腺病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞的效果,及对其分化的影响.方法:大鼠骨髓间充质于细胞分离培养,传代后,检测特异性标记物CD44的表达情况,矿化液诱导细胞成骨分化后用茜素红染色鉴定.感染重组腺病毒Ad-LMP-1后通过观察绿色荧光蛋白表达情况计算转染效率,RT-PCR及Western blot验证感染效果.观察感染Ad-LMP-1 2,7,14 d后骨髓间充质干细胞的形态变化和对细胞增殖活力的影响.结果与结论:传代细胞形态一致,排列紧密.矿化液诱导后,细胞形态明显改变.茜素红染色结果表明,诱导后出现钙化结节.观察绿色荧光蛋白信号表明重组病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞效率在85%左右.感染重组腺病毒Ad-LMP-1后第7天出现了细胞形态改变,14 d出现类钙化结节,但不伴有细胞增殖活力改变.结果提示重组腺病毒Ad-LMP-1可以有效地感染原代培养的骨髓间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞分化.     

骨髓间充质干细胞与皮肤组织块共培养影响创面愈合的研究

目的分析新生大鼠皮肤组织块与大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)共培养后对创面愈合的影响和单纯BMSCs对创面愈合的影响进行比较,观察是否能加快创面愈合并探讨其机制。方法取新生大鼠背部皮肤和体外分离、培养、纯化的大鼠BMSCs进行共培养,12只大鼠共72个创面,每只大鼠背部从头至尾分为皮肤组织块+BMSCs共培养组(A组),单纯BMSCs组(B组),无菌PBS对照组(C组),每组2个创面沿脊柱对称分布。观察伤后3、7、14、21 d的创面情况,并用统计学、免疫组化方法对创面修复情况进行探讨。结果统计学分析3组之间的创面愈合速度是有差别的,其中A组的创面愈合速度是最快的,B组次之,C组最慢。免疫组化检测增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达细胞A组最多,B组居中,C组最少。整合素Integrinβ1阳性细胞表达A组最少,B组居中,C组最多。结论和皮肤组织块共培养的BMSCs较单纯的BMSCs能够更快地向皮肤组织细胞分化,并且更好地促进创面的修复和愈合。     

调节骨髓间充质干细胞向皮肤创面迁移过程中的血小板衍生生长因子

背景：血小板衍生生长因子具有创伤修复作用,对其研究大部分集中于骨组织的修复,在皮肤创伤愈合中的修复作用研究较少。目的：观察血小板衍生生长因子在皮肤创伤愈合过程中调控骨髓间充质干细胞向创面迁移促进创面愈合的作用。方法：培养大鼠骨髓间充质干细胞,免疫荧光检测细胞表面标记物CD34、CD44。选取健康雄性SD大鼠30只,随机分为5组,各组大鼠尾静脉注射PKH26标记的骨髓间充质干细胞。注射1周后,于大鼠背部正中线划长为3 cm的切口,制备皮肤创伤模型。造模后即刻于皮肤创伤处多点注射不同质量浓度血小板衍生生长因子干预药物,对照组注射等体积的生理盐水。注射14 d后留取皮肤创面组织进行相关指标检测。结果与结论：荧光显微镜下观察血小板衍生生长因子能够剂量依赖性诱导骨髓间充质干细胞向皮肤创伤组织处迁移和聚集,进而促进皮肤创伤修复。Masson染色结果显示,随着血小板衍生生长因子干预质量浓度的增加,创面炎性细胞浸润减轻、胶原纤维数量不断增多。Western blot检测结果显示,血小板衍生生长因子能够抑制皮肤创伤组织基质金属蛋白酶1的表达,促进基质金属蛋白酶组织抑制因子1的表达,抑制胶原降解,发挥间接促愈合作用。     

骨髓间充质干细胞与肝细胞生长因子在组织修复中的作用

当组织损伤发生后,骨髓间充质干细胞逆趋化因子浓度梯度迁移至病变处,通过分化为受损细胞、分泌多种细胞因子,如肝细胞生长因子等,及其免疫调节等机制,发挥组织修复作用:肝细胞生长因子是间充质干细胞的重要趋化因子,它可抑制间充质干细胞的增殖、并诱导其向肝细胞及上皮细胞系分化.骨髓间充质干细胞参与受损组织的修复过程是复杂的,其作用机制主要表现在归巢至受损部位,局部微环境下的正确定向分化和抑制宿主的免疫等方面.随着研究的进一步深入,骨髓间充质干细胞参与受损组织修复作用机制将会逐步被明确,移植有治疗效果的行基因修饰的骨髓间充质干细胞,及采取其他可增强细胞移植的治疗效果,增强干细胞的修复作用,有望更好的用于指导临床治疗工作.     

Potential benefits of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells for wound healing

Introduction: It is becoming increasingly evident that select adult stem cells have the capacity to participate in repair and regeneration of damaged and/or diseased tissues. Mesenchymal stem cells have been among the most studied adult stem cells for the treatment of a variety of conditions, including wound healing.

Areas covered: Mesenchymal stem cell features potentially beneficial to cutaneous wound healing applications are reviewed.

Expert opinion: Given their potential for in vitro expansion and immune modulatory effects, both autologous and allogeneic mesenchymal stem cells appear to be well suited as wound healing therapies. Allogeneic mesenchymal stem cells derived from young healthy donors could have particular advantage over autologous sources where age and systemic disease can be significant factors.     

Potential benefits of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells for wound healing

INTRODUCTION: It is becoming increasingly evident that select adult stem cells have the capacity to participate in repair and regeneration of damaged and/or diseased tissues. Mesenchymal stem cells have been among the most studied adult stem cells for the treatment of a variety of conditions, including wound healing. AREAS COVERED: Mesenchymal stem cell features potentially beneficial to cutaneous wound healing applications are reviewed. EXPERT OPINION: Given their potential for in vitro expansion and immune modulatory effects, both autologous and allogeneic mesenchymal stem cells appear to be well suited as wound healing therapies. Allogeneic mesenchymal stem cells derived from young healthy donors could have particular advantage over autologous sources where age and systemic disease can be significant factors.     

肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞表达及分泌肝细胞生长因子

背景:有研究表明,肿瘤坏死因子α可以刺激骨髓间充质干细胞发挥免疫抑制功能,并促进骨髓间充质干细胞表达肝细胞生长因子。目的:观察肿瘤坏死因子α刺激大鼠骨髓间充质干细胞是否可以促进肝细胞生长因子的表达及分泌。方法:全骨髓贴壁法分离、纯化 SD 大鼠骨髓间充质干细胞,传代至第三四代使用。以 100 μg/L 肿瘤坏死因子α预刺激骨髓间充质干细胞 5 h 后弃去培养基,换上新鲜培养基作为实验组,以正常培养的骨髓间充质干细胞为空白组。采用倒置相差显微镜观察细胞形态;流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面标记物 CD29、CD34、CD44、CD45 的表达;RT-PCR 、Western blot 检测细胞肝细胞生长因子 mRNA 及蛋白表达;ELISA 测定细胞上清液中肝细胞生长因子水平。结果与结论:获得的骨髓间充质干细胞形态均一,呈典型的旋涡样生长。骨髓间充质干细胞表达 CD29+99.45%,CD34-97.91%、CD44+99.52%、CD45-98.42%;骨髓间充质干细胞中肝细胞生长因子 mRNA 及蛋白与上清液中肝细胞生长因子表达量呈时间依赖性增加,实验组肝细胞生长因子 mRNA 及蛋白与上清液中肝细胞生长因子的表达量明显高于空白组(P < 0.01)。说明肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞可以有效促进肝细胞生长因子的表达及分泌。     

肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞表达及分泌肝细胞生长因子

背景：有研究表明,肿瘤坏死因子α可以刺激骨髓间充质干细胞发挥免疫抑制功能,并促进骨髓间充质干细胞表达肝细胞生长因子。目的：观察肿瘤坏死因子α刺激大鼠骨髓间充质干细胞是否可以促进肝细胞生长因子的表达及分泌。方法：全骨髓贴壁法分离、纯化 SD 大鼠骨髓间充质干细胞,传代至第三四代使用。以 100 μg/L 肿瘤坏死因子α预刺激骨髓间充质干细胞 5 h 后弃去培养基,换上新鲜培养基作为实验组,以正常培养的骨髓间充质干细胞为空白组。采用倒置相差显微镜观察细胞形态;流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面标记物 CD29、CD34、CD44、CD45 的表达;RT-PCR 、Western blot 检测细胞肝细胞生长因子 mRNA 及蛋白表达;ELISA 测定细胞上清液中肝细胞生长因子水平。结果与结论：获得的骨髓间充质干细胞形态均一,呈典型的旋涡样生长。骨髓间充质干细胞表达 CD29＋99.45%,CD34-97.91%、CD44＋99.52%、CD45-98.42%;骨髓间充质干细胞中肝细胞生长因子 mRNA 及蛋白与上清液中肝细胞生长因子表达量呈时间依赖性增加,实验组肝细胞生长因子 mRNA 及蛋白与上清液中肝细胞生长因子的表达量明显高于空白组（P 〈 0.01）。说明肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞可以有效促进肝细胞生长因子的表达及分泌。