EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的 建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法 胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞，用EV71感染树鼩肾细胞，测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度，分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达，以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果 对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别，建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞，感染后48 ~ 96 h病毒滴度可达到1.3×10⁶ TCID₅₀/mL，说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现，EV71病毒VP1蛋白可在感染后2 ~ 8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出，间接免疫荧光法则在感染后2 ~ 6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论 在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上，确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性，初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。     

二株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

目的 从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法 树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLC-MK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物信息学分析。结果 树鼩腹泻粪便样品在KMB17、Vero 和LLC-MK2细胞上经连续3代次传代后,均能产生细胞病变。经电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析和轮状病毒鉴别筛查,推测其为呼肠孤病毒。病毒基因组全长S1基因扩增、序列测定和分析结果表明,KMB17培养上清中获得的病毒与I型原型株T1L同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和90%,因此该病毒定义为呼肠孤病毒I型。而LLC-MK2和Vero细胞上清中的病毒S1基因与III型原型株T3D核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和92%,因此为呼肠孤病毒III型。结论 对今后树鼩和其他宿主呼肠孤病毒的分离鉴定有一定的指导意义。     

树鼩原代细胞的分离及感染甲型流感病毒模型的构建

目的建立甲型流感病毒PR8株(A/PR/8/34,H1N1)对树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞的体外感染模型。方法胶原酶蛋白消化法获得树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞,用流感病毒PR8株感染树鼩原代细胞,测定24、48和72 h培养上清病毒载量,并观察细胞感染流感病毒后的形态变化,以确定流感病毒PR8株体外对树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞的感染性。结果分离到的树鼩原代细胞经传代培养纯化和形态鉴别,对树鼩原代气管内皮细胞、原代肺细胞、原代肾细胞和犬肾传代细胞(MDCK)进行流感病毒易感性比较,培养48 h时显微镜下均能观察到明显的细胞病变(CPE);培养72h时病毒滴度可分别达到2.40×10~5 TCID_(50)/mL、1.20×10~3 TCID_(50)/mL、1.74×10~4 TCID_(50)/mL和1.79×10~7 TCID_(50)/mL。结论流感病毒可有效感染树鼩原代气管内皮细胞、原代肺细胞、原代肾细胞并有效增殖,且流感病毒对树鼩原代气管内皮细胞感染性最强,与流感病毒易感细胞MDCK相比具有统计学意义。确立了树鼩原代细胞的分离与培养方法,初步建立了流感病毒感染树鼩原代细胞的体外模型。     

树鼩角膜原代上皮细胞的分离培养、纯化与鉴定

目的 建立树鼩角膜上皮细胞(CECs)稳定的体外培养技术,为人类角膜疾病研究提供新的实验材料.方法 使用改进的双酶消化法取得树鼩CECs,用转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂配合梯度消化对树鼩CECs进行纯化,角蛋白3/12抗体对CECs进行免疫荧光检测及鉴定.结果 优化的酶消化法可以快速、有效得到高纯度的树鼩CECs. TGF-β抑制剂及梯度消化法可以达到良好的纯化目的,纯化的CECs在传代过程中仍保持良好形态.树鼩CECs免疫荧光染色显示角蛋白3/12单克隆抗体阳性.结论 成功建立了一种有效、简单、经济适用的树鼩角膜上皮原代细胞的体外培养技术,所获得的原代细胞具有较好的上皮细胞形态特征并可以连续传代,为眼科疾病的研究提供一种新材料.     

茄病镰刀菌性角膜炎树鼩模型的建立

目的 采用临床分离的茄病镰刀菌感染树鼩角膜,建立茄病镰刀菌性角膜炎树鼩模型。方法 茄病镰刀菌接种到沙保氏培养基,26℃培养箱培养7 d,收集真菌混悬液,血细胞计数板调整孢子数量为1×10¹⁰CFU/mL。清洁级树鼩40只随机分为实验组（n=30）、对照组（n=10）。实验组用胰岛素针头（29 G）将真菌孢子混悬液50 μL注入角膜基中央,对照组注入生理盐水50 μL。通过前段照相、共聚焦显微镜检查、病理组织学变化、感染角膜组织培养对模型进行评价。结果 真菌浸润范围、角膜上皮细胞和内皮细胞水肿程度、菌丝数量均与时间呈正相关;炎性细胞浸润数量造模后第7天达到高峰,以中性粒细胞为主;实验各时间点均可见菌丝平行于基质纤维生长;感染后角膜组织培养可见茄病镰刀菌生长;造模成功率为86%。结论 采用基质注射茄病镰刀菌孢子的方法首次成功建立茄病镰刀菌性角膜炎树鼩模型。     

形觉剥夺树鼩视皮质17区的可塑性

目的 探讨肠道病毒71型(EV71)对树鼩肾细胞的感染特性.方法 通过组织块贴壁法分离培养树鼩原代肾细胞,观察细胞形态并进行传代培养,利用细胞角蛋白18对树鼩肾细胞进行间接免疫荧光鉴定.用EV71感染树鼩肾细胞,通过倒置显微镜观察细胞病变情况,结合间接免疫荧光实验观察细胞中病毒蛋白的表达情况,采用实时荧光定量PCR技术检测病毒载量,以Vero细胞为对照,研究EV71对树鼩肾细胞的感染情况.结果 通过组织块贴壁法可以快速获得树鼩原代肾细胞,并可进行多次传代培养,细胞为梭形,贴壁呈铺路石状,免疫荧光鉴定为肾上皮细胞.EV71可以感染树鼩肾细胞,使之出现明显的细胞变圆、脱落或解体等病变,免疫荧光实验可以观察到病毒蛋白的分布,实时荧光定量PCR检测病毒载量最高可达105拷贝/mL,病变情况和增殖趋势与Vero细胞相似.结论 EV71可以体外感染树鼩肾细胞,该细胞模型可为EV71药物筛选和感染机制研究提供平台.     

复方野马追胶囊抗呼吸道合胞病毒研究

目的 观察复方野马追胶囊对呼吸道合胞病毒（RSV）感染及炎性因子IL-8释放的抑制作用。方法 采用细胞病变（CPE）观察和活细胞染色方法,观察复方野马追胶囊对呼吸道合胞病毒感染细胞的保护。同时,通过ELISA法测定培养上清IL-8的变化。结果 复方野马追胶囊对呼吸道合胞病毒感染有抑制作用,其中以治疗法效果最为明显。同时该药对呼吸道合胞病毒感染后引起的IL-8释放也有明显抑制作用。结论 复方野马追胶囊具有明显的体外抗呼吸道合胞病毒感染、降低感染后气道炎症因子释放的作用。     

miR-940慢病毒表达载体的构建以及对鼻咽癌细胞的影响

目的 构建microRNA-940(miR-940)的慢病毒表达栽体,制备重组慢病毒感染人鼻咽癌细胞5-8F,检测其对细胞迁移和增殖的影响。方法 构建慢病毒载体,包装后感染人鼻咽癌细胞,通过加药筛选方法获得稳定过表达miR-940的人鼻咽癌细胞株5-8F/miR-940。实时定量PCR(RT-PCR)检测miR-940的表达量。MTT测定miR-940对5-8F体外增殖的影响。划痕试验检测miR-940对5-8F迁移的影响。结果 构建稳定过表达miR-940的慢病毒表达栽体。MTT证明miR-940可以抑制5-8F在体外的增殖。划痕试验说明miR-940可以抑制5-8F的迁移能力。结论 miR-940能够抑制5-8F在体外的增殖以及迁移能力。     

重庆婴幼儿轮状病毒分子流行病学特征及相关临床资料分析

目的研究重庆地区婴幼儿轮状病毒的分子流行病学特征和相关临床资料分析。方法收集2008年10月至2009年2月在重庆儿童医院就诊的患非细菌性急性腹泻的婴幼儿大便和问卷。先用胶体金法检测轮状病毒抗原,并经RT-PCR(逆转录PCR)方法证实为轮状病毒,然后用巢式RT-PCR方法进行VP7(G)、VP4(P)基因分型并分析相关临床资料。结果共收集到507份大便标本,胶体金法检测轮状病毒抗原阳性率50.69%(257/507)。147份轮状病毒VP6基因阳性标本中G分型结果:G1型占40.14%(59/147);G2型6.80%(10/147);G3型17.01%(25/147);G4型2.04%(3/147);G9型0.68%(1/147);尚有49份未能分型,占33.33%(49/147)。P分型结果:P[8]型占60.54%(89/147);P[4]型占6.12%(9/147);P[9]型和P[10]型各有1例,分别占0.68%(1/147);尚有47份未能分型。G、P型别组合最常见的是G1/P[8]型,占58.93%(33/56)。各G、P型别间临床症状比较无统计学差异。结论G、P分型结果与其他地区明显不同,...     

人胶质瘤自杀基因细胞系的建立及其在胶质瘤治疗研究中的应用

目的 构建CD基因工程化人脑胶质瘤细胞并在此基础上进行胶质瘤治疗研究。方法 通过In-fusion基因克隆的方法,构建携带CD基因慢病毒载体;通过293T细胞体外包装获得慢病毒,并测定病毒效价;通过慢病毒体外感染细胞获得CD基因工程化人脑胶质瘤细胞;通过流式分选获得基因稳定表达细胞;通过CCK-8评价加入5-FC前药和(或)HSV-1后细胞存活率。结果 成功构建pLVX-CD-IRES-ZsGreen1慢病毒载体并体外包装获得相应慢病毒;慢病毒感染人脑胶质瘤U87细胞后获得携带CD基因的阳性细胞,并通过体外培养30天后流式分选获得稳定阳性细胞;加入前药5-FC和(或)HSV-1后对携带CD基因的U87细胞杀伤作用明显(P<0.01),其中5-FC联合HSV-1对胶质瘤细胞作用更加高效(P<0.01)。结论 成功获得携带CD基因的人脑胶质瘤细胞;前药5-FC联合HSV-1对胶质瘤细胞具有更加高效的杀伤疗效。     

EXPERIMENTAL INFECTION OF ADULT TUPAIA BELANGERI YUNALIS WITH HUMAN ROTAVIRUS

This article deals with studies in late autumn 1981 0f the infection of wild adult Tupaia belangeri yunalis (a species of tree shrew caught in autumn in Yunnan province) with human rotavirus., 12 tupaias are infected in the first passage, 3 in the second passage and 3 in the third passage, 12/12, 2/3 and 2/3 0f the tu- paias develop diarrhea during the 3 passages. Electron microscopic observat.ion shoiws that 12/12, 3/3 and 2/3 0f the tupaias excrete rota- virus during the passages. Three tupaias died during the first passage and show mucosal ne- crosis and lymphocyte infiltration in sections of different intestinal parts. Immune electron mi- croscopically, anti-rotavirus antibody is assayed in sera of 2 infected tupaias, in both of which titer rises greater than 4 fo.lds in the convalescent phase serum as compared with the pre-infection serum. These results indicate that the adult tupaia is probably susceptible to human rota- virus.     

轮状病毒感染全身扩散诱发因素的初探

目的 探讨免疫低下、肠道混合感染因素在诱发轮状病毒（RV）肠道外扩散中的作用,为研究肠道病毒肠道外扩散的机制,为临床的防治提供参考。方法 健康昆明小鼠腹腔注射环磷酰氨制作免疫低下小鼠模型,分别经灌胃和腹腔两种途径接种RV;健康昆明小鼠相继灌胃接种产毒性大肠杆菌和RV,制作肠道混合感染小鼠模型;猝死小鼠,光镜下观察病理变化：各脏器原位杂交,原位PCR检测RV;初步调查RV腹泻合并轮状病毒血症患儿健康状况,检测TNFα、IL-2及锌、铁、铜、铅、钙、锰、镁7种微量元素水平。结果 光镜下：免疫低下组心、肝、肾,混合感染组肝、肾组织有病理改变：原位杂交：免疫低下腹腔注射RV组、肠道混合感染组肾小管均呈阳性。原位PCR：肠道混合感染组肝、肾,免疫低下腹腔注射组心、肝、肾、胰呈阳性;轮状病毒血症患儿多数存在免疫与营养方面的异常。结论 免疫低下、肠道混合感染、营养素不足可能是诱发和／或加重RV肠道外扩散和感染的重要原因之一。     

一种培养鉴定风疹病毒的简便试验方法的建立

目的建立使风疹病毒(RV)在Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞株)上产生的细胞病变效应(CPE)易于观察的简便试验方法,以利于病毒的分离、培养与鉴定.方法在RV接种Vero细胞4天后,用不同pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0)的融合营养液处理细胞,继续按常规条件培养1天后,在倒置显微镜下观察RV引起的特征性CPE-多核巨细胞,染色后计数多核巨细胞的形成率.同时检测在不同条件(融合时间、病毒接种初始滴度)下,多核巨细胞形成率的变化.结果感染RV的Vero细胞经过酸性融合营养液的处理,可出现RV特征性CPE-多核巨细胞.发现在37℃、pH 5.0的酸性融合营养液处理染毒细胞10 min后,继续培养1天,出现的细胞病变形态最典型,染色后计数发现多核巨细胞的形成率最高,为14.7%(P<0.01).融合处理的时间对多核巨细胞的形成率没有影响.随着病毒接种初始滴度的降低,多核巨细胞的形成率也相应降低.结论此方法简单、易行,使RV在Vero细胞上产生的细胞病变清晰易观察.     

野生树鼩肠道蠕虫感染调查及分析

目的调查野生树鼩(Tupaia belangeri Chinensis)感染肠道蠕虫的主要种类并进行鉴定,为今后树鼩寄生虫检测提供形态学参考,为实验树鼩寄生虫控制提供依据。方法采集203只野外来源的树鼩新鲜粪便,虫卵采用常规粪便直接涂片以及孵化后显微镜观察;绦虫采用压片、固定染色,以及线虫经透明后体视镜观察,虫卵与成虫相对应鉴定。结果野生树鼩肠道蠕虫的总感染率为75.86%,主要感染种类有3种,经鉴定为长膜壳绦虫、奇口线虫和粪类圆线虫,感染率分别为27.67%,30.06%和51.52%。三种蠕虫的混合感染率为4.55%。两种线虫虫卵在树鼩粪便中多为含胚胎形态。结论野生树鼩肠道蠕虫的感染率较高。对野外引入的新种源必须隔离检疫,进行针对性的药物治疗,才能有效地控制肠道寄生虫病的传播。     

人乙型肝炎病毒在树鼩中传代感染的研究

用人乙型肝炎病毒(HHBV·)感染树鼩(Tree shrews)后,取其HBsAg及(或)HBeAg阳性的树齣血清传代感染另一批树鼩;18只树鼩分四批感染至第四代,经检测发现17只树鼩血清或肝细胞中HBV标志物阳性(94.4%);血清转氨酶(SGPT)升高,肝组织有不同程度的炎症变化。此结果表明HHBV能够在树鼩间连续传代复制,为人乙型肝炎病毒感染树鼩动物模型的建立提供又一佐证。     

轮状病毒感染乳鼠后细胞因子水平及肠道外损伤的影响

目的:建立BALB/c乳鼠肠道感染轮状病毒(RV)的动物模型,检测血Th1细胞因子Ⅰγ-干扰素(IFN-γ)和Th17细胞因子[白细胞介素-17(IL-17)]的水平,比较两类细胞因子在不同时间点变化的差异性,进一步探讨RV感染后机体的细胞免疫过程及相关细胞因子的关系,深入了解RV感染的免疫病理特点,为临床防治RV感染及肠道外损伤寻找新的办法.方法:以恒河猴胚肾细胞(MA-104)培养猴RV SA-11株,扩增.实验动物选用清洁级BALB/c乳鼠603,日龄3~5 d,雌雄不拘,随机分为2组,每组303,即观察组(RV感染模型组):胃内灌入100μL(1×10-4)TCD50感染性滴度的SA-11株RV;对照组:胃内灌入100μL0.9%氯化钠注射液.接种当天以第0天计,每天观察乳鼠情况,收集大便检测RV抗原.分别在接种后的第3天和第8天留取血清检测IFN-γ和IL-17水平.处死乳鼠,留取肝脏、心脏等光镜下观察形态学改变.结果:感染后第3天观察组IFN-γ水平高于对照组(P<0.05),第8天时水平与对照组差异无统计学意义(P>0.05);感染后第3天观察组IL-17水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),第8天时水平明显高于对照组(P<0.01).光镜下观察组乳鼠第3天大部分肝细胞肿胀,中、重度空泡变性,灶状淋巴细胞浸润;心肌细胞浊肿,心肌间质水肿,心内膜、心肌层淋巴细胞浸润,第8天时个别肝脏细胞稍肿胀,轻度空泡变性,心肌细胞大致正常.对照组肝脏及心脏未见明显病理改变.结论:乳鼠感染RV早期以IFN-γ表达为主,且伴有不同程度的肠外脏器损害,但总体上程度轻.而后期IL-17应答占优势,说明IL-17可能在RV的控制上起一定作用,且对肠外脏器的损害有一定修复作用.