ptges3a基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼前列腺素E合酶3a(prostaglandin E synthase 3a,ptges3a)基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的ptges3a RNA反义探针,整胚原位杂交研究ptges3a在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果 ptges3a在shield期前普遍性表达,10体节期在后脑神经龙骨处有特异性表达,18体节期在后脑有特异性表达,在26 hpf时期头部表达较多,并且在肾小管有特异性表达,36 hpf ptges3a在头部较高表达。结论 ptges3a可能参与了脑部发育和肾小管形成。     

Rap1基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的时空表达谱研究

目的：选择斑马鱼作为实验动物模型,研究Rap1基因在胚胎早期发育过程中的时空表达规律。方法从斑马鱼胚胎cDNA中克隆Rap1基因片段,将Rap1基因片段和pCS2＋质粒进行体外连接重组,重组质粒经双酶切、菌落聚合酶链反应（PCR）及测序鉴定正确后,经T3RNA体外转录体系合成DIG标记的Rap1基因反义mRNA探针,采用整胚原位杂交方法检测Rap1在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达情况。结果在斑马鱼胚胎0．75 hpf的细胞分裂连接处、3．70 hpf和6．00 hpf的动物极、12．00～72．00 hpf的脊索神经部位均可见Rap1基因的阳性杂交信号。结论 Rap1基因在斑马鱼脊索神经系统的早期发育过程中可能起到重要的调控作用。     

COX基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼COX-1、COX-2a基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取24 h斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的COX-1、COX-2a RNA反义探针,整胚原位杂交研究COX-1、COX-2a在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达。结果 COX-1在囊胚期和原肠胚期为弥散性表达,18 h集中表达在后部躯干,到24 h,COX-1在输尿管和远端脊索处有表达,24～36 h,头部表达量高,48 hCOX-1的表达弱。COX-2a在原肠胚期前不表达,在10.8 h开始表达,位于前端神经外胚层,在26 h,COX-2a在前脑、小脑和后脑有特异性表达。结论明确了COX-1、COX-2a基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,为研究该基因功能提供了一定的理论基础。     

Nodal信号通路相关基因NOMO1在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的:研究斑马鱼NOMO1基因在早期胚胎发育过程中的时空表达情况?方法:首先克隆斑马鱼NOMO1同源基因全长cDNA,然后运用半定量RT－PCR技术初步检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎的表达情况,最后通过原位杂交技术检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的时空表达情况?结果:通过半定量RT－PCR及原位杂交技术显示NOMO1从受精卵时期开始即有表达,在24 hpf(受精后24 h)之前,NOMO1基因表达广泛,并主要集中在中?内胚层?从24 hpf开始其表达主要集中于神经系统如前脑?中脑?小脑?脊索前板?眼和耳囊等处?在心脏处也有少量表达?结论:NOMO1基因对斑马鱼早期胚胎发育具有一定的作用,推测NOMO1基因影响早期心脏发育?     

Lrrc15在斑马鱼胚胎血管发育中的作用

目的：探究Lrrc15基因在斑马鱼胚胎发育中的表达及其在血管发育中的作用。方法：采用全胚胎原位杂交技术检测Lrrc15基因在斑马鱼胚胎发育过程中的时空表达谱,显微注射吗啉修饰的反义寡核苷酸（morpholino oligos,MO）至内皮细胞被特异标记的转基因斑马鱼中下调Lrrc15的表达,利用共聚焦显微成像技术观察和分析胚胎血管发育的变化。结果：在受精后19、24、36和48 h均检测到Lrrc15基因在斑马鱼尾静脉丛的表达,受精后24 h表达最高。下调Lrrc15的表达导致斑马鱼尾静脉丛发育缺陷。结论：Lrrc15基因在斑马鱼胚胎发育中主要参与调控尾静脉丛形成,该基因的缺陷可导致尾静脉丛发育异常,提示Lrrc15基因在血管发育尤其是血管新生中的重要性,可为今后肿瘤治疗提供潜在的靶点。     

氯丙嗪在斑马鱼胚胎和早期幼鱼发育过程中的神经毒性作用

目的 采用模式动物斑马鱼作为研究对象,观察氯丙嗪(chlorpromazine,CPZ)暴露对胚胎和幼鱼早期神经发育的影响.方法 在一般毒性评价的基础上,通过整体胚胎细胞凋亡检测和脑组织病理学检查,了解CPZ对神经发育的器质性改变;采用神经行为学方法,包括幼鱼触动逃避反应、自发运动以及惊恐逃避反射等,研究氯丙嗪暴露所致的神经发育功能性障碍.结果斑马鱼胚胎受精后6 h(6 hpf)～72 hpf暴露于CPZ(≥5 mg/L)可引起胚胎和幼鱼死亡、致畸和幼鱼孵化延迟,并呈浓度和时间依赖性;采用吖啶橙染色检测36 hpf整体胚胎凋亡细胞,发现凋亡细胞主要集中在胚胎中脑、后脑、丘脑以及中后脑连接区、脊索和尾部等处;脑组织病理学检测发现,7dpf幼鱼颅腔增大、脑体积减小、脑细胞缩小且细胞间隙增宽.6～72 hpf CPZ(≥0.0625 mg/L)暴露后,幼鱼神经行为学研究发现,CPZ(≥0.125 mg/L)可引起3dpf幼鱼触觉运动能力下降;CPZ(≥0 5 mg/L)可浓度依赖性地抑制幼鱼自发运动,并出现僵直不动、震颤或快速刻板式转圈运动等行为改变;光惊恐实验中,暗环境下各暴露组幼鱼对突发强光刺激均表现为惊跳逃避,并且暗-光交替期运动加速度变化与对照组无显著差异;在撤除光源后,1mg/L和2 mg/L暴露组幼鱼暗适应时程缩短,而0.125 mg/L和0.25 mg/L暴露组暗适应时程延长,提示CPZ对外界刺激引发的幼鱼活跃游动有抑制和促进双重毒性作用.结论 CPZ暴露对斑马鱼胚胎和幼鱼具有明显的神经发育毒性作用.模式动物斑马鱼作为一种高通量筛选模型在外源性化合物神经发育毒性评价中具有较好的应用前景.     

HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的 探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础.方法 提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3 RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交.结果 构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达.结论 得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础.     

背腹轴线形成的机制及其临床意义

胚胎背腹轴线的建立是早期胚胎发育形成过程中的关键步骤, 其分子机制代表着细胞分裂与分化的核心问题。自文艺复兴以来,人们对背腹轴线形成机制的探索,使我们对疾病的致病机制有了更加深入的了解,本文就其进展及其在肿瘤等方面的潜在意义进行讨论。     

Polycomb家族基因Nspc1在斑马鱼早期发育的表达

目的探讨Polycomb家族基因Nspc1在模式生物斑马鱼发育早期的表达模式。方法根据GenBank中斑马鱼Nspc1的cDNA序列设计Nspc1原位杂交探针片断,并制备地高辛标记的探针。收取单细胞期、双细胞期、胚芽期及不同时间点的体节期斑马鱼胚胎,用制备好的探针作原位杂交,显微镜下拍照,获得信号适当的杂交结果。结果在斑马鱼体节期前,Nspc1在全身表达;从体节期开始,其表达逐渐表现出特异性,主要在头部的神经系统中表达。结论Nspc1在模式生物斑马鱼的早期发育、尤其是神经系统发育的过程中可能扮演重要角色。     

hoxb4转基因斑马鱼造血发育中rap1b基因的表达

目的 为了发现在早期造血发育中关键的调控因子,利用hoxb4转基因斑马鱼研究rap1b基因的表达变化情况,以期明确hoxb4与rap1b在早期造血发育中的关系.方法 选取过表达hoxb4的斑马鱼系为研究对象,分为3组:实验组(表达hoxb4-EGFP的斑马鱼),实验对照组(表达EGFP的斑马鱼),空白对照组(野生型斑马鱼).通过流式分选技术将实验对照组和实验组18hpf(斑马鱼胚胎受精发育18h)、24、30、36、48hpf胚胎中带有绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信号的细胞分选出来,利用实时荧光定量PCR检测分选出的细胞中的rap1b基因的表达变化;然后收集野生型斑马鱼多时相胚胎,制备rap1b基因的反义mRNA探针,通过胚胎原位杂交观察探针在3组斑马鱼胚胎18、24、30、36、48hpf杂交信号表达部位.结果 qRT-PCR结果显示实验组30、36、48hpf的斑马鱼胚胎的rap1b基因的表达明显增强(P＜0.05);制备了rap1b基因的反义mRNA探针,胚胎整体原位杂交结果显示:rap1b基因在3组斑马鱼胚胎18 ～ 48 hpf之间神经发育和造血发育部位都有表达.结论 在过表达hoxb4转基因斑马鱼中rap1b基因表达有明显的升高趋势,提示rap1b基因与hoxb4基因可能共同参与调节早期造血发育过程.     

基于斑马鱼胚胎进行化学品毒性评价的方法

目的 建立应用模式生物斑马鱼胚胎进行化学品毒性鉴定的方法。方法 将健康亲代成熟斑马鱼进行交配产卵,产卵后收集斑马鱼胚胎,于受精后6 h将斑马鱼胚胎暴露于梯度浓度的甲醛(0、0.005%、0.010%、0.012%、0.014%、0.016%、0.018%、0.020%)、乙醇(0、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%)、三氯异氰尿酸(0、2μg/m L、4μg/m L、6μg/m L、8μg/m L、10μg/m L、12μg/m L、14μg/m L、16μg/m L、18μg/m L、20μg/m L)、甲醇(0、0.6%、0.9%、1.4%、2.0%、3.0%、4.5%),在暴露后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h观察斑马鱼胚胎的死亡情况。结果 甲醛、乙醇、三氯异氰尿酸、甲醇暴露后,随着剂量的升高,斑马鱼胚胎在各观察时间点出现死亡明显升高,甲醛、乙醇、三氯异氰尿酸、甲醇对受精后6 h斑马鱼胚胎的96 h LD50分别为0.001 6 mol/L、0.333 0 mol/L、7.514 0μg/m L、0.401 0 mol/L。结论 斑马鱼胚胎可用于化学品暴露的安全性评价,应用模式生物斑马鱼胚胎进行化学品毒性鉴定是未来可发展的毒理学替代方法之一。     

CRISPR/Cas9技术敲除faf1基因对斑马鱼软骨及肌节发育的影响

目的 利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼faf1基因,并研究faF1基因对斑马鱼发育的影响.方法 针对斑马鱼faf1基因设计并制备gRNA,通过显微注射技术将gRNA与Cas9 mRNA混合注入斑马鱼单细胞胚胎中,通过酶切和基因测序技术筛选出发生突变的F0代斑马鱼,将其与野生型斑马鱼外交得到F1代杂合体斑马鱼,检测其可遗传突变类型,并用显微镜观察、记录每一代斑马鱼表型.结果 成功制备了faf1 gRNA和Cas9 mRNA.位于faf1 6号外显子的gRNA(gRNA6)能使faf1基因发生移码突变.筛选出可遗传突变类型(mutant 1,MU1)并观察到该杂合突变型斑马鱼有体细胞色素沉积延迟,受精后第4天开始尾部肌节出现“结节样”表型以及头颅缩小、舌骨小角角度增大等颅面软骨畸形的变化,并于受精后8～9d死亡.结论 利用CRISPR/Cas9敲除该基因产生了新的表型,即色素沉积延迟及尾部肌节部位出现“结节样”变化.     

hand2基因对斑马鱼胚胎发育影响的实验研究

  目的 观察hand2在斑马鱼胚胎内的表达情况,验证显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸（Morpholino oligonucleotides,MO）使hand2 表达下调的有效性。观察hand2 表达下调后斑马鱼胚胎发育的异常表型,初步探讨hand2在斑马鱼胚胎发育中的作用,为利用斑马鱼开展hand2的功能研究提供线索。 方法 采用胚胎整体原位杂交的方法观察hand2在斑马鱼胚胎内的表达情况。利用向斑马鱼受精卵显微注射MO的方法使hand2 表达下调,并进行hand2 表达下调的效率验证。将斑马鱼单细胞受精卵分为四组进行显微注射,即对照MO（Con MO）注射组、hand2 MO注射组、hand2-GFP mRNA注射组和hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组。在荧光显微镜下观察hand2-GFP mRNA注射组和hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组的荧光表达情况以验证hand2 表达下调的效率。在显微镜下观察hand2 MO注射组斑马鱼胚胎的各器官发育情况并进行评定。 结果 hand2在斑马鱼胚胎的侧板中胚层、咽弓、心脏和鳍有较强表达。hand2-GFP mRNA注射组在8hpf（hours post fertilization）时胚胎有较强的荧光表达,而hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组胚胎几乎无荧光表达。与Con MO注射组相比,hand2 MO注射组斑马鱼胚胎的心脏、血管、血细胞、鳍以及体节有明显的发育异常。 结论 向斑马鱼受精卵显微注射hand2 MO的方法可有效的使 hand2表达下调。hand2 在斑马鱼胚胎的心脏、血管、血细胞、鳍以及体节的发育过程中有重要作用。     

细辛脑对斑马鱼胚胎发育及运动行为的影响

目的：研究细辛脑对斑马鱼胚胎发育及运动行为的影响。方法以受精后3h（hpf）斑马鱼胚胎为实验模型,分别暴露于不同浓度（25、50、100、200和400μmol/L）细辛脑溶液中,以不加细辛脑为对照组,每隔24 h更换1次细辛脑溶液,分别在24、48、72和96 hpf等时间点用显微镜观察班马鱼胚胎发育形态,记录24 hpf胚胎自主抽动次数,48 hpf心率、畸形率和死亡率,72和96 hpf孵化率和死亡率,利用RT-qPCR检测96 hpf斑马鱼胚胎Sepn1基因表达情况,采用Noldus斑马鱼幼鱼行为视频跟踪系统评价细辛脑暴露对幼鱼运动行为的影响。结果细辛脑各实验组斑马鱼胚胎自主抽动次数随浓度增加而降低,100、200和400μmol/L组与对照组相比有极显著性统计学差异（P＜0.01）;细辛脑各实验组斑马鱼48 hpf心率显著降低,与对照组相比均有显著统计学差异（P＜0.01）;72和96 hpf斑马鱼幼鱼出现了脊柱弯曲、心包水肿、卵黄囊水肿等畸形形态;与对照组相比,100、200和400μmol/L组96 hpf孵化率均下降,具有显著性统计学差异（P＜0.01）;与对照组相比,400μmol/L组死亡率降低,有统计学差异（P＜0.05）;随着细辛脑浓度增加,96 hpf斑马鱼幼鱼运动速度和距离明显减小,200和400μmol/L组与对照组相比均有统计学差异（P＜0.05）;同时200和400μmol/L浓度组活跃度降低,与对照组相比具有显著差异（P＜0.01）;96 hpf时,细辛脑各浓度组胚胎Sepn1基因表达下降,其中100μmol/L组与对照组相比有统计学差异（P＜0.05）,而200和400μmol/L组与对照组相比差异更显著（P＜0.01）。结论细辛脑对斑马鱼胚胎和幼鱼有致畸作用,并且影响其运动行为,建议婴幼儿慎用细辛脑。     

基于CRISPR/Cas9研究RFX6对斑马鱼胰腺发育的影响

目的 构建RFX6基因敲除斑马鱼动物模型及初步探究RFX6对斑马鱼胰腺发育的影响。方法 应用CRISPR/Cas9技术,设计针对靶点的gRNA,诱导靶点突变,经测序鉴定得到突变体。结果 成功构建了RFX6基因敲除斑马鱼动物模型,初步研究发现RFX6纯合突变体生长发育迟滞、体型瘦小、呈现糖尿病消瘦体型并且不能产生后代。结论 RFX6在斑马鱼胰腺的发育中占据重要地位,是控制斑马鱼胰腺发育的关键因子。     

The Retinol Dehydrogenase, RDH1l, is essential for the heart development and cardiac performance in zebrafish

中文摘要 视黄酸是在胚胎排列模式,形态发生及其后的器官形成等一系列胚胎发育过程中起着重要作用的信号因子。从视黄醇（维生素A）合成视黄酸需要两个顺序发生的氧化反应。第一个步骤是视黄醇通过视黄醇脱氢酶催化的氧化过程生成视黄醛。RDH1l是一个新发现的斑马鱼视黄醇脱氢酶。本文我们详细观察了斑马鱼RDH1l在斑马鱼心脏发育和心脏功能中的作用研究。采用RDH1l特异性吗啡啉反义寡核苷酸显微注射下调基因功能。采用整体原位杂交方法观察基因下调对基因表达模式的影响。解剖显微镜下记录斑马鱼胚胎孵化后24-72小时心率变化情况。采用心室收缩指数作为评估心脏功能的指标。 RDH1l吗啡啉寡核苷酸注射组胚胎神经嵴迁移异常和神经嵴细胞数量减低。同时RDH1l吗啡啉寡核苷酸注射组胚胎心神经嵴细胞数量减低。吗啡啉反义寡核苷酸介导的基因下调导致心脏环化异常。RDH1l基因下调胚胎左-右决定基因的表达模式发生改变。同时RDH1l基因下调胚胎心脏功能减低。这些结果说明RDH1l对于斑马鱼心脏发育和心脏功能起着重要的作用。RDH1l在神经嵴细胞的发育中起着至关重要的作用,并且最终导致心脏环化过程和心脏功能。这一结果首次表明参与视黄醇-视黄醛转化的酶在斑马鱼心脏发育过程和心脏功能中起着重要作用。