Alk-SMase基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定

目的 :为了繁育和鉴定碱性鞘磷脂酶(Alkaline sphingomyelinase,alk-SMase)基因敲除小鼠,将引进的基因敲除小鼠进行饲养繁殖,杂合子、纯合子用于继续保种。方法:对其幼鼠剪尾提取基因组DNA,采用PCR方法进行基因型鉴定;取alkSMase表达组织做HE染色进行形态学比较。结果 :对引进小鼠已成功饲养和繁殖,并得到纯合alk-SMase基因缺失型小鼠。结论:正确的饲养、繁殖及基因鉴定方法对于基因敲除小鼠的获得和保种具有重要的意义。     

Unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠模型的构建和鉴定

目的 构建Cre重组酶系统调控的Unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠,为Unc13基因在胰岛素分泌中扮演的角色和作用机制的体内实验研究提供更特异的动物模型。方法 运用CRISPR/Cas9技术构建Unc13^flox/flox转基因小鼠,将其与胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶（Ins2-cre）工具鼠进行杂交,采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）和测序等方法对其子代小鼠的基因型进行鉴定,并对该基因敲除（knock out,KO）小鼠及其同窝野生（wild type,WT）小鼠的体质量、糖耐量、胰岛素分泌水平进行测定。结果 成功构建胰岛β细胞特异性Unc13基因条件性敲除小鼠（以下简称为Unc13 KO鼠）。进一步研究显示Unc13 KO鼠与WT鼠相比,体质量无明显变化,但糖耐量受损,胰岛素第一时相分泌下降。结论 成功构建了Unc13基因胰岛β细胞条件敲除小鼠动物模型,为探讨Unc13基因在糖尿病发生、发展中的作用提供研究平台。     

剔除CCR5基因供者小鼠细胞加重急性移植物抗宿主疾病

目的评价供者CCR5在经过强化预处理的骨髓移植动物模型受者体内的作用,为异基因造血干细胞移植的临床应用提供科学依据。方法经过致死剂量照射的BALB/C小鼠接受异基因C57BL/6小鼠骨髓移植。根据回输的细胞不同分为4组:1)B6 CCR5 KO组,受者接受C57BL/6 CCR5-/-小鼠骨髓和脾脏细胞;2)B6 WT组,受者接受野生型C57BL/6小鼠骨髓和脾脏细胞;3)B6 CCR5 KO BMC组,受者只接受C57BL/6 CCR5-/-小鼠骨髓细胞;4)B6 WT BMC组,受者只接受野生型C57BL/6小鼠骨髓细胞。结果与B6 WT组比较,B6 CCR5 KO组小鼠以更快的速度死于急性移植物抗宿主疾病(GVHD);其受者体内的CD8+T细胞大量增生;T细胞恢复后产生更多的干扰素-γ(INF-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),T细胞有丝分裂原刀豆素水平处于较高水平,进一步促进T细胞增生。组织学检测提示移植剔除CCR5基因受者细胞的小鼠肾脏出现病理损伤,肝脏存在更为严重的病理变化。结论剔除CCR5基因的异基因骨髓移植使GVHD发病率增加,供者CD8+T细胞在受者体内增生加重肝肾损害。提示CCR5在异基因骨髓移植中起着重要作用。     

α-细辛醚对FMR1基因敲除小鼠旷场行为的干预作用

目的探讨α-细辛醚对FMR1基因敲除小鼠的旷场行为的干预作用。方法通过对30日龄FMR1基因敲除小鼠连续腹腔注射不同剂量α-细辛醚5天,用药第5天进行旷场行为实验,观察能否改善KO鼠过度活动的表型。结果在旷场行为实验中,与WT鼠相比,未使用α-细辛醚的KO鼠的总运动长度及总跨格次数,中央格(区4)活动时间,中央格(区4)进入次数均比WT鼠多,P<0.05;使用α-细辛醚后,KO鼠α-细辛醚6~24 mg/kg剂量组与生理盐水(0 mg/kg)组比较,旷场实验运动长度及跨格次数均有减少(P<0.05)。结论 6~24mg/kgα-细辛醚能改善KO鼠活动过度的表型,可能对FMR1基因敲除小鼠有治疗作用。     

QPRT基因功能缺失对肾脏发育的影响

目的：研究喹啉磷酸核糖基转移酶（quinolinic phosphoribosyl transferase,QPRT）基因功能缺失对胚胎肾脏发育的影响。方法：通过免疫组化确定QPRT在胎鼠肾脏组织的表达;构建QPRT基因缺陷型小鼠模型,取QPRT+/+（WT）型和QPRT-/-（KO）型小鼠的血清进行肾功能检测;称重法计算KO及WT组小鼠的体重、肾脏重量及肾脏系数;用HE染色观察小鼠及其子代肾脏病理组织学变化。结果：在妊娠13 d胎鼠肾脏组织,QPRT在发育中的输尿管芽中强烈表达。在基因敲除小鼠模型中,QPRT-/-小鼠的肾脏系数（肾重/体重）显著低于野生型小鼠（P<0.05）,且QPRT-/-小鼠的尿素氮、血肌酐、尿酸水平高于野生型组（P <0.05）。肾脏组织HE染色显示QPRT-/-仔鼠的肾脏实质部位局部呈现蜂窝状囊性扩张;QPRT+/-仔鼠见肾脏皮质间质局灶性疏松水肿;QPRT+/+仔鼠肾脏未见明显病理组织学变化。结论：QPRT基因功能缺失可能影响胚胎肾脏发育。     

Mafb基因敲除小鼠的构建及其尿道下裂表型初步分析

目的 利用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/重组CRISPR相关核酸酶9(CRISPR-associated protein 9, Cas9)构建Mafb基因敲除小鼠,初步研究该基因缺失对尿道发育的影响。方法 根据CRISPR/Cas9技术原理构建Mafb基因杂合子（Mafb+/-）F1代小鼠,裂解鼠尾提取DNA,PCR法扩增目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳判定基因型结果。使Mafb+/- F1代小鼠与野生型（wild type, WT）C57BL/6J小鼠交配繁殖。将获得的Mafb+/-小鼠间进行交配,获得Mafb基因敲除纯合子（Mafb-/-）雄性胎鼠。免疫荧光验证Mafb-/-胎鼠阴茎组织中Mafb基因表达情况;扫描电镜及石蜡切片HE染色观察Mafb-/-胎鼠阴茎组织形态,免疫荧光检测胎鼠阴茎组织尿道缝处细胞E-Cadhrin和α-SMA的表达情况。结果 成功构建、繁育Mafb+/-小鼠,保持种群数量并得到Mafb-/-雄性胎鼠,PCR法成功鉴定基因型。免疫荧光结果显示Mafb-/-胎鼠阴茎组织中几乎不存在Mafb蛋白表达,且相较于WT型,尿道缝处细胞E-Cadhrin蛋白表达明显降低,α-SMA蛋白表达明显增高;扫描电镜及HE染色显示Mafb-/-雄性胎鼠为尿道下裂表型。结论 成功构建 Mafb基因敲除小鼠模型,确定其敲除可导致小鼠出现尿道下裂表型,发现尿道缝处细胞中E-Cadhrin和α-SMA的表达差异,为进一步研究该基因在尿道下裂发生机制中的作用提供基础。     

Slc4a11基因缺失在CHED发病中的作用

目的　探讨Slc4a11缺失在先天性遗传性角膜内皮营养不良（congenital hereditary endothelial dystrophy, CHED）发病中的作用及其与自噬信号通路的潜在调控关系。方法　利用CRISPR/Cas9技术构建Slc4a11基因敲除小鼠模型。以野生型小鼠（wild type, WT）和Slc4a11基因敲除小鼠（knockout, KO）为实验对象,通过Western印迹法、RT-qPCR、茜素红染色、H-E染色、透射电镜评估KO小鼠角膜表型特征的变化。通过Western印迹法和RT-qPCR检测自噬标志物LC3、beclin1、p62在角膜内皮的表达量。透射电镜观察两组小鼠角膜内皮细胞自噬情况。结果　Slc4a11基因敲除小鼠角膜显示与CHED相似的表型特征,包括角膜厚度增加;角膜内皮细胞体积增大,密度减小;后弹力层增厚;角膜内皮空泡形成。KO小鼠与WT小鼠相比,LC3、beclin1的mRNA和蛋白的相对表达量上升,差异有统计学意义（P<005）,而p62的mRNA和蛋白的相对表达量下降,差异有统计学意义（P<005）。KO小鼠角膜内皮细胞内自噬体明显多于WT小鼠。结论　利用CRISPR/Cas9技术构建的Slc4a11基因敲除小鼠角膜显示CHED特征的表型。同时Slc4a11缺失通过增强自噬信号通路参与CHED的发病机制。     

Mfge8基因敲除纯合子小鼠的定向繁殖和鉴定及其与自身免疫疾病相关性分析

目的繁殖和鉴定Mfge8基因敲除C57BL/6小鼠,获取纯合子(Mfge8~(-/-))小鼠,并比较Mfge8~(-/-)小鼠血清学及组织学改变。方法对幼鼠剪尾抽提基因组DNA,用PCR法和琼脂糖凝胶电泳法鉴定幼鼠基因型;利用TUNEL法分别检测12周龄野生型(WT)和Mfge8~(-/-)小鼠肺组织中凋亡细胞;并且利用免疫荧光法分别检测36周龄WT和Mfge8~(-/-)小鼠血清中ANA和AECA含量。结果构建的基因敲除小鼠已成功繁育保种,并得到纯合基因缺失型小鼠。同时,12周龄Mfge8~(-/-)小鼠肺组织中凋亡细胞数量明显多于WT小鼠;36周龄Mfge8~(-/-)小鼠血清中ANA抗体及AECA抗体阳性,而WT小鼠血清中呈现阴性。结论 C57BL/6背景小鼠敲除Mfge8基因后,更易发生自身免疫疾病。     

促肾上腺皮质激素释放激素基因敲除小鼠的繁殖与基因型鉴定

目的探讨促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)基因敲除(KO)小鼠饲养、繁殖及基因型鉴定的方法。方法从美国Jackson实验室引进CRH KO小鼠,按照遗传学规则,对杂合子型(CRH+/-)小鼠进行配对繁殖,提取幼鼠尾部组织全基因组DNA,通过聚合酶链反应(PCR)对幼鼠基因型进行鉴定。结果 CRH KO纯合子型(CRH-/-)小鼠的繁殖和饲养均获得成功,采用PCR成功地对所获得的小鼠进行基因分析,在子代小鼠中存在野生纯合子型(CRH+/+)、杂合子型(CRH+/-)及CRHKO纯合子型(CRH-/-)小鼠。CRH-/-小鼠较另外2种基因型小鼠存活率明显下降,但3种基因型小鼠在出生后10 d及30d体质量无明显差异。结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法可从杂合子型(CRH+/-)小鼠中获得CRH KO纯合子型(CRH-/-)小鼠。     

HIF-1α对颏舌肌发育和肌纤维类型的影响

目的 研究低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)对骨骼肌发育及肌纤维分型的影响。方法 将HIFflox/-转基因小鼠和骨骼肌环化重组酶(muscle creatine kinase-cyclization recombination enzyme, MCK-Cre)转基因小鼠交配,子代中获得HIFflox/- Cre⁺小鼠互交,得到骨骼肌HIF-1α条件性敲降的HIFflox/floxCre⁺基因型小鼠(C₅₇BL/6J),取新生小鼠尾尖与骨骼肌组织鉴定基因型及敲降效率。随机选取HIF-1α敲降小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)各10只,取颏舌肌组织总RNA,使用荧光定量PCR检测4种肌纤维类型(Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx)在不同基因型小鼠骨骼肌中的表达差异。结果 HIF-1α在基因敲除小鼠(KO)的骨骼肌中的表达量较野生型小鼠(WT)有明显降低(P<0.05)。相对于野生型小鼠(WT),基因敲除小鼠(KO)颏舌肌的Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx型肌纤维表达量有降低趋势,而Ⅱb型纤维表达量有升高趋势。结论 Cre-loxP系统成功构建骨骼肌特异性敲除HIF-1α的转基因小鼠模型。HIF-1α在成肌分化过程中能够促进肌纤维Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx分化,抑制Ⅱb纤维分化。     

鞘氨醇激酶2(SphK2)基因敲除小鼠繁殖及基因型鉴定

目的 繁殖和快速鉴定鞘氨醇激酶2(SphK2)基因敲除小鼠.方法 将SphK2敲除杂合子小鼠进行配种繁殖,提取子代小鼠尾部DNA,用PCR方法检测子代小鼠基因型.结果 SphK2杂合子小鼠的饲养及繁殖均获得成功,获得子代小鼠,基因型分别为杂合子(SphK2+/-)、纯合子(SphK2-/-)和野生型(SphK2+/+).结论 SphK2基因敲除小鼠的繁育和鉴定均获得成功,为进一步研究SphK2生物学功能提供了理想的动物模型.     

Caveolin-1基因敲除小鼠子代基因型的鉴定及繁育方法

目的 探讨小凹蛋白-1(caveolin-1)基因敲除小鼠的鉴定方法与最优繁育方式,为深入研究caveolin-1在脑缺血损伤修复中的作用提供理想的动物模型。方法 将引进的caveolin-1基因敲除小鼠饲养于SPF级实验室,煮沸裂解法提取鼠尾组织基因组DNA,根据美国杰克逊实验室(Jackson Laboratory)提供的引物序列进行PCR反应检测其基因型,采用caveolin-1^+/-杂合子互交、杂合子与caveolin-1^-/-纯合子杂交(正交及反交)、纯合子互交4种不同的交配方式,观察亲代小鼠的受孕率、子代小鼠的外形特征及纯合率。结果 琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物分子量大小约200 bp和661 bp,与预期的目的基因片段分子量大小一致,成功鉴定了caveolin-1基因敲除小鼠的不同基因型;不同交配方式的繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,且雌性、雄性caveolin-1^-/-纯合鼠具有一定的繁殖能力,三种不同基因型小鼠的外形特征无明显差异。结论 煮沸裂解法提取基因组DNA、PCR法能够快速可靠鉴定caveolin-1基因敲除小鼠的基因型;caveolin-1杂合子小鼠互交与纯合子互交相结合的繁育方法可能是短期内获得足量纯合子子鼠与同源野生子鼠的较好方式。     

支架蛋白JLP基因敲除小鼠的构建及其肾脏表型的初步观察

目的 繁殖和鉴定支架蛋白JLP基因敲除小鼠,对其肾脏表型进行初步观察。方法 将JLP基因敲除杂合小鼠进行配种繁殖,提取子代小鼠的组织DNA,用PCR技术检测小鼠的基因型,并用Western blot法验证基因敲除效果。通过PAS病理染色等观察肾脏微观结构。结果 成功繁殖并获得子代小鼠,子代小鼠有3种基因型,包括纯合子（JLP+/+、JLP-/-）和杂合子（JLP+/-）。PCR检测基因型的方法方便且结果准确。结论 笔者成功建立了JLP基因敲除小鼠模型,能够进一步探究发现JLP基因对生物体的作用及机制。     

miR-5572转基因小鼠构建病态窦房结综合征疾病模型的繁殖与鉴定

目的 探讨miR-5572转基因小鼠构建病态窦房结综合征疾病模型的可行性。方法 繁殖与鉴定了miR-5572 F1及F2代野生型纯合子及杂合子小鼠,并通过形态学、心电图记录及窦房结组织Cav1.2、Cav1.3 mRNA和蛋白表达水平测定来观察疾病模型。结果 F2代miR-5572纯合子敲入小鼠在形态上较野生型小鼠生长缓慢,体型较小。相较于杂合子和野生型小鼠,纯合小鼠的平均心率明显偏低（P<0.05）,差异有显著性。miR-5572纯合子小鼠窦房结组织Cav1.2、Cav1.3 mRNA和蛋白表达水平低于野生型（P<0.05）,差异有显著性。结论 过表达miR-5572转基因小鼠可以构建病态窦房结综合征疾病模型。     

Sumf2条件性基因剔除小鼠模型的建立及初步表型分析

目的建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,为整体水平研究Sumf2基因的生物学功能创造条件。方法运用生物信息学,采用ET克隆、同源重组、显微注射等技术成功建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,并通过该模型与Ella-cre转基因小鼠交配,获得Sumf2基因剔除小鼠模型,通过PCR、RT-PCR、WesternBlot等方法在不同水平验证Sumf2基因的表达;对该小鼠模型进行初步的表型分析。结果经胚胎干细胞打靶,获得19个正确同源重组的克隆,重组效率为20％：阳性克隆经囊胚注射,获得2只嵌合体雄鼠;嵌合雄鼠与C57BL／6J小鼠交配,获得28只灰鼠,经PCR鉴定16只为杂合子小鼠,阳性率为57％;与Ella—ere转基因小鼠交配,获得了Sumf2基因剔除小鼠模型,DNA、RNA及蛋白水平证明该基因已成功剔除;初步的表型观察未发现Sumf2基因剔除小鼠生长发育、血常规及血生化指标等出现异常改变。结论成功建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,该基因纯合缺失未发现明显的生长发育异常,为进一步的基因功能研究奠定了基础。     

低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的构建

目的构建低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型。方法将Cchl1a3-knock-in打靶载体电转染ES细胞,经过G418和Ganciclovoir筛选阳性ES细胞克隆并用PCR和DNA测序法鉴定。将阳性ES克隆注射到小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。通过杂交获得的杂合子小鼠与FLP小鼠交配繁育获得去neo杂合子小鼠,并用PCR和DNA测序进行鉴定。将去neo杂合子小鼠交配得到纯合子后代,进行生长发育等方面的观察。结果打靶载体成功转染ES细胞,PCR和DNA测序法证实9个ES细胞克隆发生正确的同源重组。通过显微注射获得7只嵌合体小鼠。将嵌合体小鼠交配繁育的杂合子小鼠和FLP小鼠交配获得9只去neo杂合子小鼠,最终得到15只去neo纯合子小鼠。该小鼠在发育至性成熟阶段,精神、饮食及活动状态良好,但是在4个月龄时逐渐出现脱毛,皮肤破溃甚至死亡。结论成功构建Cchl1a3基因R528H突变的纯合子小鼠,为研究人类CACNA1S基因功能和阐明低钾型周期性麻痹发生的分子机制奠定了基础。     

共伴侣蛋白FKBP51在高脂诱导肥胖中的作用

目的 通过FKBP51基因敲除小鼠模型和细胞脂肪分化模型,探究FKBP51在高脂诱导肥胖中的机制。 方法 4周龄雄性野生型和FKBP51基因敲除小鼠以普通或高脂饲料单只单笼喂养6周,每周记录小鼠体重和饮食量,应用MM-100代谢笼系统,监测各组小鼠24 h内氧气消耗量、二氧化碳产生量、呼吸交换率和产热量的变化,对上述小鼠肝脏组织进行油红O染色,同时检测肝脏和脂肪组织代谢相关基因的表达情况。同时对取自野生型和FKBP51基因敲除小鼠的永生化成纤维细胞(MEF)进行脂肪诱导分化,观察FKBP51缺失对脂肪分化的影响。 结果 高脂饮食诱导后,两种基因型小鼠饮食量无明显变化,但与野生型小鼠相比,FKBP51基因敲除小鼠体重明显减轻,肝脏中脂滴减少。FKBP51基因敲除小鼠在基础和高脂诱导条件下,氧气消耗量、二氧化碳产生量、呼吸交换率以及产热量均高于野生型小鼠,肝脏中糖异生相关酶PEPCK、G6Pase等表达上调,脂肪中能量代谢相关基因UCP-1等表达上调。此外,FKBP51基因缺失的MEF诱导脂肪分化,细胞内脂滴明显少于野生型MEF细胞。 结论 FKBP51基因在脂肪合成和能量代谢方面起着重要作用,因此FKBP51基因缺失小鼠能够抵制高脂诱导的肥胖。     

Fkbp51基因敲除对小鼠肝脏转录组基因可变剪接的影响

目的通过分析Fkbp51基因敲除(knock out,KO)与野生型(wild type,WT)小鼠肝脏表达谱,研究Fkbp51基因敲除对肝脏组织基因可变剪接的影响。方法利用二代测序对Fkbp51 KO与WT小鼠肝脏进行表达谱测序,用Top Hat对RNA测序结果进行可变剪接分析,筛选出KO与WT小鼠肝组织中差异的内含子保留(intron retetion,RI)和外显子跳跃(exon skipping,SE)。通过在线工具DAVID对这些差异可变剪接体进行基因功能(gene ontology,GO)和代谢通路(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,同时用NCBI基因数据库对这些基因进行注释。结果 (1)Fkbp51缺失可导致小鼠肝脏mRNA可变剪接发生变化;(2)Fkbp51基因敲除造成小鼠肝脏mRNA可变剪接表达量的变化;(3)通过GO与KEGG分析,我们发现这些发生差异可变剪切的基因主要与脂肪相关衍生物的代谢、免疫、胆汁酸分泌等通路相关。(4)与差异内含子保留相关的基因主要与肌动蛋白细胞骨架调控,氨基酸及其衍生物代谢相关。结论 Fkbp51基因敲除能够改变基因组中mRNA的可变剪切,进而影响小鼠肝脏的代谢功能。