益气化瘀方及其拆方对大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡相关因子的作用

目的:研究益气化瘀方及其拆方药理血清对大鼠诱导凋亡椎间盘纤维环细胞bcl-2、Bax及半胱氨酸蛋白酶8(caspase-8)表达的影响.方法:用细胞免疫化学和积分光密度分析等方法比较分析益气化瘀方及其拆方益气方、化瘀方药理血清,以及胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)对抗-Fas抗体(anti-Fas antibody)诱导凋亡大鼠椎间盘纤维环细胞bcl-2、Bax及caspase-8表达的影响.结果:益气化瘀方、益气方、化瘀方及IGF-1血清处理组与凋亡模型组相比,bcl-2表达升高,Bax及caspase-8表达降低,均有统计学意义(P<0.01);益气化瘀方组与益气方、化瘀方组比较,Bax表达明显降低,有统计学意义(P<0.05).结论:益气化瘀方及其拆方可以调控大鼠椎间盘纤维环细胞内Bax、bcl-2和caspase-8表达,其延缓椎间盘退变的机制可能与调控细胞的凋亡相关因子有关.     

Caspase-9抑制剂对SD大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡的影响

目的 探讨caspase-9抑制剂对低胎牛血清培养诱导的大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡影响的研究。方法 取3月龄SD大鼠椎间盘软骨终板，序贯消化法获取细胞原代培养，以1％FBS培养48h为诱导凋亡条件。实验分为1％FBS凋亡组、caspase-9抑制剂组（Z-LEHD-FMK）及DMSO对照组，分别处理细胞48h，后经流式细胞仪检测细胞凋亡率、western blot检测procaspase-9，active caspase-9及active caspase-3的表达。结果 流式细胞仪检测显示，caspases-9抑制剂组细胞凋亡率（26．3±2．56）％与1％FBS组（40．8±0．84）％及DMSO组（40．2±1．56）％相比凋亡率较低，有显著统计学差异（P＜0．05）；western blot检测caspases-9抑制剂组active caspase-9及active caspase-3较1％FBS凋亡组及DMSO对照组表达均明显减少，有显著统计学意义（P＜0．05）。结论 caspase-9抑制剂能明显抑制低胎牛血清培养诱导的大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡，有望成为治疗椎间盘退变的新型药物。     

右旋甲硫氨酸联合化疗诱导胃癌细胞凋亡的机制

目的 探索右旋甲硫氨酸(D-Met)和联合应用周期特异性化疗药物诱导胃癌细胞凋亡的机制和途径。方法 将人胃癌细胞株SGC-7901分别置于六种不同培养基中：含L-Met、含D-Mel、不含Met而替以同型半胱氨酸(Met^-Hcy^ )，或在上述培养基中分别加入5-FU。培养48h后，在蛋白和mRNA水平检测凋亡相关基因bcl-2、bax和p53的表达，以及caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性。结果 各组间bcl-2、bax和p53蛋白表达无明显差异；各组均见bax mRNA和p53 mRNA表达，但未见bcl-2 mRNA表达。三种培养基组间caspase-3活性无统计学差异，而D-Met组的caspase-8活性明显低于L-Met和Met-Hcy^ 组，L-Met组的caspase-9活性显著高于Met^-Hcy^ 和D-Met组；与未加入化疗药物时相比，联合应用5-Fu后，各组caspase-3、caspase-8和caspase-9活性均明显提高。结论 D-Met诱导胃癌细胞凋亡至少部分系通过p53非依赖途径所介导，且可能以caspase非依赖方式进行；无证据支持bcl-2和bax参与凋亡的调节；5-FU可能既通过死亡受体信号传递途径，又通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡。     

紫草素对椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的 探讨紫草素对IL-1β人椎间盘髓核细胞凋亡的影响及机制。方法 体外培养人椎间盘髓核细胞,采用CCK-8检测紫草素对髓核细胞毒性及IL-1β诱导的髓核细胞活性的影响。实验分为对照组、IL-1β处理组和IL-1β+紫草素处理组,hochest 33258染色和流式细胞术 Annexin V/PI双染法检测髓核细胞的凋亡水平,Western blot实验检测各组髓核细胞凋亡蛋白cleaved caspase 3和Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平,及各组髓核细胞PI3K和AKT蛋白的表达水平。结果 紫草素浓度在5、10、15 μM时对髓核细胞活性没有毒性,且10μM时对IL-1β诱导的髓核细胞活性增加最明显,因此,选择浓度为10 μM的紫草素进行后续实验。紫草素可明显降低IL 1β诱导的髓核细胞凋亡水平;降低IL-1β诱导的髓核细胞的凋亡蛋白cleaved caspase 3和Bax,增加抗凋亡蛋白Bcl 2的表达;亦能明显增加IL-1β诱导的髓核细胞内p PI3K和p-AKT蛋白表达。结论紫草素能抑制IL-1β诱导的人髓核细胞凋亡水平,其机制可能是通过PI3K/AKT通路发挥作用。     

龙葵碱调控 Bcl-2 与 Bax 蛋白表达及 caspase-3 活性诱导HepG2 细胞凋亡的研究

目的 探讨龙葵碱诱导 HepG2 细胞凋亡的作用机制。方法 透射电镜观察凋亡细胞形态变化,原位缺口末端检测法 (TUNEL 法) 检测 DNA 断裂情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,间接免疫荧光法激光共聚焦扫描显微术检测 Bcl-2 与 Bax 蛋白表达,比色法检测 caspase-3 活性的变化。结果 在透射电镜下观察,龙葵碱组细胞出现细胞固缩,染色质致密,核凝聚固缩,染色体断裂形成核碎块,凋亡小体形成等细胞凋亡特征形态。TUNEL 法发现龙葵碱高、中、低剂量组 HepG2 细胞均有绿色荧光,阴性对照组无荧光。流式细胞术分析表明 0.4、2、10 μmol/L 龙葵碱作用 HepG2 细胞 24 h 凋亡率分别为 4.0%、8.5%、20.1%。同时,龙葵碱升高 caspase-3 活性,下调 Bcl-2 蛋白表达,上调 Bax 蛋白表达。结论 龙葵碱通过降低 Bcl-2/Bax 的值,激活 caspase-3 酶活性诱导 HepG2 细胞凋亡。     

芹菜素对人肺癌NCI-H460细胞增殖及凋亡的影响

目的研究芹菜素对人肺癌NCI-H460 细胞增殖及凋亡的影响。方法应用10~80 μmol/L 芹菜素处理NCI-H460 细胞,
MTT法检测细胞增殖抑制率;Hoechst 33258细胞核染色法观察细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染色
法检测细胞凋亡率;Western blotting检测凋亡相关信号分子Bax、Bcl-2和caspase-3的蛋白表达水平。结果芹菜素对NCI-H460
细胞的增殖抑制作用呈浓度和时间依赖性;芹菜素处理组细胞出现核固缩、染色质凝集和核碎片化等典型的细胞凋亡特征;
NCI-H460细胞凋亡率随着芹菜素浓度增加逐渐增高;芹菜素处理组细胞Bax和caspase-3蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达降低。
结论芹菜素能够抑制人肺癌NCI-H460细胞的增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与上调Bax和下调Bcl-2的表达,导致Bcl-2/Bax
比值下降,caspase-3活化有关。
     

番茄红素对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究番茄红素（lycopene,LP）对人卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法 取对数生长期SKOV3细胞随机分为5组：正常对照组、LP（20、10、5μg/ml）组和顺铂（40μg/ml）组（阳性对照组）,每组10个复孔。给药干预48h后,观察比较各组细胞生长状况并采用MTT比色法测定细胞增殖抑制率;通过流式细胞术（flow cytometry）分析细胞周期的改变、检测细胞凋亡并计算细胞凋亡率,免疫印迹法（Western blot）检测caspase-3蛋白表达并进行半定量分析,反转录PCR（RT-PCR）技术检测Bax mRNA和bcl-2 mRNA表达并计算Bax/bcl-2表达比值。结果 与正常对照组比较,LP各组SKOV3细胞呈现不同程度的细胞脱壁、细胞间松散等病理性状态,以LP 20μg/ml组最为显著;LP（20、10μg/ml）组细胞增殖抑制率显著升高,细胞周期被阻滞于G₂/M期,细胞凋亡率显著升高,caspase-3蛋白表达量显著增高,bcl-2 mRNA表达显著下调、Bax mRNA表达显著上调,Bax/bcl-2表达比值显著升高,上述差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。结论 LP具有抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖并促进其凋亡的作用,作用机制可能与LP能够有效提高caspase-3蛋白表达并下调bcl-2 mRNA表达、上调Bax mRNA表达、提高Bax/bcl-2表达比值有关。     

来曲唑通过下调bcl-2和上调caspase-3的表达促进人子宫肌瘤细胞调亡

目的 探讨来曲唑对人子宫肌瘤细胞增殖和凋亡以及bcl-2和caspase-3表达的影响. 方法 来曲唑处理原代培养的人子宫肌瘤细胞,用MTT法测定细胞生长曲线,流式细胞术测定细胞凋亡率,放射免疫法测定培养基中雌二醇水平,用实时定量聚合酶链反应和蛋白印迹检测bcl-2和caspase-3表达. 结果 来曲唑呈浓度和时间依赖性抑制子宫肌瘤细胞的增殖,降低子宫肌瘤细胞的凋亡率,同时呈浓度依赖性降低子宫肌瘤细胞雌二醇的分泌.来曲唑呈浓度依赖性降低bcl-2的表达,增加caspase-3的表达. 结论 来曲唑抑制子宫肌瘤细胞的增殖,促进其凋亡,其机制可能与来曲唑减少雌二醇的分泌、降低bcl-2表达和增加caspase-3表达有关.     

IL\|1β诱导椎间盘细胞凋亡通路再认识

目的 探讨IL-1β对体外培养的大鼠椎间盘髓核细胞凋亡作用的途径。 方法 原代大鼠腰椎间盘髓核细胞和含不同浓度IL-1β(0,10,20,50 ng/mL)的1%FBS培养基共培养24 h,显微镜下观察细胞形态、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况,检测Fas,Caspase-8,9,3及Bid mRNA的表达水平,检测Caspase-8,9,3的酶活性、线粒体膜电势。 结果 髓核细胞的凋亡率、Caspase-9和Caspase-3 mRNA的表达、Caspase-9和Caspase-3的酶活性、线粒体膜电势均随IL-1β浓度的升高而升高; 50 ng/mL的IL-1β可使Caspase-8及Bid mRNA的表达、Caspase-8的酶活性明显增强。 结论 IL-1β通过双途径诱导椎间盘细胞凋亡,以线粒体途径为主,较高浓度时可以激活膜途径诱发凋亡。     

健脾益气化瘀解毒方含药血清对结肠癌 HCT116细胞增殖、周期、凋亡的影响

目的探讨健脾益气化瘀解毒方含药血清对人结肠癌HCT116细胞增殖、周期、凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),凋亡相关蛋白Bcl-x L和Bax蛋白表达的影响。方法 10%、15%、20%健脾益气化瘀解毒方含药血清处理HCT116细胞12、24、48、72 h后,MTT法检测细胞增殖;不同浓度含药血清处理24、48 h后,碘化丙啶染色法检测细胞周期及凋亡率。蛋白质印迹法(Western blot)检测HCT116细胞内Caspase-3,Bcl-x L和Bax蛋白的表达;对照组均予以相同浓度空白鼠血清及10%胎牛血清(FBS)。结果细胞增殖:12 h后15%、20%含药血清与相同浓度鼠空白组比较,对HC116细胞的抑制作用具有统计学意义(P0.05),72 h对HCT116细胞的抑制作用最强(P0.05),健脾益气化瘀解毒方含药血清对HCT116细胞增殖具有良好的抑制作用,并与时间、浓度呈正相关。细胞周期:10%及15%含药血清组G2期细胞减少,而G1期与S期细胞增多,20%含药血清组G1期与S期细胞减少,而G2期细胞增加,48 h作用明显,而空白鼠血清细胞周期则无明显变化,说明含药血清能阻滞细胞周期,与时间呈正相关。细胞凋亡:与相应浓度对照组比较,含药血清处理24、48 h后,HCT116细胞晚期凋亡率增加,并且随浓度、时间增加凋亡率增加(P0.05),说明含药血清能促使HCT116细胞凋亡,与时间、浓度呈正相关。Western blot检测显示,与空白鼠血清组相比,15%含药血清可上调Bax蛋白表达,下调Caspase-3、Bcl-x L的蛋白表达(P0.05)。结论健脾益气化瘀解毒方可能通过将结肠癌HCT116细胞周期阻滞,从而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,通过上调凋亡相关蛋白Bax,下调Caspase-3、Bcl-x L蛋白的表达诱导细胞凋亡。     

柚皮苷通过Fas膜受体通路调控髓核细胞凋亡的机制研究

[目的]观察中药骨碎补单体柚皮苷（Naringin）对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响,为治疗椎间盘退变提供理论依据。[方法]对体外培养的人退变椎间盘髓核细胞利用番红O染色和甲苯胺蓝染色进行鉴定,并对P3代细胞分别用柚皮苷0 g/mL （对照组）、柚皮苷20 g/mL、柚皮苷40 g/mL、柚皮苷80 g/mL的培养基培养人髓核细胞48 h,噻唑蓝（MTT）法选择其抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡的最佳浓度,并用流式细胞仪测定各组细胞凋亡率。实时定量聚合酶链锁反应（qRT-PCR）检测Fas、FasL、Caspase-8基因表达。蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测Fas蛋白表达。[结果]MTT法和流式细胞检测均测定20 g/mL柚皮苷为抑制髓核细胞凋亡的最佳浓度（P<0.05）。qRT-PCR检测20 g/mL柚皮苷能够抑制Fas、FasL、Caspase-8 mRNA表达（P<0.05）。Western-blot检测显示20 g/mL柚皮苷能够抑制Fas、FasL、Caspase-8蛋白表达。[结论]柚皮苷可能通过调控Fas/Fasl死亡受体凋亡通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡。     

FGF18对兔椎间盘退变抗分解代谢作用及调节机制

目的 探讨纤维母细胞生长因子18(FGF-18)在兔椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)发生过程中抗分解代谢作用及对凋亡的抑制作用.方法 取新西兰大白兔45只,体重为2.5~3.0kg.随机分为3组,每组15只,行纤维环穿刺造模(分别在L₃~L₄、L₄~L₅及L₅~L₆椎间盘进行穿刺),造模后予椎间盘内注射阳性过表达FGF18慢病毒(干预组)、阴性慢病毒(模型组),假手术组仅暴露椎间盘不做针刺处理.术后4周、8周将各组大白兔处死取材,分离椎间盘.实时荧光定量PCR和蛋白印记检测细胞外基质降解酶MMP-3、ADAMTS-5表达变化.HE染色及组织学评分评估椎间盘退变情况.免疫组化法检测caspase-3的表达并经统计学分析.TUNEL法检测各时间点髓核细胞凋亡率.结果 术后8周时,各手术组的MMP-3、ADAMTS-5表达均高于假手术组,干预组表达低于模型组.组织学提示FGF18处理延缓椎间盘退变.免疫组化结果显示各手术组caspase-3阳性表达髓核细胞均较假手术组明显增多,干预组较模型组下调.定量分析TUNEL染色显示干预组凋亡髓核细胞较模型组亦减少.结论 髓核细胞过表达纤维母细胞生长因子18可抑制细胞凋亡,进而延缓椎间盘退变进程.     

肿瘤坏死因子-α作用下椎间盘退变动物模型的建立

目的:制作家兔椎间盘退变（IVDD）的动物模型,研究肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对髓核组织的影响。方法:取健康成年家兔30只,手术暴露L₂~L₆,L_3/4、L_4/5作为实验组,每个椎间盘髓核注射20 ng/μL TNF-α 15 μL;L_5/6作为对照组,每个椎间盘髓核注射15 μL磷酸缓冲盐溶液;L_2/3作为空白组,不做处理。于术后4周、8周、12周行腰椎X线及磁共振（MRI）检查,每次随机检查10只家兔,检查完后处死并取其髓核组织经行免疫组织化学及原位末端标记检查。结果:术后4~12周,X线见实验组椎间隙高度进行性下降,MRI可见实验组椎间隙T2加权像信号逐渐降低;免疫组织化学及TUNEL显示实验组髓核组织内Ⅰ型胶原及细胞凋亡率随之时间推移逐渐增加,Ⅱ型胶原逐渐减少。对照组和空白组差异无统计学意义（P>0.05）。结论:实验成功建立了TNF-α作用下的IVDD动物模型。TNF-α介导的椎间盘术后椎间隙高度丢失,同时TNF-α可诱导椎间盘髓核细胞退变及凋亡。微量注射器的穿刺作用对髓核细胞的退变及凋亡无明显影响。     

白细胞介素-1β诱导人椎间盘髓核细胞凋亡

目的：探讨人正常椎间盘髓核细胞的培养方法以及白细胞介素-1β（IL-1β）对人椎间盘髓核细胞凋亡的作用。方法：取特发性脊柱侧弯患者腰椎间盘髓核组织,用胰酶、胶原酶序贯消化法消化细胞,并用甲苯胺蓝、番红-O染色和Ⅱ型胶原免疫组化分别检测糖胺多糖、蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达,分别用20μg/L和200μg/L重组人IL-1β刺激髓核细胞24 h,检测其凋亡率。结果：用酶消化法可成功分离培养人椎间盘髓核细胞,检测所培养细胞可表达糖胺多糖、蛋白多糖和Ⅱ型胶原,IL-1β20μg/L组中细胞凋亡率（8.46%）和IL-1β200μg/L组（19.00%）分别为空白对照组（2.86%）的2.95倍和6.63倍（P〈0.05）,IL-1β200μg/L组是IL-1β20μg/L组的2.24倍（P〈0.05）。结论：用酶消化法可成功培养人椎间盘髓核细胞,IL-1β可以诱导椎间盘髓核细胞凋亡,并且随着浓度升高凋亡率增加,提示炎症因子IL-1β在退变椎间盘细胞凋亡中起了重要的作用。     

TGF-α诱导前列腺癌DU145细胞神经内分泌分化和增强DU145对顺铂的化疗耐药性

目的:研究TGF-α是否具有EGF相似的可诱导前列腺癌DU145细胞发生神经内分泌分化(neuroendocrine differentiation,NED) 的作用,并探讨TGF-α诱导的前列腺癌DU145细胞神经内分泌分化对肿瘤化疗耐药性的影响。方法:将接受不同培养液处理的DU145细胞分为3组:2%FBS组、2%FBS+TGF-α 5 ng/mL组和2%FBS+TGF-α10 ng/mL组。显微镜下观察TGF-α处理后DU145细胞的形态变化;Real time RT-PCR法检测神经特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE) mRNA的表达水平;Western印迹检测NSE,P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),多药耐药相关蛋白1(multiple drug resistance protein,MRP1)和Bcl-2蛋白的表达水平。流式细胞术分析TGF-α(5 μg/mL)处理后DU145细胞周期的变化;MTT比色法测定TGF-α(5 μg/mL)对DU145细胞顺铂化疗耐药性的影响。结果:同2%FBS组相比,2%FBS+TGF-α处理组的DU145细胞出现多形性,细胞伪足伸出;NED 标志物NSE mRNA的表达水平升高,分别为上调了(3.6±0.5)倍(P<0.05)和(10.1±0.1)倍(P<0.01);细胞的NSE,Bcl-2和MRP1蛋白的表达水平也明显增加,但未检测到P-gp蛋白的表达;同时,TGF-α(5 μg/mL)处理后DU145细胞的G1期细胞比例降低,S期和G2/M期细胞比例升高;顺铂的化疗耐药性增加。结论:TGF-α也可诱导前列腺癌DU145细胞神经内分泌分化增强,从而进一步增强DU145细胞对顺铂的化疗耐药性。     

正常与退变髓核细胞II型胶原蛋白和番红染色的研究

目的对正常与退变椎间盘髓核细胞（Nucleus pulposus of intervertebraldiSC）II型胶原蛋白免疫荧光染色及番红“O”染色进行比较。方法对正常与退变椎间盘髓核细胞进行番红“O”染色及细胞内II型胶原蛋白行免疫荧光染色。结果（1）免疫荧光染色：退变椎间盘髓核细胞轻度染色,呈类圆形,染色模糊,细胞内仅有极少量荧光颗粒;（2）番红“O”染色：退变盘髓核细胞形态不规则,细胞核染色较淡,形态不规则,细胞突起及胞浆染色不均匀,部分细胞组织结构分解,完整性消失,细胞稀疏,排列混乱,有的可见少量细胞坏死区。结论正常与退变椎间盘髓核细胞比较,在退变的椎间盘中髓核细胞数量减少、部分凋亡,髓核细胞内的Ⅱ型胶原蛋白含量明显减少。     

旋转式生物反应器内构建组织工程髓核

目的 探讨旋转式生物反应器(RCCS)对体外构建的组织工程髓核的影响.方法 将兔髓核细胞体外扩增至第3代,以3×107/ml的浓度接种于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)无纺网支架上.实验组在RCCS内培养,对照组静态培养.培养4周后取出细胞与支架复合物,行大体标本观察、扫描电镜、组织学和免疫组织化学染色观察、定量测定糖胺聚糖(GAG)及DNA含量.结果 旋转式生物反应器下构建的组织工程髓核的厚度、大小及组织弹性好于对照组,实验组GAG、DNA含量分别为(211.0±10.9,13.3±2.1),Ⅱ型胶原免疫组织化学染色面积百分比明显高于对照组(152.0±14.4,7.5±1.5),差异有统计学意义(P<0.05).结论 旋转式生物反应器能促进椎间盘髓核细胞Ⅱ胶原及糖胺聚糖的合成分泌,有利于在体外构建组织工程髓核.     

Specific inhibitory protein Dkk-1 blocking Wnt/β-catenin signaling pathway improve protectives effect on the extracellular matrix

The present study examined the role of Wnt/β-catenin signaling pathway in the degeneration of nucleus pulposus cells and the protective effect of DKK1 on nucleus pulposus cells.The model of nucleus pul...     

微载体旋转立体培养对成人退变髓核细胞凋亡调控的研究

目的 采用微载体旋转立体培养法对成人退变髓核细胞进行扩增,研究细胞凋亡情况,探讨髓核细胞凋亡在椎间盘退变中的作用。方法 手术切除的退变髓核组织行原代培养,传代后随机进行单层培养和微载体旋转立体培养,采用Annexin-V-PI染色,流式细胞仪定量检测早期细胞凋亡,应用免疫组化方法检测凋亡抑制因子Bcl 2的表达,DeadEndTM比色法检测细胞晚期凋亡情况。结果 流式细胞仪定量检测可见细胞在稳定生长期时,微载体旋转立体培养法较单层培养法髓核细胞的凋亡率低（P<0.05）,在对数生长期两种培养方法无明显差别（P>0.05）。Bcl-2指标及DeathEndTM比色法检测显示在两个时期内,微载体旋转立体培养法培养的细胞凋亡率较低（P<0.05）。结论 微载体旋转立体培养法可较好地降低髓核细胞凋亡率,是一种较有前途的髓核细胞培养方法,为组织工程化椎间盘髓核种子细胞的研究奠定了基础。