骨形态发生蛋白2基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：评价携带骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒（Ad-BMP-2）转染人骨髓间充质干细胞（MSC）对其成骨分化的影响。方法：由健康青年男性髂骨抽取骨髓培养MSC，BMP-2基因转染后，用RT-PCR及免疫组化染色证实转基因MSC的BMP-2基因表达，原位杂交及免疫组化染色检测转染后细胞成骨活性，并进行透射电镜观察。结果：转染后细胞稳定表达BMP-2基因，核心结合因子a1、骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶呈阳性表达，透射电镜显示细胞外有胶原分泌和钙盐沉积。结论：Ad—BMP-2基因转染可以提高MSC的体外成骨能力。     

体外诱导条件下大鼠骨髓基质细胞骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA的表达

目的 研究体外培养大鼠骨髓基质细胞诱导条件下，成骨分化标志骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA水平的表达。方法 采用成骨诱导剂（含地塞米松10^-8mol/L,β甘油磷酸钠10mmol/L和抗坏敌国酸AA50μg/ml)对培养状态下的不同代大鼠骨髓基质细胞进行成骨诱导，提取RNA，采用RT-PCR方法，以β-肌动蛋白cDNA为内参照，检测骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果 与对照组相比，接受成骨诱导剂作用的大鼠骨髓基质细胞随诱导时间的延长骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA出现高表达，且维生素D为诱导骨钙素mRNA表达的必需成分。结论 体外培养的大鼠骨髓基质细胞保持成骨未分化状态，无骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA的表达，诱导后可向成骨分化，骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA表达升高。     

腺病毒介导的BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞及对其增殖、成骨分化的影响

目的: 用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),研究转染对其增殖、成骨分化的影响.方法: 用Ad-BMP-2转染兔BMSCs,利用免疫细胞化学法、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪观察细胞周期的变化,分析转染对BMSCs增殖的影响.酶标法检测ALP活性;免疫荧光检测骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原表达,分析转染对BMSCs成骨分化的影响.结果: BMP-2基因在转染细胞内mRNA水平和蛋白水平均有较高表达,蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达.流式细胞仪检测G1期、S期细胞比例与空白对照组无差异.ALP活性明显增高,骨钙素、Ⅰ型胶原免疫荧光检测,见胞浆内有大量显绿色荧光的阳性物质.结论: 在腺病毒载体介导下BMP-2基因成功导入BMSCs,细胞增殖未因转染而受影响,并可持续表达基因产物,向成骨细胞分化.     

LIM矿化蛋白-1对间充质干细胞成骨分化影响的实验研究

目的：构建LIM矿化蛋白-1（LIM mineralization protein-1,LMP-1）的真核表达质粒,并在兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）内表达,研究LMP-1对体外培养BMSCs成骨分化的影响。方法：RT-PCR克隆hLMP-1和骨形态发生蛋白－２（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）,并构建pIRES2-EGFP-LMP－1及pIRES2-EGFP-BMP－2重组质粒。分离培养BMSCs,脂质体介导下将pIRES2-EGFP-LMP－1、pIRES2-EGFP-BMP－2和pIRES2-EGFP质粒转染BMSCs。7 d后收集细胞,RT-PCR比较hLMP-1、hBMP-2及Ⅰ型胶原的表达,检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,免疫组化染色比较骨钙素表达。结果：pIRES2-EGFP-LMP-1和pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒构建成功。重组质粒成功转染BMSCs,RT-PCR证实表达目的基因,hLMP-1和hBMP-2转染组可以明显促进细胞分泌ALP的活性,诱导Ⅰ型胶原和骨钙素的表达。结论：LMP-1可以促进BMSCs向成骨细胞分化。     

体外培养的人牙囊细胞矿化相关标志物的表达

目的体外培养人牙囊细胞，探讨牙囊细胞是否具成骨、成牙骨质细胞表型特征，是否呵作为牙骨质再生的种子细胞。方法酶消化联合组织块法获得人牙囊细胞，免疫酶细胞化学染色技术检测其Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白、骨粘连蛋白的表达．RT-PCR技术检测细胞的骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶的表达。矿化诱导并连续培养牙囊细胞，行Von kossa染色检测体外矿化形成情况。结果免疫组化结果：牙囊细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白、骨粘连蛋白呈不同程度的阳性表达：RT-PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达。经矿化诱导后的牙囊细胞在20d时可形成矿化结节，von Kossa染色阳性。结论牙囊细胞具有成骨细胞、成牙骨质细胞的部分特性，体外培养的人牙囊细胞具有分泌合成矿化组织的能力，可试将其作为牙周组织再生的种子细胞。     

骨形态发生蛋白-2、-3对胚胎小鼠椎间盘细胞的成软骨及成骨作用

目的探索成骨作用的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)及抑制成骨作用的骨形态发生蛋白-3(BMP-3)对胚胎小鼠椎间盘细胞的成软骨及成骨作用,为BMPs临床治疗椎间盘相关疾病提供实验依据。方法运用腺病毒介导的BMP-2和BMP-3在胚胎小鼠椎间盘细胞中表达,RT-PCR检测Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)、蛋白多糖(ACAN)、骨钙素(OC)、骨保护素(OPG)和骨桥蛋白(OPN)成软骨及成骨相关指标mRNA水平的表达,甲苯胺蓝染色检测软骨基质的表达,碱性磷酸酶(ALP)读数及ALP染色检测ALP的活性。结果 BMP-2和BMP-3表达对于椎间盘纤维环(AF)细胞的成软骨和成骨均没有作用。对椎间盘髓核(NP)细胞的软骨相关指标ColⅠ、ColⅡ、ACAN mRNA的表达同样没有影响,但可促进NP细胞的成骨,其中BMP-2和BMP-3均可促进OC mRNA的表达升高,而仅BMP-2可促进其OPG和OPN的mRNA表达升高。甲苯胺蓝染色证明BMP-2和BMP-3对椎间盘细胞软骨基质分泌的影响并不显著。NP细胞在BMP-2和BMP-3腺病毒感染后ALP活性明显增强,在AF细胞中则未观察到这种变化。结论 BMP-2和BMP-3均可促进胚胎小鼠NP细胞的成骨作用,但对AF细胞的成骨及成软骨作用及对NP细胞的成软骨作用没有影响。     

骨形态发生蛋白-2、-3对胚胎小鼠椎间盘细胞的成软骨及成骨作用

目的探索成骨作用的骨形态发生蛋白-2（BMP-2）及抑制成骨作用的骨形态发生蛋白-3（BMP-3）对胚胎小鼠椎间盘细胞
的成软骨及成骨作用,为BMPs临床治疗椎间盘相关疾病提供实验依据。方法运用腺病毒介导的BMP-2和BMP-3在胚胎小
鼠椎间盘细胞中表达,RT-PCR检测Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅱ型胶原（ColⅡ）、蛋白多糖（ACAN）、骨钙素（OC）、骨保护素（OPG）和
骨桥蛋白（OPN）成软骨及成骨相关指标mRNA水平的表达,甲苯胺蓝染色检测软骨基质的表达,碱性磷酸酶（ALP) 读数及
ALP染色检测ALP的活性。结果BMP-2和BMP-3表达对于椎间盘纤维环（AF）细胞的成软骨和成骨均没有作用。对椎间盘
髓核（NP）细胞的软骨相关指标ColⅠ、ColⅡ、ACAN mRNA的表达同样没有影响,但可促进NP细胞的成骨,其中BMP-2 和
BMP-3均可促进OC mRNA的表达升高,而仅BMP-2可促进其OPG和OPN的mRNA表达升高。甲苯胺蓝染色证明BMP-2和
BMP-3对椎间盘细胞软骨基质分泌的影响并不显著。NP细胞在BMP-2和BMP-3腺病毒感染后ALP活性明显增强,在AF细
胞中则未观察到这种变化。结论BMP-2和BMP-3均可促进胚胎小鼠NP细胞的成骨作用,但对AF细胞的成骨及成软骨作用
及对NP细胞的成软骨作用没有影响。
     

补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎成纤维细胞成骨型表达的影响

[目的]探讨补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎（AS）成纤维细胞成骨型表达的影响。[方法]以体外培养的AS髋关节囊组织的成纤维细胞为实验对象,观察在细胞因子BMP-2与TGF-β的诱导刺激下,AS成纤维细胞成骨型表达标志物ALP活性、胶原含量、骨钙素含量的变化。[结果]细胞因子作用后,AS成纤维细胞的ALP活性、胶原含量、骨钙素含量较正常对照组与AS对照组有明显提高（P〈0.01）。药物作用后,补肾强脊颗粒含药血清对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞ALP、胶原含量、骨钙素含量活性有明显的抑制作用（P〈0.01）;而兔空白血清组SASP含药血清组则作用不明显（P〉0.05）。[结论]补肾强脊颗粒可以通过抑制细胞因子对成纤维细胞成骨型标志物的影响而达到抑制成纤维细胞进一步向成骨型的分化。     

人成骨肉瘤MG-63细胞分化特性及分化过程中的基因表达

观察人成骨肉瘤MG 6 3细胞分化特性及分化过程中的基因表达。在细胞培养的不同时间 ,用α 磷酸奈酚法测定碱性磷酸酶 (ALP)活性 ;放射免疫法测定骨钙素 (BGP)含量 ;半定量逆转录聚合酶链反应测I型胶原、基质金属蛋白酶 (MMP) 1和基质金属蛋白酶抑制因子 (TIMP) 1基因mRNA表达 ;VanGieSon氏苦味酸酸性复红染色法染色细胞I型胶原。结果表明MG 6 3细胞接种培养第 7d后I型胶原基因表达较高。MMP 1表达量随时间推移逐渐增加 ,至第 2 4d达到高峰。第 1～ 9dTIMP 1表达量逐渐增加 ,其后基本恒定。ALP活性第 0～ 12d逐渐增高 ,至第 12d达最高 ,其后逐渐下降。第 18d后 ,细胞有许多大小不等的结节形成 ,I型胶原结节染色较无结节处深。MG 6 3细胞具有成骨细胞表型特征。MG 6 3细胞生长分为细胞增殖、骨基质成熟、骨基质矿化阶段 ,且I型胶原 ,MMP 1,TIMP 1基因表达及ALP活性呈时间特异性。     

人成骨肉瘤MG—63细胞分化特性及分化过程中的基因表达

观察人成骨肉瘤MG-63细胞分化特性及分化过程中的基因表达。在细胞培养的不同时间,用α-磷酸奈酚法测定碱性磷酸酶（ALP）活性;放射免疫法测定骨钙素（BGP）含量;半定量逆转录聚合酶链反应测I型胶原、基质金属蛋白酶（MMP）-1和基质金属蛋白酶抑制因子（TIMP）-1基因mRNA表达;Van GieSon氏苦味酸酸性复红染色法染色细胞I型胶原。结果表明MG-63细胞接种培养第7d后I型胶原基因表达较高。MMP-1表达量随时间推移逐渐增加,至第24d达到高峰。第1-9d TIMP-1表达量逐渐增加,其后基本恒定。ALP活性第0-12d逐渐增高,至第12d达最高,其后逐渐下降。第18d后,细胞有许多大小不等的结节形成,I型胶原结节染色较无结节处深。MG-63细胞具有成骨细胞表型特征。MG-63细胞生长分为细胞增殖、骨基质成熟、骨基质矿化阶段,具I型胶原,MMP-1,TIMP-1基因表达及ALP活性呈时间特异性。     

微囊化成骨细胞诱导骨髓间充质干细胞体外成骨分化的量效研究

目的探讨微囊化成骨细胞体系细胞添加量对诱导骨髓间充质干细胞体外成骨分化的影响。方法制备含有成骨细胞的海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊,与间充质干细胞的共培养,在1,7,14 d通过细胞增殖量、碱性磷酸酶活性、实时定量PCR等检测,统计结果并分析。结果各时段细胞增量无统计学意义;碱性磷酸酶活性随细胞浓度增加表现出递增趋势,且骨钙蛋白mRNA的表达结果基本一致。结论微囊化成骨细胞在低浓度下已能促进骨髓间充质干细胞成骨分化,浓度升高时促分化能力越强,但达到一定浓度后继续提高时,对成骨分化的作用则不再增强。     

二磷酸盐对成骨细胞增殖及分化成熟作用的实验研究

目的研究二磷酸盐类药物—阿伦磷酸对成骨细胞增殖及分化成熟的作用。方法将人成骨样MG-63细胞体外培养、传代后分为5组:空白对照组、阳性对照组(加入10-8M地塞米松)、3个实验组(分别加入10-6M、10-8M、10-10M阿伦磷酸)。培养数日后,行细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、骨形态发生蛋白-(2BMP-2)、骨钙素(OC)、I型胶原(Coll.I)基因表达等检测。结果加入阿伦磷酸的3个实验组MG-63细胞数目较对照组显著增加,其峰值出现在浓度为10-8M时;同时,阿伦磷酸使ALP活性增强,而且BMP-2、OC、Coll.I等成骨细胞相关基因的表达增加。结论阿伦磷酸具有促进成骨细胞增殖及分化成熟,诱导骨形成的能力。     

小鼠卵黄囊间质干细胞向成骨细胞定向分化的实验研究

目的研究卵黄囊间质干细胞的成骨潜能。方法用０．１％的Ⅰ型胶原酶消化获得妊娠第８．５天的小鼠卵黄囊细胞;取贴壁细胞培养,并于接近融合时进行传代培养。对细胞进行形态学观察、碱性磷酸酶（ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ,ＡＫＰ）及Ⅰ、Ⅲ型胶原检测,传代４次后进行成骨诱导,每天观察细胞形态,并于培养７ｄ后测定ＡＫＰ、Ⅰ、Ⅲ型胶原及骨形态发生蛋白－２（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ－２,ＢＭＰ　－２）的表达,培养８周后进行矿化检测。结果体外可获得纯化的卵黄囊间质干细胞,细胞大小形态均一,呈梭形,ＡＫＰ染色弱阳性,Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性。在体外可诱导卵黄囊间质干细胞定向分化为多形性成骨样细胞,细胞由梭形向星形转化,并形成胞浆突起,相互连接成网状,细胞ＡＫＰ染色阳性,Ⅰ型胶原阳性,Ⅲ型胶原阴性,ＢＭＰ　－２强阳性,８周后矿化区经Ｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ　＇ｓ染色呈阳性反应,符合成骨细胞的生物学特征。结论经体外纯化的卵黄囊间质干细胞可诱导向成骨细胞定向分化。     

携带重组腺病毒 BMP-2的巨噬细胞对 C3H10细胞成骨分化的影响

目的：探讨携带 BMP-2（Bone Morphogenetic protine-2）腺病毒的巨噬细胞对小鼠 C3H10细胞的增殖和成骨分化的作用。方法：感染重组腺病毒 BMP-2的巨噬细胞与小鼠 C3H10细胞共培养。MTT 方法检测共培养体系中 C3H10细胞的增殖能力;共培养7 d 对 C3H10细胞进行 ALP 染色和活性检测;细胞培养至21 d,进行标茜素红染色检测矿化结节;定量 PCR 实验验证过表达腺病毒载体 BMP-2有效性并且检测 Runx2的表达;Western blot检测细胞中磷酸化 Smad1/5/8蛋白表达。结果：与对照组相比,巨细胞过表达 BMP-2与 C3H10细胞共培养后,可以促进 C3H10细胞增殖;ALP 染色程度和活性上升;矿化结节增多;定量 PCR 结果显示 Ruxn2 RNA 表达增加, Western blot 结果显示 Ruxn2蛋白表达上升。结论：过表达 BMP-2的巨噬细胞可以促进小鼠 C3H10细胞的增殖,并且可能通过 BMPs 经典途径促进 C3H10细胞的成骨分化。     

辛伐他汀对人骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程的影响

目的：观察辛伐他汀（SIM）对体外人骨髓基质干细胞（hBMSCs）向成骨分化的影响,探讨其刺激成骨的作用机制.方法：取健康成人骨髓进行体外成骨诱导培养,实验分为对照组（G1）：不给予药物干预;实验组（G2）：传代后加入SIM1×10-7mol/L.于传代后7,14,21d采用RealtimeRT-PCR检测mRNA水平和BMP-2,Smad1,β-catenin,Frizzled2的表达,并用免疫组织化学检测蛋白水平β-catenin的表达.传代后7d行细胞碱性磷酸酶（ALP）染色和比活性检测;传代后21d行vonKossa染色,检测细胞外基质矿化.结果：SIM作用后7,14,21d3个不同时间点,BMP-2表达均显著高于对照组;Smad1在成骨诱导14,21d时表达高于G1,其余组间差异均不显著;β-catenin免疫组织化学染色2组差异不显著;G2组ALP表达和矿化能力均显著高于G1组.结论：SIM1×10^-7mol/L可促进体外成骨诱导培养的hBMSCs向成骨细胞分化,上调TGF-β/BMPs信号通路部分信号分子表达,但未能显著改变Wnt/β-catenin信号通路部分相关因子的表达.     

接骨中药含药血清对成骨细胞生物功能的影响

目的 比较伤科常用单味接骨中药含药血清对成骨细胞生物学功能的影响。方法 应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法、茜素红染色方法和RT-PCR法，比较伤科常用单味中药当归、自然铜、骨碎补和续断对体外培养成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶分泌、矿化结节形成和mRNA表达的影响。结果 单味中药当归对早期增殖期的成骨细胞有明显的促增殖和分化的作用；当归和自然铜能增加成骨细胞矿化期矿化结节的形成；当归和续断能上调BMP-2和IGF-ImRNA的表达。结论 单味接骨中药当归具有刺激体外培养成骨细胞增殖和分化的功能。