盐度对裸项栉鰕虎鱼繁殖和生长的影响

目的探索裸项栉鰕虎鱼繁殖和育苗的适宜盐度。方法比较不同盐度梯度条件下裸项栉鰕虎鱼的产卵率、孵化率和生长存活情况。结果裸项栉鰕虎鱼性腺成熟、产卵和孵化的适宜盐度为10‰-20‰，过低或过高盐度该鱼产卵量少，孵化率极低；适宜的盐度有利于裸项栉鰕虎鱼的生长。结论裸项栉鰕虎鱼适盐范围广，适宜的繁殖、生长盐度较低。     

Cu2+和十二烷基硫酸钠对裸项栉鰕虎鱼仔鱼急性毒性影响

目的研究Cu2+和SDS对裸项栉鰕虎鱼仔鱼存活率的影响,了解裸项栉鰕虎鱼的毒性敏感性。方法实验选取了五个不同日龄的仔鱼,设置了8个不同Cu2+浓度水平和7个SDS浓度水平,实验时间为96 h。结果日龄、Cu2+浓度和SDS浓度均对裸项栉鰕虎鱼仔鱼的存活率产生影响,随日龄的增加,各处理组仔鱼存活率均升高。结论实验结果表明裸项栉鰕虎鱼用于生物毒性检测,具有比同类生物更宽的适用范围、更适宜的毒性敏感性。     

裸项栉鰕虎鱼的全人工繁殖及其胚胎发育

目的 研究裸项栉鰕虎鱼全人工繁殖及胚胎发育,为该鱼的实验动物化研究奠定基础. 方法 对胚胎和仔稚幼鱼各个发育期的连续取样,系统地观察了裸项栉鰕虎鱼各发育期的形态变化及生长特征.结果 水温25.8℃～26.5 ℃,裸项栉鰕虎鱼受精后约82h仔鱼开始出膜,初孵仔鱼全长1.42～1.73 mm,1d开口摄食,3d卵黄囊消失,23d第一背鳍形成,鳞片出现;33d全身被鳞;初孵仔鱼经97d发育成熟,繁殖周期约为36 d;雌鱼性腺成熟系数可达40%,个体相对生殖力达每克8193.5粒.结论 裸项栉鰕虎鱼具有个体小、性成熟早、生殖季节长、繁殖周期短、繁殖力强等特点,可进行室内规模化人工繁殖和培育.     

盐度和pH突变对不同日龄裸项栉鰕虎鱼仔鱼存活的影响

目的 研究盐度和pH突变对裸项栉鰕虎鱼仔鱼存活率的影响.方法 实验选取了五个不同日龄(2 d、4 d、6 d、8 d和10 d)的仔鱼,设置了7个不同盐度突变水平(0、10、20、30、40、50和60)和6个pH突变水平(5、6、7、8、9和10).结果 96 h的实验结果表明,日龄、盐度和pH均对裸项栉鰕虎鱼仔鱼的存活率产生影响,随日龄的增大,各处理组仔鱼存活率升高;0和60的盐度以及pH为10的各组裸项栉鰕虎鱼仔鱼死亡.结论 裸项栉鰕虎鱼仔鱼对于一定范围内盐度(10～50)和pH(5～9)的突变具有很好的适应性.     

裸项栉鰕虎鱼消化系统组织形态学观察

目的 研究裸项栉缎虎鱼消化系统的组织形态学.方法 对裸项栉鰕虎鱼进行解剖,并测量和计算肠道系数、食道长度等数据;制作组织切片,采用光镜技术对消化系统的组织器官进行观察分析.结果 裸项栉鰕虎鱼的消化系统由消化管和消化腺组成,其中消化管包括口咽、食道、胃、小肠和大肠等,消化腺包括肝脏和胰腺.咽部上皮和食道上皮为复层扁平上皮,内有较多的杯状细胞和黏液腺,食道肌层为横纹肌.胃上皮为单层柱状上皮,胃底腺主要位于胃体部的固有层中.肠黏膜向肠腔突起形成许多皱襞,肠上皮为单层柱状上皮,上皮中有数量不等的杯状细胞.肠道系数(IC)约为0.30.胃和肠的肌层都为平滑肌.肝细胞中含有丰富的脂滴,在HE染色标本中因脂滴被溶解而呈大小不等的空泡.胰腺包括外分泌部和内分泌部,外分泌部是浆液腺,内分泌部又称胰岛,主要由内分泌细胞组成.结论 裸项栉鰕虎鱼的消化系统组织形态学与其杂食性相适应,本研究可为裸项栉鰕虎鱼的实验动物化提供支持.     

新基因mgt-16逆转录病毒载体的构建及其在小鼠间充质干细胞中的表达

目的 构建表达小鼠新基因mgt-16的反转录病毒载体,并观察其在小鼠胚胎间充质干细胞C3H/10T1/2（简称10T1/2细胞）中的表达。方法 以含小鼠新基因mgt-16的DNA序列为模板PCR扩增得到mgt-16编码序列,T-A克隆后测序获得pMD18T-16质粒,与真核表达载体pEGFP-N1酶切、连接、转化,通过PCR、酶切鉴定和测序获得正确的pEGFP-N1-16载体。将pEGFP-N1-16载体中含mgt-16的片段克隆至反转录病毒载体pLEGFP-N1,通过酶切鉴定和测序获得正确的pLEGFP-N1-16反转录病毒载体。将pLEGFP-N1-16转染反转录病毒包装细胞Phoenix,制备携带mgt-16与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的反转录病毒,感染小鼠间充质干细胞10T1/2后,400 μg/mL G418 筛选获得稳定表达mgt-16与EGFP融合蛋白的10T1/2细胞克隆。荧光显微镜观察MGT-16蛋白的表达及亚细胞定位。结果 PCR扩增得到大小约300 bp的mgt-16条带,T-A克隆后测序显示获得的mgt-16序列与Genbank数据库序列相同。构建的pEGFP-N1-16载体经PCR、酶切鉴定和测序验证构建成功,构建的反转录病毒载体pLEGFP-N1-16经酶切鉴定和测序验证构建成功。荧光显微镜观察MGT-16主要在Phoenix细胞和小鼠间充质干细胞的细胞质表达,核周表达水平较高。结论 成功构建了小鼠新基因mgt-16的反转录病毒载体,并在间充质干细胞中表达,为进一步研究新基因mgt-16在间充质干细胞中的功能奠定了基础。     

鼠三毛滴虫新疆灰仓鼠分离株形态学观察及其16S rRNA基因分析

目的 对从新疆实验动物研究中心饲养的封闭群灰仓鼠体内分离到的1株鞭毛虫进行形态学鉴定及基因鉴定。方法 取灰仓鼠回盲部内容物进行直接涂片和常规姬姆萨染色后镜检观察,提取虫体总DNA,PCR扩增该鞭毛虫的16S rRNA基因,测序后与国外已报道的鞭毛虫进行核酸同源性分析,并应用MEGA5.22软件绘制系统发育进化树。结果 形态学观察表明分离到的鞭毛虫为鼠三毛滴虫。测序后核酸同源性分析表明鼠三毛滴虫新疆灰仓鼠分离株16S rRNA序列与国外已报道的三毛滴虫高度同源。系统发育进化树表明鼠三毛滴虫新疆灰仓鼠分离株序列与已报道的鼠三毛滴虫16S rRNA（序列号AY886846.1） 位于同一进化分支,与其他相关三毛滴虫亲缘关系较远。结论 形态学鉴定和16 S rRNA基因分析表明,此次从新疆实验动物研究中心饲养的封闭群灰仓鼠体内分离到的鞭毛虫为鼠三毛滴虫。     

广藿香青枯病菌的分离培养及致病性测定

目的 分离广藿香青枯病病原菌Ralstonia solanacearum,了解其细菌学性状,并进行致病性测定,为广藿香青枯病的防治提供依据。方法 在TZC培养基 [蛋白胨 10.0 g、酸水解酪蛋白 1.0 g、TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）0.05 g、葡萄糖 10.0 g、H₂O 1 L,pH 6.8～7.0] 上划线分离培养广藿香青枯菌;通过3糖3醇试验对各菌株的生化型进行划分;采用伤根浸泡接种法对分离所得菌株进行致病性测定。结果 经分离纯化,得到在细菌学性状上有明显差异的7个青枯菌菌株。其中HX5、HX7为生化型I;HX1、HX6为生化型II;HX2、HX4为生化型III;HX3为生化型V。致病性试验表明,大部分青枯菌菌株表现较强的致病性,其中以菌株HX4和HX5致病力强且致死率高。结论 广藿香青枯病菌存在多个生理小种,在菌体形态、生化分型和致病性等方面均有一定的差异。     

基于16s rRNA高通量测序分析糖尿病足骨髓炎感染骨组织中的病原微生物

目的 利用16s rRNA高通量测序技术分析糖尿病足骨髓炎(DFO)感染骨组织中病原微生物特点,为临床感染病原菌的鉴定及治疗提供快速、准确的方法.方法 收取2016年9月~2017年4月于本科室住院的16例DFO患者清创术中获取的感染骨标本,分别利用16s rRNA高通量测序技术和血培养分析仪进行病原微生物的鉴定,分析16s rRNA测序结果中DFO的菌群特点,并与培养结果相比较.结果 16s rRNA测序显示DFO骨组织病原微生物多样性较大,分布较为均匀,共获得优势菌属20种,占所有菌属的87.00%,其中Prevotella是丰度最大的菌属.两种鉴定方法结果均显示DFO病原菌以革兰氏阴性菌为主.与培养法相比,16s rRNA测序阳性率较高(100%vs 88.24%),平均每个样本病原菌数较多(12.56 vs 1.50),革兰氏阴性菌所占的比例较高(67.16%vs 50.00%).此外,16s rRNA测序结果覆盖了除Escherichia coli、Serratia marcescens及Enterobacter cloaca外的所有培养病原菌结果,甚至有高达13种菌属不存在于培养结果,其中Anaerococcus、Veillonella、Bacteroides、Fusobacterium、Porphyromonas、Finegoldia、Prevotella、Peptostreptococcus、Parvimonas、Peptoniphilus和Bulleidia均为专性厌氧菌或严格厌氧菌,而培养结果中并无厌氧菌的出现.但培养结果显示,DFO中多重耐药菌的比例高达58.33%.结论 16s rRNA高通量测序能较好展示DFO骨组织中菌群微生态的多样性及丰度特点.DFO骨组织病原微生物多样性大,分布均匀,但优势菌属分布离散,以革兰氏阴性菌为主.与培养法相比,16s rRNA测序对病原菌的鉴定简单而准确,尤其在对革兰氏阴性菌和厌氧菌鉴定方面有显著的优势,可快速而准确地指导DFO感染治疗.     

SPF级新西兰兔脏器参数、血液指标、心率、颈动脉血压、心室压的测定与比较

目的 准确测定SPF新西兰兔生物学特性尤其是疾病相关的指标, 并进行性别间比较。方法 取70~80日龄左右SPF新西兰兔30只, 饲养1周后, 精确称量体重及主要脏器重量;采集动脉血测定血液生理、生化、血气指标;颈动脉插管测定动脉压, 呼吸支持情况下进行开胸测定心室压。结果 雄性与雌性新西兰兔比较: 甲状腺、肾上腺、肝的质量差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01);脑、脑垂体、甲状腺的脏器系数差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01);甲状腺、肾上腺、肝的脏脑比系数差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。红细胞平均体积、平均血红蛋白量的差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01);谷氨酰转肽酶、淀粉酶的差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01);血气分析、心率、颈动脉收缩/舒张压, 左心室收缩/舒张压, 右心室收缩/舒张压不存在性别间差异。结论 性别对新西兰兔脏器重量及血液生理生化指标有一定影响, 而血气、血压、心率及心室压指标不存在性别间差异。     

16S rRNA在肉毒梭菌分型鉴定中的应用

目的建立一种快速、可靠的对肉毒梭菌进行分型鉴定的手段。方法以从LCL063、830110、LC175、LCL155、66418、N153、61082、ALASKA、IWANAI共9株梭菌中提取的基因组DNA为模板,利用16SrRNA特异性引物分别进行PCR扩增并进行T-A克隆转化、测序。通过Clustal和Mega软件分析16SrDNA序列,以NJ法和MP法构建进化树,分析其种属特异性。结果 16SrRNA分型结果可判断出LCL063、830110、LCL175为产E型毒素的酪酸梭菌。IWANAI与ALASKA株为E型肉毒梭菌。与传统分型鉴定得到的结果一致。结论 16SrRNA在肉毒梭菌分型鉴定中具有快速、准确的优势,随着核糖体库的不断完善,有望成为细菌分型鉴定的标准依据。     

中国实验动物中鼠管状线虫的分子鉴定和感染调查

目的对鼠管状线虫进行分子鉴定和感染调查,为国家标准的修订提供参考依据。方法 923批5199只SPF动物(包括:1批5只猴,3批25只小型猪,28批55只兔,13批248只地鼠,37批198只豚鼠,93批459只大鼠,742批4179只小鼠,5批25只鸡和1批5只鸭)和145批1389只清洁动物(包括:1批3只兔,4批31只地鼠,16批157只豚鼠,32批268只大鼠和92批930只小鼠)来自全国50个不同的厂家。应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术结合形态学鉴定方法,进行鼠管状线虫感染筛查。应用多重PCR和测序技术,鉴定分离的鼠管状线虫ITS(内转录间隔区)、28S rRNA(28S核糖体RNA)、nad1(NADH脱氢酶亚单位1)和cox1(细胞色素C过氧化物酶亚基1)基因,从分子水平上确证鼠管状线虫感染。结果应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术,从动物中检出鼠管状线虫的虫卵、幼虫和成虫。根据鼠管状线虫的卵细胞、幼虫、雌雄成虫的大小和形态来鉴定虫种。应用多重PCR测序技术,能从分离的单个鼠管状线虫的虫卵、幼虫和成虫中鉴定出ITS、28S rRNA、nad1和cox1基因,与其他不同种属的寄生虫无交叉反应。应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术,从5199份SPF和1389份清洁动物样本中分别检出鼠管状线虫阳性样本285份和135份。应用多重PCR和测序技术,鉴定证明这些阳性样本中确实含有鼠管状线虫特异性的DNA。测序结果显示,不同动物分离的鼠管状线虫的ITS、28S rRNA、nad1和cox1部分基因序列核苷酸相似性达100%。SPF和清洁动物的鼠管状线虫感染率分别为5.5%(285/5199)和9.7%(135/1389)。结论应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术联合多重PCR测序技术能够快速精准检测鉴定出鼠管状线虫。鼠管状线虫的人兽共患本质可以视作为公共卫生的一个预警。良好的动物质量控制对保护人类身体健康和保障人民用药安全具有重要作用。本研究对中国SPF和清洁动物的鼠管状线虫进行了分子鉴定和感染调查。     

Comparison of IS6110 and ‘short fragment’ devR (Rv3133c) gene targets with phenotypic methods for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis

Background

Tuberculosis (TB), declared a global emergency in 1993 by the WHO, remains a worldwide public health problem. Rapid diagnosis is required for treatment and prevention. This study compares genotypic methods using two gene targets [IS6110 and 'short fragment' devR (Rv3133c)] with phenotypic methods [Lowenstein Jensen (LJ) and BACTEC 460] for the diagnosis of TB while using Ziehl Neelsen (ZN) staining as the gold standard.

Methods

56 clinical TB samples from a tertiary care apex center along with 50 healthy control samples, excluding samples from patients already on ATT were processed by routine USP methodology. Smears were graded by ZN stain. Solid media (LJ) and liquid media (BACTEC 460) were used along with IS6110 and 'short fragment' devR (Rv3133c) specific gene amplification and comparatively analyzed.

Results

50/56 samples were positive by phenotypic methods, 53 by IS6110 and 45 by devR (Rv3133c) amplification. 38 samples were positive by both phenotypic and genotypic methods. IS6110 detected six and devR (Rv3133c) detected five phenotypically negative samples. Both IS6110 and devR (Rv3133c) were positive in 42 samples. 11 devR (Rv3133c) negative samples were positive by IS6110 and three IS6110 negative samples were positive by 'short fragment' devR (Rv3133c). Compared to phenotypic methods, the sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of IS6110 was 94%, 89.29%, 88.68% and 94.34% while that of devR (Rv3133c) was 80%, 91.07%, 88.89% and 83.61% respectively.

Conclusion

Simultaneous use of both phenotypic and genotypic methods increases the yield of positive results.     

二株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

目的 从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法 树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLC-MK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物信息学分析。结果 树鼩腹泻粪便样品在KMB17、Vero 和LLC-MK2细胞上经连续3代次传代后,均能产生细胞病变。经电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析和轮状病毒鉴别筛查,推测其为呼肠孤病毒。病毒基因组全长S1基因扩增、序列测定和分析结果表明,KMB17培养上清中获得的病毒与I型原型株T1L同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和90%,因此该病毒定义为呼肠孤病毒I型。而LLC-MK2和Vero细胞上清中的病毒S1基因与III型原型株T3D核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和92%,因此为呼肠孤病毒III型。结论 对今后树鼩和其他宿主呼肠孤病毒的分离鉴定有一定的指导意义。     

Characterization of cytotoxic compound from marine sediment derived actinomycete Streptomyces avidinii strain SU4

Objective

To investigate the cytotoxic activity of actinomycete isolated from marine sediment.

Methods

In the present study the DNA was isolated and the ITS region of 16s rRNA was amplified by polymerase chain reaction, using two universal bacterial primers, 1492R (5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′) and Eubac27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′). The amplified products were purified using TIANgel mini purification kit, ligated to MD18-T simple vector (TaKaRa), and transformed into competent cells of Escherichia coli DH5α. 16S rRNA gene fragment was sequenced using forward primer M13F (-47) and reverse primer M13R (-48). Blast search sequence similarity was found against the existing non-redundant nucleotide sequence database thus, identified as Streptomyces sp SU, Streptomyces rubralavandulae strain SU1, Streptomyces cacaoi strain SU2, Streptomyces cavourensis strain SU3, Streptomyces avidinii strain SU4, Streptomyces globisporus strain SU5, Streptomyces variabilis strain SU6, Streptomyces coelicolor strain SU 7. Among the eight identified isolates, one actinomycete Streptomyces avidinii strain SU4 was selected for further study.

Results

Crude extract of the actinomycete isolate exhibited IC₅₀ in 64.5 µg against Hep-2 cell line, 250 µg in VERO cell line. This value is very close to the criteria of cytotoxicity activity for the crude extracts, as established by the American National Cancer Institute (NCI) is in IC₅₀ < 30 µg/mL. The GC MS analysis showed that the active principle might be 1,2-benzenedicarboxylic acid, bis(2-methylpropyl) ester (12.17%), isooctyl phthalate (15.29%) with the retention time 15.642 and 21.612, respectively.

Conclusions

This study clearly proves that the marine sediment derived actinomycetes with bioactive metabolites can be expected to provide high quality biological material for high throughout biochemical and anticancer screening programs. These results help us to conclude that the potential of using metabolic engineering and post genomic approaches to isolate more bioactive compounds and make their possible commercial application is not far off.     

基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法的建立与评价

目的建立基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法,应用于实验动物沙门氏菌的检测。方法提取小鼠粪便DNA样本,分别针对16S r DNA区域、23S r DNA区域、16S~23S r DNA IS、23S~5S r DNA IS、gyr B优选区域设计通用引物,对各个引物进行测试分析,优化扩增条件并建库,利用Illumina高通量测序技术检测区分42个样本中的沙门氏菌,评价该方法的特异性和稳定性。结果筛选发现沙门氏菌的菌种分类优选区域为gyr B基因,gyr B基因引物序列为FP5’-AACCACCGCAATCAGACCTT3’,FP5’-AGCCACGAAACCTTCACYA-3’。对引物进行优化,确定最佳扩增条件及样品上样量并正式建库,通过高通量测序和序列分析能检测出42个样品中极微量的沙门氏菌,检测方法稳定,灵敏度高,检测限可达0~102的cfu。结论本实验利用高通量测序技术,建立了一套完整检测实验动物沙门氏菌的生物体系,能检测出实验动物体内极微量的沙门氏菌,检测方法稳定性好,灵敏度高,可沿用至其他种类病原微生物的检测。     

TALEN构建Fndc5基因敲除小鼠及初步分析

目的通过构建Fndc5基因敲除小鼠,为后续的研究提供动物模型。方法运用TALEN技术在Fndc5基因FNIII domain中造成缺失突变,并通过测序进行基因型鉴定。通过配对建立稳定遗传系并在mRNA和DNA水平鉴定出生小鼠基因型;对不同年龄段出生小鼠进行体重、血糖分析;通过q PCR确定Fndc5在肾脏、肝脏、大脑、肌肉、心脏等组织中的表达情况。结果成功构建并鉴定得到4种不同的Fndc5基因敲除小鼠品系;不同年龄段出生小鼠体重、血糖未见显著性差异;确定Fndc5在肌肉、心脏等组织中高表达。结论本实验在国际上成功构建了Fndc5基因敲除小鼠,并进行了初步分析,为深入研究Fndc5基因在体内中的功能提供了动物模型。     

半枝莲黄酮类化学成分分析

目的分析半枝莲黄酮类化学成分。方法采用硅胶、Sephadex LH-20等多种色谱方法,依据波谱数据对其结构进行分析和鉴定。结果半枝莲中共分离了12个化合物,分别为圣草酚、野黄芩素、三裂鼠尾草素、黄芩苷、芹菜素、汉黄芩素、4'-羟基汉黄芩素、木犀草素、4',5-二羟基-3',5',6,7-四甲氧基黄酮、柚皮素、7-羟基-5,8,2'-三甲氧基黄烷酮、大波斯菊苷。结论分离得到的化合物类型均为黄酮苷元和苷类化合物,可为半枝莲的黄酮成分分析提供一定的科学依据。     

Purification,characterization and production optimization of a vibriocin produced by mangrove associated Vibrio parahaemolyticus

ObjectiveTo identify a potential bacterium which produces antimicrobial peptide (vibriocin), and its purification, characterization and production optimization. The bacteria subjected in the study were isolated from a highly competitive ecological niche of mangrove ecosystem.MethodsThe bacterium was characterized by phenotype besides 16S rRNA gene sequence analysis. The antibacterial activity was recognised by using agar well diffusion method. The vibriocin was purified using ammonium sulphate precipitation, butanol extraction, gel filtration chromatography, ion-exchange chromatography and subsequently, by HPLC. Molecular weight of the substance identified in SDS-PAGE. Production optimization performed according to Taguchi's mathematical model using 6 different nutritional parameters as variables.ResultsThe objective bacterium was identified as Vibrio parahaemolyticus. The vibriocin showed 18 KDa of molecular mass with mono peptide in nature and highest activity against pathogenic Vibrio harveyi. The peptide act stable in a wide range of pH, temperature, UV radiation, solvents and chemicals utilized. An overall ~20% of vibriocin production was improved, and was noticed that NaCl and agitation speed played a vital role in secretion of vibriocin.ConclusionsThe vibriocin identified here would be an effective alternative for chemically synthesized drugs for the management of Vibrio infections in mariculture industry.