斑马鱼uba6和uba7突变体的构建与鉴定

目的 构建斑马鱼uba6和uba7突变体。方法 运用TALEN技术在斑马鱼uba6和uba7基因编码区引进突变,并测序鉴定突变类型。结果 成功获得了两种突变类型的uba6和三种突变类型的uba7斑马鱼突变体。结论 成功构建了斑马鱼uba6和uba7突变体,为进一步研究斑马鱼uba6和uba7基因的功能提供了材料。     

阿霉素对模式生物斑马鱼中abcb4基因表达的影响

目的 选择斑马鱼作为实验对象,研究阿霉素(doxorubicin,DOX)对其abcb4基因表达的影响,进一步了解abcb4基因在斑马鱼多药耐药机制中可能的作用。方法 分别以2 mL/L二甲基亚砜（DMSO）,10 μmol/L DOX及含2 mL/L DMSO的10 μmol/L DOX对斑马鱼胚胎进行药物处理,另以Eggwater处理的胚胎作为对照组。将正常发育的4~16个细胞期斑马鱼胚胎,随机分入以上各组中,药物处理至120 hpf。收集药物处理下的斑马鱼不同时期胚胎运用实时荧光定量PCR和胚胎原位杂交技术,检测abcb4基因在斑马鱼中的表达变化情况。结果 相较于对照组,药物处理的斑马鱼胚胎abcb4基因mRNA表达水平升高(P<0.05),而abcb5基因mRNA表达情况则无明显变化。通过斑马鱼胚胎原位杂交,均在斑马鱼120 hpf胚胎小肠部位发现有abcb4基因阳性杂交信号,且药物处理的斑马鱼胚胎在脑及心脏部位发现abcb4基因阳性杂交信号。结论 DOX能诱导斑马鱼胚胎abcb4基因表达水平增高,对阐明abcb4基因在斑马鱼多药耐药产生机制中的作用具有重要意义。     

基于tyrp1a转基因斑马鱼构建色素障碍性疾病药物筛选模型

为了能够有效地筛选治疗色素障碍性疾病药物,建立一种转基因斑马鱼药物筛选模型。采用斑马鱼酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase-related protein 1a,tyrp1a)基因启动子驱动绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),构建出tyrp1a转基因斑马鱼,使绿色荧光能够特异性表达在斑马鱼黑素细胞部位。分别给予斑马鱼促进黑素合成的药物N-苯基硫脲(N-phenylthiourea,PTU)和抑制黑素合成的药物黑素细胞刺激素(alpha-melnaocyte stimulating hormone,α-MSH),检测药物对斑马鱼黑素合成和绿色荧光蛋白表达影响。结果显示,PTU可以抑制斑马鱼黑素细胞黑素合成作用,并且降低转基因斑马鱼绿色荧光蛋白表达。α-MSH可以促进斑马鱼黑素细胞黑素合成作用,并促进转基因斑马鱼绿色荧光蛋白表达。本研究成功地建立了一种新的可以用于色素性障碍疾病药物筛选的转基因斑马鱼模型。     

Streptomyces sp.Tü 4128中新型抗生素bagremycins抗性基因bagJ的研究

通过框内敲除鉴定了链霉菌Streptomyces sp.Tü 4128中基因bagJ的功能。HPLC结果表明,敲除基因bagJ导致抗生素生产水平大幅降低;回补菌株恢复了抗生素的生产;过表达菌株大幅提高了抗生素的产量,证明基因bagJ在新型抗生素bagremycins的生物合成中必不可少。抑菌圈实验表明基因bagJ敲除菌株较野生菌株对bagremycins更加敏感;BagJ在Streptomyces lividans TK64中异源表达后使该菌株对bagremycins的耐受性增强,证明bagJ是新型抗生素bagremycins的抗性基因。扫描电镜的结果证明了BagJ异源表达后导致Streptomyces TK64的菌丝形态发生了改变。其他抗生素的敏感性实验表明,BagJ可能是一个逆向转运蛋白。     

生物钟基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫调节中的作用研究进展

生物钟广泛存在于生物体,调节生物的生长发育。随着生物钟分子机制的逐步明确,学者发现生物钟基因Rev-erb和ROR参与许多生理过程,并在抗炎及免疫调节过程中发挥重要作用。针对该类受体的靶向研究可用于调控机体免疫。该文重点介绍生物钟基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫调节中的作用,包括该受体的相关作用机制及针对该受体的配体研究。     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的 建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系,并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法 通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列,并构建Cas9-MAD2L1载体,将该载体转染到NIH/3T3细胞中,通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后,提取细胞转染后的基因组DNA,利用PCR方法,结合T7E1分析和桑格尔测序,鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况,并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果 将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞,PCR结合T7E1结果显示,以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物,可被酶切成166 bp和62 bp片段,测序结果显示,成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑,脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论 成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系,设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

SFRP1、LINE1基因启动子区CpG岛甲基化状态在肝细胞癌预后评估的价值

目的 探讨分泌型卷曲相关蛋白（SFRP）1、长散在核元件（LINE）1基因启动子区CpG岛甲基化与人原发性肝癌( 简称肝癌)临床病理参数的关系,及其在肝癌预后评估的意义。方法 收集105例肝癌患者血浆和50例对照健康人血浆DNA,使用甲基化特异性PCR（MSP）检测了SFRP1基因启动子区CpG岛高甲基化和LINE1基因启动子区CpG岛低甲基化的情况;分析两种基因启动子甲基化和肝癌患者临床病理参数之间的关系;通过Kaplan-Meier曲线、对数秩检验及Cox多因素分析,分析SFRP1、LINE1基因甲基化状态与肝癌患者总生存率及无病生存率之间的关系。 结果 105例肝癌患者血浆中SFRP1基因启动子区CpG 岛高甲基化阳性率为59.05 % (62/105),LINE1基因启动子区CpG岛低甲基化率为66.67%（70/105）,基因SFRP1高甲基化和LINE1低甲基化表达均阳性为43.81% (46/105),正常对照组中未发现有这两种基因甲基化;SFRP1高甲基化、LINE1低甲基化均与HBsAg是否阳性及甲胎蛋白（AFP）值相关(P<0.05);SFRP1、LINE1基因启动子区域的甲基化状态与总生存率及无病生存率有关：SFRP1高甲基化阴性+LINE1低甲基化阴性组患者预后最好,而SFRP1高甲基化阳性+LINE1低甲基化阳性组患者预后最差。结论 SFRP1、LINE1基因启动子区CpG岛甲基化与肝癌的发生、发展有一定联系,SFRP1和LINE1基因甲基化状态可以作为潜在可靠的分子标记物对患者预后进行预测。     

利用吗啉代寡核苷酸技术下调早期斑马鱼胚胎lmna基因的初步研究

目的利用吗啉代寡核苷酸技术建立下调斑马鱼lmna基因的技术方法。方法在斑马鱼lmna基因序列中选择靶点,设计针对斑马鱼lmna基因的吗啉代寡核苷酸序列(lmna-MO),构建能特异指示lmna基因表达的lmna-EGFP-pCS~(2+)重组质粒,并通过显微注射方式将二者共注射入斑马鱼胚胎中,通过观察胚胎中绿色荧光表达量反应lmna基因表达量,并通过蛋白质印迹法检测胚胎中lamin蛋白表达量。结果蛋白质印迹法检测斑马鱼体内lamin蛋白的表达,分别有大小为69 KD和62 KD两种蛋白表达。设计并构建了lmna-MO和重组质粒lmnaEGFP-pCS~(2+),单独注射lmna-EGFP-pCS~(2+)质粒后观察到从6 hpf到96 hpf胚胎均有绿色荧光蛋白表达;二者共注射后观察到,与对照组相比,实验组从6 hpf至30 hpf胚胎中绿色荧光蛋白表达量均不同程度下降或消失;蛋白质印迹实验结果显示实验组胚胎内lamin蛋白表达量明显下降。表明已成功下调了斑马鱼胚胎lmna基因表达。结论可通过lmna-MO和重组质粒lmna-EGFP-pCS~(2+)共注射方法下调斑马鱼lmna基因表达,并通过绿色荧光蛋白表达量反映下调效果。该方法可为深入研究人核纤层病提供良好的动物模型。     

高原人群CYP2C9和VKORC1基因多态性及其与华法林用药剂量的相关性研究

目的 探讨高原人群基于中国人群华法林用药剂量计算公式（PRC模型）和国际华法林遗传药理学协会推荐的亚裔人群华法林剂量计算公式（IWPC模型）两种模型预测剂量的准确性及其临床应用价值。方法 回顾性分析曲靖市第一人民医院2016年10月—2020年1月375例行华法林代谢基因多态性检测患者的临床资料。通过qRT-PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性,记录患者基本信息和临床用药情况,采用两种模型计算预测剂量并分析其与维持剂量［国际标准化比值（INR）稳定维持在2.0～3.0范围内时所服用的华法林剂量］的相关性,评估两模型预测的准确性。结果 在实际治疗过程中患者是否选择服用华法林进行抗凝,通常与患者的性别、身高、吸烟史、是否合并房颤、是否注射低分子肝素钙无关,而与患者年龄、体重、体表面积（BSA）、初INR、是否置换主动脉瓣膜、是否服用阿司匹林、利伐沙班或氯吡格雷相关。375例患者CYP2C9和VKORC1基因频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,其中CYP2C9基因*1/*1（AA）、*1/*3（AC）及*3/*3（CC）基因型频率分别为93.07%（349/375）、6.93%（26/375）和0.00%（0/375）,VKORC1-1639基因AA、AG和GG基因型频率分别为82.66%（310/375）、16.27%（61/375）和1.07%（4/375）。无论是使用PRC还是IWPC模型,除CYP2C9*1/*1 & VKORC1AA（n =289）组与CYP2C9*1/*3 & VKORC1AG（n =5）组预测剂量的差异无统计学意义（P >0.05）外,其他所有基因型组预测剂量两两比较均有差异（P <0.05）。在收集到维持剂量的174例患者中,CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AG和CYP2C9*1/*1 & VKORC1 GG组维持剂量分别为［（3.41±1.01）mg,n =30］和［（4.75±0.35）mg,n =2］,均高于CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AA组［（2.59±0.73）mg,n =136］（P <0.05）;CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AA组维持剂量为［（2.00±0.53）mg,n =5］,低于其他基因型组合（P <0.05）。PRC和IWPC模型预测准确性分别为72.99%（127/174）和62.64%（109/174）;Pearson相关系数（r₁ =0.546,r₂ =0.567）;决定系数（R₁²=0.298,R₂²=0.322）。两个模型预测剂量间无差异（r =0.839,P >0.05）。结论 携带CYP2C9*3等位基因的患者对华法林更敏感,所需华法林剂量较低,而携带VKORC1-1639 G等位基因的患者需要更高剂量的华法林才可以获得有效的抗凝疗效。基因组学预测剂量可为临床使用华法林剂量提供依据,提高抗凝治疗的安全性和有效性。     

GATA-2基因高表达在AML1/ETO阳性急性髓系白血病中的临床意义

目的 探讨GATA-2基因在AML1/ETO融合基因阳性急性髓系白血病M2（acute myeloid leukemia with maturation,AML/M2）患者中的表达状况。方法 利用实时荧光定量PCR（RQ-PCR）法对23例AML1/ETO阳性AML-M2患者初诊骨髓标本中GATA-2基因的表达情况进行定量检测,并分析不同表达水平患者实验室检查及临床预后的差异。结果 患者GATA-2基因表达水平（GATA-2基因拷贝数/内参基因拷贝数）初诊时为2.17%~1 260.65%。将GATA-2基因表达水平≥82％者归为高表达组（10例）,表达水平＜82％者归为低表达组（13例）。高表达组与低表达组患者年龄、性别、初始白细胞计数、骨髓原始细胞比例以及化疗完全缓解（CR）率的差异均无统计学意义（P>0.05）,但复发率（71.43％ vs. 15.38％）及死亡率（70.00％ vs. 7.69％）的差异有统计学意义（P均＜0.05）,高表达组的无病生存（DFS）率及总生存（OS）率亦低于低表达组（P<0.01）。在高表达组中,选择移植（2/10）者均无复发存活,选择单纯化疗（8/10）的患者7例死亡。结论 AML1/ETO阳性AML-M2患者合并GATA-2基因高表达提示患者易复发且预后不良,此类患者应尽早采取常规化疗以外的其他有效治疗措施。     

两种蟾蜍EDF-1 cDNA的克隆及其生物信息学分析

蟾蜍皮肤基源的中药材(如蟾皮和蟾酥),已长期应用于临床,主要治疗炎症、疼痛以及多种肿瘤。为分析这些蟾蜍中药材中含有的多肽类有效成分,通过菌落DNA聚合酶链式反应(colony polymerase chain reaction)对日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)皮肤cDNA质粒文库进行筛选,克隆到958 bp的转录子(GenBank accession number:KF769458),包括5′端13 bp、3′端498 bp的非翻译区和447 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码由148个氨基酸残基组成的蛋白质,与人及其他动物的内皮分化相关因子-1(endothelial differentiation- related factor-1,EDF-1)显示高度同源性。为分析中华大蟾蜍(B.gargarizans)皮肤中是否存在EDF-1的表达,在日本蟾蜍cDNA序列的基础上设计引物,并以中华大蟾蜍皮肤第一链cDNA为模板,通过PCR克隆中华大蟾蜍EDF-1 ORF。测序分析表明其ORF为447 bp(GenBank accession number:KF769459),与日本蟾蜍的ORF长度相同,两者编码的蛋白之间存在3个氨基酸的差异,但与人源EDF-1的相似性均为95%,与其他动物的相似性介于93%~97%,表明其在进化上的高度保守性。磷酸化位点预测显示9个潜在的磷酸化位点,与已报道的该蛋白的生物学活性受上游因子的调控的研究结果相吻合。由于哺乳动物的EDF-1参与抑制内皮细胞的分化,因此它很可能是蟾蜍皮肤基源的中药材中含有的抗肿瘤的有效成分之一。     

水仙醇提物对斑马鱼胚胎黑色素合成的抑制作用

目的 以斑马鱼为模型,重点研究水仙鳞茎的醇提物对斑马鱼黑色素合成的抑制效应。方法 将斑马鱼胚胎暴露在0、50、100、200、500 μg/mL不同浓度的水仙花醇提物中,观察其黑色素生成情况,并进一步测定体内黑色素合成通路关键蛋白酪氨酸酶的酶活性变化和其他标记基因的时空表达,同时以200 μg/mL的熊果苷（arbutin,Ar）处理组为阳性对照。结果 定性观察表明,随着水仙提取物处理浓度的增加,对斑马鱼黑色素合成的抑制明显增强;进一步检测黑色素合成相关基因的时空表达,证明了水仙醇提物通过抑制酪氨酸酶（TYR）、银色毛发（SILV）和Mitfa等基因的mRNA表达而抑制黑色素合成;最后,通过检测酪氨酸酶的酶活性,发现随着醇提物浓度的增加导致酶活性逐渐降低。结论 水仙醇提物能有效地抑制斑马鱼胚胎黑色素的生成,同时该研究也为斑马鱼模型在天然美白化合物筛选和产品开发的应用提供了研究基础和思路。     

胰腺癌石蜡包埋组织中微RNA原位杂交检测技术的优化

目的 对采用原位杂交检测10%中性甲醛溶液固定的石蜡包埋（FFPE）胰腺癌组织切片中微RNA（miR）的方法进行技术优化,以提高miR的阳性检出率。方法 将20例胰腺癌组织标本构建成组织芯片,使用锁核酸（LNA）标记的探针和显色原位杂交技术检测miR-21和miR-34a的表达。杂交温度分别设为48℃、53℃、56℃,杂交后采用3种不同的洗涤条件（温度、时间和3种不同洗涤缓冲液）进行杂交条件优化。将126例胰腺癌组织标本制成组织芯片,采用优化的显色原位杂交技术检测miR-21和miR-34a的表达。结果 miR-21探针最佳杂交条件为杂交温度53℃下杂交6 h,使用洗涤缓冲液Ⅲ在65℃下洗涤6 min,再用PBS洗涤1 min;miR-34a探针最佳杂交条件为杂交温度53℃下杂交6 h,使用洗涤缓冲液Ⅲ分别在4℃和65℃下洗涤6 min,再用PBS洗涤1 min。在126例胰腺癌组织中,84例（66.7%）miR-21表达阳性,77例（61.1%）miR-34a表达阳性。结论 在FFPE胰腺癌组织切片中,miR-21和miR-34a的最佳杂交温度均为53℃,选择合适的杂交后洗涤温度和洗涤缓冲液有利于提高miR的阳性检出率。     

斑马鱼肿瘤异种移植模型在抗癌药敏感性评价中的应用

目的应用人类肺癌、胃癌和肝癌细胞斑马鱼异种移植模型,分别评价5种临床常用抗癌药的体内敏感性。方法分别建立斑马鱼肺癌A549、胃癌SGC-7901和肝癌Hep G2异种移植模型,顺铂、紫杉醇、长春瑞滨、恩度和贝伐单抗设计3个剂量分别处理斑马鱼肺癌A549移植模型,紫杉醇、伊立替康、羟基脲、顺铂和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)设计3个浓度或剂量分别处理斑马鱼胃癌SGC-7901移植模型,阿霉素、吉西他滨、羟基脲、顺铂和5-氟尿嘧啶设计3个浓度或剂量分别处理斑马鱼肝癌Hep G2移植模型。实验结束后,使用荧光显微镜进行体内肿瘤定量图像分析,计算药物对斑马鱼体内肿瘤生长抑制率,通过与模型对照组相比,分析是否具有统计学意义。结果受试的抗肿瘤药物在斑马鱼肿瘤异种移植模型中均有效,并且基本都呈剂量依赖性。在抗肺癌A549药敏试验中,药效从高到低分别为贝伐单抗(65%)顺铂(55%)长春瑞滨(40%)恩度(39%)紫杉醇(27%);在抗胃癌SGC-7901药敏试验中,药效从高到底分别为羟基脲(46%)5-FU(31%)=伊立替康(31%)紫杉醇(26%)顺铂(24%);在抗肝癌Hep G2药敏试验中,药效从高到底分别为顺铂(64%)羟基脲(56%)吉西他滨(46%)阿霉素(45%)5-FU(38%)。结论斑马鱼肿瘤异种移植模型适合用于抗癌药体内药敏试验。     

三七总皂苷离子敏感型鼻用原位凝胶的制备

目的 制备离子敏感型三七总皂苷（PNS）鼻用原位凝胶。方法 以去乙酰结冷胶为材料,采用旋转黏度计测定溶液-凝胶相转变特性筛选处方;采用HPLC法测定PNS中人参皂苷Rg₁,并以不同动物模型对制剂进行安全性评价。结果 离子敏感型原位凝胶的黏度随着去乙酰结冷胶质量分数的增加而上升,加入模拟鼻液后形成具有一定强度的凝胶。该制剂的pH值为6.0～6.5,人参皂苷Rg₁在0.2～50 μg/mL线性关系良好（r＝0.999 5）,平均回收率为101.72%,RSD为1.74%。本制剂能延长药物与鼻黏膜的接触时间。结论 该制剂制备工艺简便,性质稳定,安全无明显刺激性,在PNS鼻腔给药方面表现出良好的发展潜力。     

菘蓝rDNA及端粒多色荧光原位杂交分析

目的 对菘蓝45S rDNA、5S rDNA和端粒进行物理定位,并分析其核型。方法 使用多色荧光原位杂交技术（FISH）进行定位。结果 菘蓝基因组有一对45S rDNA位点位于4号染色体,一对5S rDNA位点位于5号染色体,14对端粒信号位于染色体两端;核型公式为2n＝2x＝14＝10m（2SAT）＋4sm,属2A核型。结论 为菘蓝核型分析、分子细胞遗传图谱构建提供了稳定、有效的细胞学标记。     

云南黄果冷杉的化学成分

采用硅胶、凝胶、反相柱色谱等各种色谱技术对云南黄果冷杉Abies ernestii var.salouenensis干燥枝叶80%乙醇提取物进行分离纯化,共得到13个化合物,根据理化数据对照及波谱学方法,分别鉴定为:(7S,8S)-3-甲氧基-3′,7-环氧-8,4′-氧化新木脂素-4,9,9′-三醇(1),isomassonianoside B(2),8,8′-二羟基松脂素(3),莽草酸正丁酯(4),对羟基苯甲酸(5),莽草酸(6),咖啡酸(7),阿魏酸二十四醇酯(8),苯甲酸(9),芹菜素-8-C-α-L-鼠李糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷(10),丁香亭-3-O-芸香糖苷(11),5-羟基-3,4′,7-三甲氧基黄酮(12),4′,5-二羟基-3,7-二甲氧基-6-甲基黄酮(13)。所有化合物均首次从该植物中分离得到,其中化合物1~4,6,10~12为首次从该属植物中分离得到。