斑马鱼红系造血缺陷突变体的正向遗传学筛选

目的 化学遗传学方法 大规模筛选并初步鉴定所获得具有不同红系造血缺陷表型的斑马鱼突变体.方法 乙基亚硝基脲(ENU)诱导雄性斑马鱼突变(founder),将其与野生型AB雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同来源的founder的F1代杂交产生F2家族.在F2代同家族内自交所产生的F3代胚胎中,用以βe1为探针,实施整体原位杂交实验,进行红系造血缺陷突变体筛选,并针对所筛选到的突变体在不同造血过程缺陷表型进行分类研究.结果 和结论 筛选得到4个βe1基因表达缺失突变体,其中2个为红系特异性造血缺陷突变体,另外2个突变体同时存在红系和淋系造血缺陷.     

斑马鱼髓系造血细胞缺陷突变体的大规模遗传筛选

目的 通过大规模化学遗传学方法筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体.方法 利用化学诱变剂乙基亚硝基脲(ENU)将雄鱼精原母细胞诱变,通过与AB野生型雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同founder(FO)的F1代同胞之间交配产生F2家族,F3代来F2家族同胞内交配,并分别以中性红和苏丹黑B染色筛选巨噬细胞和粒细胞缺陷突变体.结果 我们筛选了350个F2家族,共1424对鱼.初步筛选到6个斑马鱼髓系造血系统的突变体,其中3个突变体为中性红染色异常,另3个突变体为苏丹黑染色异常,表明以上突变体可能存在巨噬细胞或粒细胞的发育障碍.结论 ENU化学诱变和中性红及苏丹黑B染色筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体是简单、价廉、有效的化学遗传学方法.通过保留突变体对后代进行进一步的研究分析,有望鉴定和克隆影响斑马鱼髓系造血新的基因或已知基因的新的调控途径.     

一种斑马鱼原始造血髓系细胞突变体的研究

摘要：目的斑马鱼原始造血髓系细胞突变体1276的表型鉴定及性状分析。方法利用化学诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲诱变野生型AB斑马鱼雄鱼的精原细胞,突变基因组保留传代,采用中性红染液对F3代的胚胎进行细胞化学染色,筛选原始
造血髓系细胞突变体。并通过细胞化学染色及检测不同谱系血细胞标记基因在不同发育阶段的mRNA及蛋白的表达水平,对其中之一突变体1276进行表型鉴定及性状分析。结果成功筛选1296个F2家族,2140个突变基因组,发现中性红
染色信号异常突变体12个。突变体1276在原始造血阶段,中性红染色全身信号缺失,小胶质细胞标记基因apoe 表达缺失,巨噬细胞标记基因l-plastin,头部表达减少,背主动脉壁腹侧区域表达正常,粒细胞、红细胞均未见异常;在定向造血阶
段,巨噬细胞仍存在异常,但粒细胞、红细胞、淋巴细胞以及造血干细胞均未见明显异常。结论突变体1276在原始造血阶段,巨噬细胞存在功能障碍,以及不同程度发育及迁徙异常;在定向造血阶段这一性状并未得到代偿。     

elavl1a对斑马鱼生长发育的调控作用

目的：构建elavl1a^-/-突变体斑马鱼,探索elavl1a基因对斑马鱼生存及生长发育的影响。方法：运用CRISPR-Cas9技术构建elavl1a F0代嵌合体斑马鱼,通过与野生型斑马鱼杂交得到F1代斑马鱼,经过基因型鉴定让同一型F1代斑马鱼自交得到elavl1a^-/-纯合突变体斑马鱼,通过基因测序及Western blot鉴定,并做相应的数量统计及形态学分析。结果：通过基因测序发现得到的elavl1a^-/-突变体斑马鱼在第2个外显子上缺少5个核苷酸,产生移码突变,提前出现终止密码子,仅能够编码部分氨基酸,Western blot未能检测出elavla蛋白表达,且得到的elavl1a^-/-突变体斑马鱼的生存率降低,不符合孟德尔遗传,生长发育迟缓。结论：成功构建得到elavl1a^-/-突变体斑马鱼,elavl1a基因对斑马鱼生存及发育具有重要作用。     

β位淀粉样前体蛋白裂解酶2基因敲除斑马鱼动物模型的构建及其初步应用

目的 构建β位淀粉样前体蛋白裂解酶2(β-site APP-cleaving enzyme 2,BACE2)基因敲除斑马鱼动物模型并及其初步探索其应用。方法 运用CRISPR/Cas9技术,在斑马鱼中设计针对靶点的gRNA,使之诱导靶点突变,经测序鉴定得到突变体。结果 BACE2纯合突变体在早期部分无法存活,RT-PCR结果显示BACE2基因在斑马鱼的早期发育中持续表达。结论 BACE2基因敲除的斑马鱼动物模型将为进一步研究BACE2基因在斑马鱼胰腺发育中的作用和针对糖尿病的药物靶点筛选提供有效工具。     

CRISPR/Cas9技术敲除faf1基因对斑马鱼软骨及肌节发育的影响

目的 利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼faf1基因,并研究faF1基因对斑马鱼发育的影响.方法 针对斑马鱼faf1基因设计并制备gRNA,通过显微注射技术将gRNA与Cas9 mRNA混合注入斑马鱼单细胞胚胎中,通过酶切和基因测序技术筛选出发生突变的F0代斑马鱼,将其与野生型斑马鱼外交得到F1代杂合体斑马鱼,检测其可遗传突变类型,并用显微镜观察、记录每一代斑马鱼表型.结果 成功制备了faf1 gRNA和Cas9 mRNA.位于faf1 6号外显子的gRNA(gRNA6)能使faf1基因发生移码突变.筛选出可遗传突变类型(mutant 1,MU1)并观察到该杂合突变型斑马鱼有体细胞色素沉积延迟,受精后第4天开始尾部肌节出现“结节样”表型以及头颅缩小、舌骨小角角度增大等颅面软骨畸形的变化,并于受精后8～9d死亡.结论 利用CRISPR/Cas9敲除该基因产生了新的表型,即色素沉积延迟及尾部肌节部位出现“结节样”变化.     

斑马鱼小头震颤突变体mise的鉴定与基因定位

目的 以自发突变导致的小头、震颤(microcephaly and seizure,mise)斑马鱼为模型,研究其遗传方式和突变基因定位。方法 通过比较正常和突变体斑马鱼的头宽和眼球面积,鉴定突变体的小头小眼性状;通过构建家系确定突变遗传方式。对极端表型群体进行基因组重测序,随后利用分离群体分组分析(bulked segregation analysis, BSA)和竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP),一代测序等方法获得突变基因定位。结果 与野生型相比,突变体mise受精后3 d(3 days post fertilization, 3 dpf)表现为小头小眼震颤表型。经基因定位及验证明确与表型相关的突变基因为terfa。结论 本研究通过全基因组重测序结合连锁分析的方法快速定位突变基因,可为斑马鱼突变体的基因定位提供参考,为神经系统发育异常的相关基因功能分析奠定基础。     

KLF7b对斑马鱼胚胎发育的影响

目的：探讨KLF7b对斑马鱼胚胎发育的影响。方法：体外转录野生型KLF7b mRNA、KLF7b 乙酰化位点突变体mRNA;设计合成特异性KLF7b反义吗啉代寡核苷酸（morpholino oligonueleitide,MO）;在1~2细胞期注射到斑马鱼胚胎体内以实现KLF7b的过表达、位点突变与敲降;观察胚胎表型并利用定量PCR检测发育相关基因的表达变化,钙黄绿素染色观察斑马鱼骨骼发育情况。结果：过表达KLF7b对斑马鱼胚胎的发育无明显影响;敲降KLF7b或注射乙酰化位点突变的KLF7b后,斑马鱼胚胎出现心包积液、体轴和头部发育的异常,肌肉发育标志基因表达下调。结论：KLF7b可通过乙酰化修饰影响斑马鱼的发育。     

CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼rpl15基因对斑马鱼红系造血发育的影响

目的 利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼rpl15基因,探讨rpl15基因对斑马鱼红系造血发育的影响.方法 针对斑马鱼rpl15基因设计并制备gRNA(guide RNA),将gRNA与Cas9蛋白的混合物显微注射到单细胞期斑马鱼受精卵中,提取72 h胚胎基因组DNA,PCR扩增出目的片段,T7E1限制性酶切法检测基因打靶情况,随后进行测序分析确定编辑效果.通过O-dianisidine染色分析血红蛋白合成情况,中性粒细胞染色分析中性粒细胞生成情况,利用Real-time PCR检测p53、mdm2、hsp70和造血相关转录因子基因的表达变化.结果 成功制备了rpl15 gRNA,并筛选得到rpl15突变体.rpl15基因敲除的幼鱼出现体长缩短、尾部弯曲、头部和眼睛较小及心包水肿的表型;造血相关谱系染色结果显示rpl15突变体血红蛋白合成明显减少,但中性粒细胞生成未受影响;rpl15突变体p53和mdm2的mRNA表达均显著升高(P＜0.01,P＜0.05,),α-globin、gatal和hsp70的mRNA表达均显著下调(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05),除红系外的造血相关转录因子的mRNA表达与对照组相比均无明显差异.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功编辑了斑马鱼rpl15基因,突变体产生了类似先天性纯红细胞再生障碍性贫血疾病的表型.同时表明p53与hsp70可能参与调控突变体表型的形成.     

一种新的斑马鱼cloche突变体亚型的基因鉴定

目的斑马鱼cloche172突变体的基因鉴定。方法采用化学诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)诱变雄性野生型AB斑马鱼,实施大规模正向遗传学方法筛选髓系细胞标记物lysozymeC(lyC)表达缺失突变体,并对其中一个名为cloche172突变体进行大体形态学观察,基因定位克隆和遗传学互补实验。结果大规模正向遗传学筛选出4个lyc表达缺失突变体,其中一个cloche172突变体受精后3d(day post fertilization,dpf)时期大体形态改变与已知但基因不明的cloche突变体相似。遗传学互补实验观察到有1/4胚胎出现类似cloche突变体的表型。同时,cloche172突变体基因定位在13号染色体近端粒的区域,与cloche突变体基因定位区域一致。而o-dianisdine实验证实cloche172突变体有较多红细胞聚集,cloche突变体仅有少量在尾部存在。结论cloche172基因与cloche基因定位一致,cloche172突变体是一个新的点突变位点的cloche突变体。     

重症肝炎腹腔脏器自发穿孔分析

本组２４６例重症肝炎（重肝）收治中８例发生腹腔脏器穿孔，患者除有重肝表现外还有不同程度腹痛，经腹腔穿刺，彩色Ｂ超、Ｘ线照片及外科手术分别诊断为胆囊、胃、肠穿孔。因该病外科手术成功率极低，８例患者仅１例存活，７例死亡。临床工作者应高度警惕此并发症的发生。     

~3H－栀子甙整体放射自显影及图象分析与栀子归经的关系

以３Ｈ－栀子甙为示踪剂，采用整体放射自显影及图像分析技术，观察栀子的有效成分栀子甙在小鼠体内定量分布的动态变化，并探讨与栀子归经理论的关系。结果表明：同一器官的不同示踪时相和同一示踪时相的不同器官，其示踪剂活性强度均呈现极显著性差异（Ｐ＜０．０１）；３Ｈ－栀子甙在体内具有选择性分布特点，较集中分布于肾、膀胱、肺、胆、肝、肾上腺、小肠、大肠、心脏和胃等器官；其分布特点同栀子归经于心、肝、肺、胃经以及脏腑的络属关系基本相符，首次为栀子传统的归经理论提供了形态学依据。     

胆囊癌的MRI诊断

①目的 探讨MRI在诊断胆囊癌中的意义。②方法 对9例行MRI检查并经手术证实及CT、B超联合诊断的胆囊癌进行分析。③结果 壁厚型1例，肿块型5例，腔内型2例，阻塞型1例。7例胆囊癌并发胆囊结石及胆囊炎。8例伴肝内侵犯或转移。④结论 MRI对胆囊癌的诊断具有优势。胆囊癌应与胆囊炎、胆囊息肉、腺肌癌及肝癌相鉴别。     

不同病因所致胆囊壁增厚的超声图像特征及其临床意义

目的 探讨不同病因所致胆囊壁增厚的超声图像特征及其意义。方法选择2007年1月至2008年12月我院住院胆囊壁增厚患者127例,依据临床资料和部分术后病理结果分为：急性胆囊炎组33例,慢性胆囊炎组24例,心、肝、肾疾病组40例,其他原因组30例。选择2008年3月至12月我院88例无胆囊疾患史及其他能够引起胆囊壁增厚的健康体检者,按照是否禁食分为空腹对照组52例和餐后对照组36例。均测量比较其胆囊壁厚度并分析其声像图特征。结果空腹对照组胆囊壁厚（2．4±0．3）mm,餐后对照组（3．4±0．2）mm,急性胆囊炎组（5．6±0．4）mm,慢性胆囊炎组（4．2±0．3）mm,心、肝、肾疾病组（8．6±0．5）mm,其他原因组（3．4±0．3）mm。餐后对照组及各病变组胆囊壁厚与空腹对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。慢性胆囊炎组与急性胆囊炎组及心、肝、肾疾病组比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;与其他原因组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。急性胆囊炎超声声像图以内膜改变为重,心、肝、肾疾病胆囊壁呈规则均匀的双边征,这与慢性胆囊炎引起的胆囊壁增厚较易鉴别。而其他原因组部分声像图特点与慢性胆囊炎有类似之处。结论胆囊壁增厚是一种非特异性病理表现,可由胆囊本身及胆囊外疾病引起。超声显示胆囊壁增厚时,应结合临床资料和声像图特点,鉴别引起胆囊壁增厚的原因。     

16例鱼胆中毒致多器官功能障碍综合征的临床分析

目的探讨口服生鱼胆致多器官功能障碍综合征(MODS)的临床治疗.方法:分析16例患者服生鱼胆后所致的急性肾功能衰竭、肝功能衰竭、心功能衰竭等两个以上脏器衰竭的临床表现和治疗.结果采用以透析疗法为主的综合治疗措施,16例患者中治愈14例,死亡2例,存活者随访至今健康,无后遗症.结论鱼胆中毒可导致肾脏、肝脏、心脏、胃肠道等多器官功能衰竭,其中肾脏是最易受损失的器官.早期透析可提高鱼胆中毒致MODS的生存率.     

三焦:以胰腺为中心的中医解剖结构

以人体解剖学基础考证《黄帝内经》中有关三焦的实际结构,发现三焦是以胰腺为中心的一系列解剖结构。首先,三焦是六腑之一,"从三焦注胆"确定了六腑之三焦就是胰腺,命名为胰腺三焦。"苦入于胃,五谷之气,皆不能胜苦,苦入下脘,三焦之道皆闭而不通,故变呕"中的三焦,是指由胰腺标记的消化吸收中心,命名为胃肠三焦,其中胃为上焦,胰腺所连接的十二指肠为中焦,小肠的近十二指肠段为下焦。三焦同时是人体的主要体腔,胸腔当中的纵隔属于上焦,腹膜腔属于中焦,腹膜后隙属于下焦,命名为体腔三焦。"上行注膻中,散于三焦"是指胰腺三焦和十二指肠所处的腹膜后隙,命名为膜后三焦,是下焦所属解剖空间的一部分。《难经》对膜后三焦的生理功能有完整论述,弥补了《黄帝内经》只强调盆筋膜间隙为下焦体腔的不足。胰腺三焦是消化管道内体液的主要来源,体腔三焦承载和调节体内的细胞外液,体液的调控是在肾的主导下,体腔三焦与膀胱协调完成的,其中胰腺三焦参与体液调控的机制可能与Na+的摄入有关。     

谈脉诊中的"左肝右脾"

脉象中除包括脉搏的跳动、心脏的心率、每搏输出量、血管弹性和外周阻力外 ,还可显示人体的生命信息。其规律为 :寸关尺三部脉象分别显示人体上、中、下三部。寸脉显示头颈、心肺 ;关脉显示肝胆、脾胃 ;尺脉显示肾、命门、大肠等。左手显示左侧脏器 ,右手显示右侧脏器     

水通道蛋白-4在大鼠消化器官的表达与分布

目的探讨水通道蛋白-4在SD大鼠消化器官的表达与分布。方法动物麻醉处死后取胃、空肠、回肠、结肠、直肠、胰腺和肝脏等器官,常规进行脱水、固定、石蜡包埋、切片（4μm）后以链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（SABC）检测水通道蛋白-4蛋白在上述组织中的表达。结果AQP4在正常SD大鼠消化道中的表达和分布具有选择性：食管和胃的上部基本不表达AQP4。从胃的中下部始见表达AQP4,集中于深部粘膜的基底部腺体。胃腺表达AQP4的细胞类型为壁细胞。十二指肠、空肠和回肠富舍AQP4,但少于胃部,AQP4在十二指肠、空肠和回肠出现的位置主要粘膜深部的腺隐窝。近端结肠的局部腺隐窝可见少量AQP4表达,远端结肠和直肠组未见AQP4表达。胰脏和肝胆亦可见微量AQP4表达。结论SD大鼠下段胃和小肠是AQP4主要表达的部位,近端结肠、肝胆和胰腺只微量表达AQP4。研究消化系统的疾病与AQP4的关系可能有助于我们进一步认识疾病的发病机制。     

血液透析治疗鱼胆中毒致急性肾功能衰竭的临床疗效

目的：观察血液透析滤过及血液灌流治疗鱼胆中毒致急性肾功能衰竭的临床疗效。方法：回顾性分析3例由于鱼胆中毒所致急性肾功能衰竭患者的临床资料,采用血液透析滤过及血液灌流治疗,比较透析治疗前后患者的肾功能、肝功能变化;观察中毒至首次血液透析的时间、服鱼胆量对疗效的影响。结果：经血液透析滤过及血液灌流治疗后,2例患者痊愈出院,至今健康;1例患者死亡。血透治疗后,患者肝、肾功能各项指标较血透前显著下降（P〈0.01）;首次透析的时间越早,疗效愈好（P〈0.01）;服不同数量鱼胆的患者,其血透次数和肾功能恢复的时间差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论：及时充分的血液透析滤过及血液灌流治疗鱼胆中毒致急性肾功能衰竭疗效较好。