利用环介导恒温扩增法快速检测空肠弯曲菌

目的 利用环介导恒温扩增技术,以空肠弯曲菌的VS1基因设计引物,建立快速检测空肠弯曲菌的方法,以期能应用于急性腹泻和肠炎等疾病的快速检验.方法 ①通过基因比对与引物设计,设计针对空肠弯曲菌的环介导恒温扩增检测(LAMP)方法;②用钙黄绿素、亚甲基蓝、结晶紫、溴化乙锭4种DNA染料对扩增产物进行染色,评价各染料染色效果;③检测该LAMP方法对空肠弯曲菌及其他干扰菌的扩增情况,评价其特异性;④将该LAMP方法与培养法比较,进行统计学分析.结果 ①设计出针对空肠弯曲菌的LAMP检测方法;②钙黄绿素与扩增产物结合后颜色变化明显,是该LAMP方法中较好的DNA染料物质;③本LAMP检测方法只针对空肠弯曲菌有扩增,对其他干扰菌不扩增,显示出良好的特异性;④试验共检测了60株临床和标准菌株,对于菌株的培养物,LAMP检测结果与培养鉴定法比较差异无统计学意义(x2 =0.3333,P＞0.05).结论 本试验设计出了针对空肠弯曲菌LAMP检测方法,该LAMP法较好的DNA染料物质是钙黄绿素,该方法具有良好的特异性,与培养鉴定法比较具有较高的阳性、阴性及总体符合率,能够用于空肠弯曲菌的快速检验.     

环介导等温扩增法快速检测结核杆菌复合群内主要致病菌

目的 快速诊断和区分结核杆菌复合群内两种主要致病菌.方法 利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立快速检测和区分结核杆菌复合群内主要致病菌的方法,利用该方法对相关的临床分离株样本进行特异性检测,并利用1∶ 10倍比稀释的已知菌株DNA模板分析其敏感性.反应结束后通过电泳或向反应管中加入DNA染料肉眼判定检测结果.结果 该方法可以成功检测到主要的结核致病菌:人型和牛型结核分枝杆菌,与包括卡介苗在内的其余相关菌株均未见非特异性交叉反应.检测的灵敏度可达100拷贝/微升,高于常规PCR方法.结论 该检测方法具有敏感、特异、低成本和快速的特点,可检测和区分人型和牛型结核分枝杆菌,并能排除卡介苗对诊断的干扰.     

LAMP技术检测单纯疱疹病毒-2型的初步应用

目的建立一种对单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)进行快速、高效、简便的LAMP检测方法。方法用病毒DNA提取试剂盒提取HSV-2基因组DNA,设计4条扩增HSV-2糖蛋白gG基因的LAMP引物,以灭菌水为阴性对照,进行LAMP,LAMP产物经电泳、酶切鉴定。将HSV-2 DNA作10倍系列稀释后进行LAMP,检测其敏感性。结果HSV-2 LAMP产物电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组无扩增条带。LAMP产物的特异性通过限制性内切酶得到了证实。LAMP检测HSV-2的敏感性为0.01 ng/μL。结论检测HSV-2的LAMP方法特异、敏感、简便。     

恒河猴感染SARS-CoV的病毒学、血清学检测

目的对感染SARS-CoV的8只恒河猴进行病毒学、血清学指标检测。方法SARS-CoV经鼻腔接种8只恒河猴,在感染的第1天开始到5、7、10、15、20、30和60天分别安乐处死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和抗体测定。结果RT-PCR证实感染病毒检出时间为5~16d,8只猴中的5只分离到了病毒,感染15d后可检测到抗体。结论感染SARS-CoV的恒河猴不仅出现与SARS患者类似的临床和病理学改变,也在一定时期内排毒,出现特异免疫反应,这些指标均可作为药物筛选、疫苗评价等方面的重要参数。     

深圳市从业人员沙门氏菌和志贺氏菌菌型分布研究

目的：对深圳市2003年食品、公共卫生从业人员健康体检的151452份标本进行肠道沙门氏菌与志贺氏菌检验，并进行菌型分布分析。方法：参照国标肠道致病菌中的沙门氏菌属和志贺氏菌属的检验方法。结果：151452份标本中检出肠道沙门氏菌属与志贺氏菌属带菌者665例，带菌率为0．44％，其中检出沙门氏菌455例，共7个群25个血清型。德比沙门氏菌检出率最高，依次为鸭沙门氏菌和阿贡纳沙门氏菌等，其构成比为25．05％和13．19％，10．77％。志贺氏菌检出210例，带菌率为0．139％，以B群最高，D群次之，构成比为66．19％和28．57％。结论：455株沙门氏菌和210株志贺氏菌菌型分布绝大部分均为深圳市常见菌型，符合以往的检测结果，值得提出的是检出E1群的吉韦沙门氏菌为我市首见。福氏志贺氏菌（B群）仍为深圳市引起菌痢的主要菌群，而宋内氏志贺氏菌（C群）有逐年增加的趋势，应引起重视。因此必须加强卫生监督监测管理工作。     

深圳市食品和公共场所从业人员肠道致病菌带菌状况调查

目的 了解深圳市2003年食品和公共卫生从业人员沙门菌与志贺菌带菌状况，以采取相应卫生管理和控制措施。方法 参照国标中的沙门菌属和志贺菌属检验方法检测，然后统计分析。结果 从151452人中检出肠道带菌者665例，总带菌率为0．44％。其中检出沙门菌455例，带菌率为0．30％。共检出7个群25个血清型，德比沙门菌检出率最高，其次为鸭沙门菌和阿贡纳沙门菌，带菌率分别为25．05％、13．13％和10．77％。检出志贺菌210例，带菌率为0．139％，以B群占优势，D群次之，占构成比分别为66．19％和28．57％。结论 此次检出沙门菌与志贺菌的带菌率(0.30％和0．139％)分别比1998年的0．49％和0、37％有较大下降。表明卫生管理工作取得一定的成效，但仍须努力抓紧抓好，以保障全市人民的健康与安全。     

环介导等温扩增在检测肺炎支原体中的临床应用

目的 探讨一步法可视化环介导等温扩增(LAMP)在检测肺炎支原体中的临床应用价值。方法 用一步法可视化LAMP、聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)同时检测108份儿童支原体肺炎临床标本。 随机选取临床儿科住院患儿108例标本,包括以PCR法诊断肺炎支原体感染患儿73例和临床排除支原体肺炎的其他慢、急性呼吸道感染者35例,于入院的第1天分别采用LAMP、PCR和ELISA法检测同一患者咽拭子标本和血清标本,并分别计算Kappa统计量,评价LAMP 法与PCR法、LAMP 法与ELISA法的一致性。入院第5天重新采集40例患者的样本,用3种方法比较入院第1和5天的检测结果。结果 一步法可视化LAMP方法的敏感度为100%,特异度为94.3%;ELISA法的敏感度为65.8%,特异度为82.9%。一步法可视化LAMP方法与PCR法的Kappa值为0.956;与ELISA法比较,Kappa值为0.38。一步法可视化LAMP方法在第1天就检出阳性的标本例数比ELISA法高。结论 一步法可视化LAMP技术有高敏感度和特异度,在感染早期就可以检测出肺炎支原体。LAMP法与PCR法具有可比性,可用于肺炎支原体的检测。     

恒河猴婴猴离乳阶段行为观察及分析

目的了解婴猴离乳期的行为特点及规律,初步探讨婴猴早期断奶后心理和行为的变化。方法采用随意取样和时间记录法对2012年出生的290只婴猴离乳后的行为进行6个月的观察记录。结果离乳后1个月内出现团抱、吸手指、吸同伴身体3种行为,团抱、吸手指行为在第2、3月显著上升(P0.05),吸同伴身体行为在第2月显著上升(P0.05);第2个月,新增的踱步、吸生殖器的行为于第3个月显著上升(P0.05),爬跨行为随时间的延长无明显变化;第3个月新增吸脚趾行为的比例未随时间的变化而发生改变。其中,雌性同笼发生团抱的比率显著高于异性及雄性同笼(P0.05);雄性婴猴较雌性婴猴更易发生踱步行为;雄性婴猴吸手指及吸同伴身体的行为发生率显著低于雌性(P0.05);吸脚趾行为雌、雄发生率无显著差异。结论通过观察婴猴离乳后的行为,观察到团抱、踱步、吸脚趾、吸手指、吸生殖器、吸同伴身体和爬跨7种行为,且各行为均随时间的变化而递增。团抱行为反映了恐惧心理;吮吸行为代表了生理需求及防卫心理;踱步行为初期是无目的,逐渐变成焦虑心理的体现。为研究人类婴幼儿早期断奶后心理和行为的变化,开展心理学、行为学等方面的评估实验提供研究思路和模型。     

分子信标PCR检测志贺菌ipaH基因

目的用分子信标探针PCR快速检测志贺菌属(Shigella)。方法根据GenBank上公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列,设计引物和分子信标探针,以4种细菌进行对照,进行特异性和灵敏度分析,建立Shigella的实时PCR技术快速检测,应用于食物中毒和食品检测。结果检测20个样本,Shigella呈阳性,其它呈阴性,时间约2h。结论Shigella分子信标探针技术具有快速、灵敏度高、特异性强等特点,可用于Shigella食物中毒快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的早期、准确诊断提供新的检测手段。     

正常猕猴与人的视网膜电图比较

目的比较正常猕猴与人视网膜电图异同,为进一步利用猕猴建立动物模型研究视网膜疾病打下基础。方法健康成年猕猴7只(14只眼)与8例(16只眼)正常人进行视网膜电图检测,对两者Rod-ERG中的b波,Max-ERG的a、b波,Cone-ERG的b波峰时值及波幅和OPs的O2值,Flicker-ERG的P值进行统计学检验。结果猕猴与人的视网膜电图波形结果较为相似,各指标与人的结果相比,潜伏期短,幅值低,但Cone-ERG和Flicker-ERG两者幅值差异不具有统计学意义。结论视网膜电图检测从功能上证明猕猴较其他常用实验动物更接近人,尤其表现在视锥细胞及黄斑区功能,可用作人类视网膜疾病尤其是黄斑区病变的良好动物模型。     

3～4岁猕猴生理指标的测定

目的 建立3～4岁猕猴生理指标基础数据.方法 对100只3～4岁猕猴(♂ 50只,♀50只)进行了较全面的血液学和心肺功能等生理指标的测定,包括血常规30项、血液生化22项、凝血功能2项以及血压、心电图、呼吸次数.结果 血常规中,雌性猕猴的平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)极显著低于雄性猕猴(P＜0.01);雌性猕猴极显著高于雄性的项目有血小板计数(PLT)、血小板压积(PCT)、嗜酸性粒细胞计数(EO#)、嗜碱性粒细胞计数(BASO#)、嗜酸性粒细胞百分比(EO％)与嗜碱性粒细胞百分比(BASO％)(P＜0.01);显著高的项目有白细胞计数(WBC)和淋巴细胞计数(LYMPH)(P＜0.05).血液生化指标中,雌性猕猴极显著低于雄性的项目为尿素氮(BUN)、总胆红素(TBIL)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)与无机磷(IP)(P＜0.01);显著低的项目为天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)和直接胆红素(DBIL)(P＜0.05);雌性猕猴显著高于雄性的项目为血糖(GLU),血钙(Ca)和甘油三酯(TG)(P＜0.05).血凝与血压、心电图的各参数中,雌、雄性别的猕猴之间无显著性差异.呼吸次数的监测结果显示雌性猕猴的呼吸次数较雄性猕猴极显著减少(P＜0.01).结论 建立了3～4岁实验用猕猴的生理指标的正常值,为猕猴实验和疾病诊断中相关生理指标的分析提供了基础参考值.     

Evaluation of Multidrug Resistant Loop-mediated Isothermal Amplification Assay for Detecting the Drug Resistance of Mycobacterium tuberculosis

Objective To evaluate multidrug resistant loop-mediated isothermal amplification (MDR-LAMP) assay for the early diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis and to compare the mutation patterns associated with the rpoB, katG, and inhA genes at the Chinese Center for Disease Control and Prevention.Methods MDR-LAMP assay was evaluated using 100 Mycobacterium tuberculosis (Mtb) isolates obtained from the National Reference Laboratory for Tuberculosis in China. Phenotypic resistance to isoniazid and rifampicin and whole-genome sequencing served as reference standards. Results The sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV) of MDR-LAMP were 85.5％, 93.6％, 96.7％, and 74.4％ for the detection of resistance to isoniazid and rifampicin, respectively, and 80.5％, 92.3％, 98.6％, and 41.4％ for the detection of Mtb cultured from smear-positive sputum samples, respectively. When DNA sequencing was used as the reference standard, the sensitivity, specificity, PPV, and NPV of MDR-LAMP were 93.1％, 92.3％, 97.2％, and 82.8％for the detection of katG and inhA gene mutations, respectively, and 89.1％, 88.9％, 93.4％, and 81.1％for the detection of rpoB gene mutation, respectively.Conclusion MDR-LAMP is a rapid and accessible assay for the laboratory identification of rifampicin and isoniazid resistance of Mtb isolates.     

LAMP结合核酸试纸条技术快速检测粪便中艰难梭菌的方法研究

目的 研究利用环介导等温扩增（loop–mediated isothermal amplification,LAMP）结合核酸试纸条技术建立艰难梭菌（Clostridium difficile,CD）的快速检测方法,为艰难梭菌检测提供一种快速检测的方法。方法 收集2016年1月至2017年12月杭州市临安区第一人民医院临床感染性腹泻患者的粪便标本201份。根据艰难梭菌毒素A基因特异序列设计引物,选择6条最佳引物,用LAMP环介导等温扩增曲线、钙黄绿素目视法和核酸试纸条测试实验结果,再优选反应体系,最后检测粪便中的艰难梭菌。结果 LAMP法能在60℃条件下扩增1h检出艰难梭菌,对1株艰难梭菌和7株非艰难梭菌检测,只有艰难梭菌能检出阳性扩增,设计的引物具有良好的特异性。脱氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid,DNA）检出限为0.8pg/μl。结论 LAMP结合核酸试纸条技术快速检测粪便艰难梭菌具有敏感度高、操作简便、特异性强、可视化、方便快捷的特点,适用于艰难梭菌的快速检测。     

猕猴志贺菌感染状况及药物敏感性调查

目的 研究志贺菌血清型的分布，针对不同血清型筛选高敏抗生素。方法 采用国标(GB／T14926．47—2001)的检测方法，对537份猕猴粪便样品进行细菌分离、鉴定及药敏实验。结果 检出74株志贺菌．检出率为13．78％。其中A群占6．76％，B群占71．62％，C群占21．62％。各个血清型分布为：A群1型占6．76％，B群2a型、Y变种、6型、3c型分别占35．14％、32．43％、2．70％、1．35％，C群鲍氏多价(7—11)型、(12-15)型分别占20．27％、1．35％。药敏实验表明志贺菌对氧氟沙星(86．49％)最敏感；对头孢三嗪(77．03％)、头孢他啶(64．86％)也较敏感；2a型志贺菌对头孢唑啉(65．38％)、痢特灵(65．38%)有较强敏感性；鲍氏多价(7—11)型对头孢唑啉(66．67％)、环丙沙星(66．67％)、诺氟沙星(66．67％)敏感性较强。结论 志贺菌2a、Y变种和鲍氏多价(7-11)型是目前引起细菌性痢疾的主要血清型，且对氧氟沙星、头孢三嗪、头孢他啶敏感，其中鲍氏多价(7—11)型对头孢唑啉、环丙沙星、诺氟沙星也有较强敏感性。     

环介导等温扩增法检测孕妇血清中单纯疱疹病毒Ⅰ型方法的建立

目的建立稳定、可靠的环介导等温扩增法（LAMP）快速检测孕妇血清中单纯疱疹病毒Ⅰ（HSV-Ⅰ）DNA的方法。方法通过对影响LAMP反应体系的几个主要因素进行优化,确定最佳反应条件,并对其特异性、灵敏度及可靠性进行评判。结果 LAMP检测HSV-Ⅰ DNA的最佳反应条件：甜菜碱和Mg2＋的终浓度分别为1.0mol/L和10mmol/L,于62℃恒温反应1h。扩增产物可被Hinf Ⅰ消化,理论上检测下限可达10个拷贝,与定量PCR相比符合率达94.5%。结论本实验建立的LAMP检测HSV-I的方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,适合基层用于HSV-Ⅰ筛查。     

环介导技术在细菌性痢疾检测中的应用

目的:建立环介导等温扩增法(LAMP)检测肠道门诊感染性腹泻病例志贺菌.方法:应用Primer Explorer V5软件设计针对志贺菌的保守区引物,建立LAMP检测方法,采用荧光定量PCR法、LAMP法和分离培养法三种方法,对760例承德医学院附属医院肠道门诊腹泻患者粪便标本进行检测.对建立的方法进行特异度、灵敏度试验,与荧光定量PCR、培养法进行比对.结果:3种方法的检测结果差异无统计学意义(P>0.05).LAMP检测方法具有良好的敏感度和特异度.结论:LAMP法使用水浴锅进行等温扩增,结果可在可见光或紫外灯下直接肉眼观察.LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,无需特殊仪器,可广泛用于基层疾控医疗机构志贺菌的检测.     

实验恒河猴糖尿病动物模型建立及视网膜并发症的研究

[目的]糖尿病是由于多种因素和遗传因素导致体内胰岛素相对或绝对分泌不足,而引起的代谢性内分泌疾病,它以血糖、尿糖升高为特点,起病隐蔽,通过并发症使人致残致死,是继心血管、癌症之后的第三大致死性疾病,很可能成为21世纪人类的“第一杀手”(1,2)。本文采用人工诱导的方法,建立恒河猴糖尿病动物模型,研究糖尿病疾病的发展和及其并发症的发生、发展规律和防治措施,同时对于治疗糖尿病新药的安全性评价和药物疗效的观察具有广阔的运用前景。[方法]选用成熟的、健康的、雄性恒河猴9只,随机分成三个组,其中高剂量组(60mg/kg)1只,中剂量组(45m…     

恒河猴五日热巴尔通体的分离和柠檬酸合成酶基因的序列分析

目的初步研究巴尔通体在恒河猴体内的存在情况,并分析其柠檬酸合成酶(gltA)的基因序列,判断巴尔通体的种属。方法16只来自福建的恒河猴,用血琼脂培养基分离可能存在的巴尔通体。根据NCBI数据库上的巴尔通体gltA的基因序列,设计一对引物,以巴尔通体菌落为模板进行扩增,将获得的序列进行克隆测序。结果从3只恒河猴体内成功分离到了巴尔通体病原,并获得了巴尔通体gltA全长基因序列,测序结果表明该序列与五日热巴尔通体同源性99%。结论福建来源的恒河猴种群携带巴尔通体病原,巴尔通体流行地区可能存在鼠与灵长类动物之间病原体的流行和传播。     

脊髓灰质炎疫苗脑内法猴体神经毒力试验病理学评价方法的探讨

目的探讨脊髓灰质炎疫苗脑内法猴体神经毒力试验病理评价方法。方法采用恒河猴双侧丘脑内注射给药,观察21 d后进行解剖,完整取出脑和脊髓,经修切后脱水包埋,切片经HE染色和没食子蓝染色后在光镜下观察,对神经组织病变进行评分,根据分值对病变严重程度进行判定。本研究涉及12批实验中的240动物。结果本方法对左右大脑包括针迹在内的不同部位、中脑、小脑、脑桥、延髓、颈膨大、腰膨大进行取材,参照脊髓法神经毒力试验病理学评价的半切面评分方法,对双侧脑干、颈髓和腰髓的病变进行评价并计分,根据平均分值并结合具体病变情况分别判定此3个部位的病变程度。本研究中特异性的神经系统病变的发生率15%。各型疫苗病变发生率相似,轻微病变出现的比例最高。较严重的病变主要见于Ⅲ型疫苗。结论在脑内法神经毒力试验中,用半切面评分方法对病变进行评分,较客观地反映了神经系统病变的情况,方法简便易行,实用性较强,利于判断标准的统一,可作为脊髓灰质炎疫苗脑内法神经毒力试验病理学评价方法的参考。     

FTA滤膜结合PCR快速检测肉中志贺氏菌

目的建立一种肉中志贺氏菌的快速检测方法。方法利用FTA（Flinders Technology Associates）滤膜从肉中提取志贺氏菌基因组DNA,以志贺氏菌属的ipaH基因为模板设计引物进行PCR反应得到369 bp片段,经测序证实该片段为目的扩增产物。结果采用建立的FTA滤膜结合PCR检测肉中志贺氏菌的方法,人工污染牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉匀浆液的检出限均为8×101CFU/ml匀浆,6 h即可完成整个检测过程。结论该方法灵敏度高、耗时短,为预防志贺氏菌食物中毒、控制细菌性痢疾的暴发流行提供了新的检测方法。