人SMYD3基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

构建人SMYD3基因原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过PCR方法从重组质粒pcD-NA-SMYD3中扩增得到SMYD3基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体。将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pGEX-SMYD3。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明人SMYD3基因在大肠杆菌中获得了良好的表达。实验成功地构建了SMYD3基因原核表达载体并在大肠杆菌中获得良好表达,为进一步研究SMYD3蛋白功能奠定了基础。     

原癌基因Pokemon的克隆原核表达及纯化

目的克隆小鼠Pokemon(POKeryhroidmyeloidontogenicfactor)基因并进行原核表达及重组蛋白的纯化。方法应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆人pGEM-T-easy载体,经鉴定后,以限制性核酸内切酶分别消化重组质粒及原核表达载体pET-30a(+),体外定向连接,进行PCR、内切酶酶切及DNA序列分析,阳性重组表达质粒进一步转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达,经Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,Westernblotting检测其特异性。结果限制性核酸酶切及序列分析表明重组表达质粒包含Pokemon基因编码区,阅读框架无移位;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有预期相对分子质量为36000的重组蛋白表达,经亲和层析纯化后,融合蛋白的纯度达到90%以上;Westernblotting印迹表明纯化的融合蛋白具有特异的免疫反应特性。结论采用基因克隆技术成功构建了Pokemon原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,为后期抗体的制备及进一步研究该基因与肿瘤发生的关系奠定了基础。     

脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及其表达与纯化

目的构建大鼠全长脂联素(fAd)和球状域脂联素(gAd)重组表达载体PQE30/ADPN,并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白,对表达产物进行纯化和鉴定。方法将纯化的脂联素克隆产物与原核表达载体PQE30通过双酶切方法位点特异地连接在一起,再转化入大肠杆菌M15感受态细胞中,并用IPTG诱导表达,并通过亲和层析、去盐、去除内毒素等纯化蛋白。结果PCR获得长度分别为684bp(fAd)和402bp(gAd)的目的片段,经PQE30原核表达载体连接、筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank中脂联素序列(序列号:NM_144744)完全一致;含重组脂联素质粒的大肠杆菌在30℃经0.5mmol.L-1IPTG诱导6h时,可溶性蛋白表达量最高。结论成功克隆大鼠脂联素基因,并在大肠杆菌中获得有效表达。     

人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人脂联素重组表达载体PQE30/ADPN,并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白,对表达产物进行鉴定。方法:将构建好的人脂联素克隆载体PUC57/ADPN与原核表达载体PQE30通过双酶切方法位点特异地连接在一起,再转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中。通过筛选得到含有人脂联素基因的重组载体PQE30/ADPN,并用IPTG在大肠杆菌M15中诱导表达。结果:PCR获得长度为753bp目的片段,经PQE30原核表达载体连接、筛选及序列分析后,证实所插入的目的片段与GenBank检索的人脂联素cDNA序列(Accession NM-004797)100%匹配;含重组Adiponectin质粒的大肠杆菌经0.4mmol/L的IPTG诱导6h后有表达。结论:应用并成功构建了人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN,且在大肠杆菌中获得有效表达。     

人源性防御素HD-5的原核表达及抗真菌作用的初步研究

【摘要】目的 构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体,纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法 以pcDNA3.1(+)/HD-5为模板,聚合酶链反应（PCR）扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载体,并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴定正确的质粒转化入大肠杆菌M15后进行异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。通过镍柱亲和层析纯化蛋白并进行蛋白复性,蛋白免疫印迹（Western blot）鉴定纯化产物。以KB纸片法初步验证纯化获得的重组蛋白对白色假丝酵母菌的抑菌活性。结果 成功克隆了HD-5基因并构建了重组质粒pQE-30Xa/HD-5。重组质粒在大肠杆菌M15中诱导表达出HD-5融合蛋白;Western blot分析结果显示纯化后的融合蛋白与目的蛋白相符;KB纸片法证实纯化后的融合蛋白对白色假丝酵母菌具有一定的抑菌活性。结论 成功构建HD-5原核表达载体,经诱导表达后纯化获得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。     

重组 GST-β-GT 融合蛋白的原核表达、纯化及活性鉴定

目的：构建噬菌体β‐GT蛋白的原核重组体系,诱导表达、纯化GST‐β‐GT 融合蛋白并对其进行酶活性测定。方法利用PCR技术从T4噬菌体中扩增β‐GT基因;经T‐A克隆,获得β‐GT基因片段,经酶切连接,构建原核表达载体pGEX‐6P‐1‐β‐GT ;经测序鉴定序列正确后,将所构建的载体转化进入大肠埃希菌BL21（DE3）中进行表达。利用IPTG诱导,经10％ SDS‐PAGE鉴定目的蛋白表达后,采用GST柱纯化目的蛋白;通过酶切和qPCR鉴定其活性。结果成功扩增了噬菌体β‐GT基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达出GST‐β‐GT融合蛋白;通过GST柱纯化后获得了GST‐β‐GT融合蛋白,纯度达95％;通过酶切和qPCR验证,此GST‐β‐GT融合蛋白具有T4‐β‐GT酶的活性。结论。原核表达GST‐β‐GT融合蛋白具有糖基转移酶活性。     

GP73 融合蛋白原核表达及纯化

目的：原核表达并纯化高尔基体糖蛋白-73（GolgiProtein73,GP73）。方法以人肝癌细胞系HepG2总RNA为模板,经RT-PCR扩增GP73基因,克隆至原核表达载体pET-21a（＋）-TRX中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。His-tag磁珠纯化重组蛋白GP73,SDS-PAGE鉴定。结果克隆目的基因的序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pET21a（＋）-TRX-GP73经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子量为80 kD,与预期相符。结论本实验成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化了GP73重组蛋白,为后续研究奠定了基础。     

AcAP5蛋白N端片段的表达、纯化与活性评价(英文)

犬钩虫抗凝肽5(Ancylostoma anticoagulant peptide 5,AcAP5)N端40个氨基酸片段(N40)含有与FXa结合的结构域。为研究N40的FXa抑制作用,我们克隆、表达和纯化了N40,并检测其生物活性。用PCR扩增N40基因;将PCR产物克隆至原核表达载体pET-30a中,构建质粒pET30a-N40;将其转化入大肠杆菌E.coli.BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定,经过镍柱亲和层析纯化,用BCA法进行蛋白定量,测定该蛋白抑制FXa的活性。限制性酶切鉴定和基因测序结果显示重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果显示目的蛋白在E.coli.BL21(DE3)中为可溶性表达,亲和层析纯化后获得了纯度约90%的蛋白,经活性鉴定该蛋白确有抑制FXa的活性。     

Daxx-C626-740原核细胞表达载体的构建与诱导表达

目的为了研制Daxx-C抗体并观察其在宫颈癌细胞中的应用效果,构建原核表达载体pET28a／DM626-740,将其在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化表达产物,鉴定其抗原性。方法用PRIMER5．0软件设计Daxx-C基因片段（氨基酸626-740）特异性引物,引入BamHl和SalI酶切位点,PCR扩增目的基因。将PCR产物连入载体pMD18-T,构建pMD18-T／DM626-740;然后,将BamHI和Sail酶切产物连入载体pET28a,经酶切鉴定及DNA序列分析后,构建原核表达载体pET28a／DM626-740。将其转化E．coliBL21,IPTG诱导表达,利用Ni琼脂糖凝胶层析柱纯化表达产物,Western-blot检测表达物与纯产物。结果双酶切和DNA测序结果显示,PCR正确扩增了Daxx-C基因片段并成功连入载体pET28a,构建了原核表达载体pET28a／DM626-740,该质粒在E．coli中诱导表达分子量约19kDa目的蛋白,且该蛋白能被抗Daxx抗体检出。结论构建的原核表达载体pET28a／DM626-740能在E.coli中表达目的的蛋白6His-DM626-740,并具有良好的抗原性。     

抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因(VH),并构建其原核表达载体.方法 从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出VH cDNA,用HindⅢ和XhoⅠ酶切纯化的RT-PCR产物和原核表达载体pET28a( ),在T4 DNA连接酶作用下室温连接.重组质粒经酶切鉴定,阳性克隆测序并进行序列分析.结果 扩增出VH cDNA片段,大小约为370bp,重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致.VH基因序列长度为366bp,编码122个氨基酸.VH基因属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ亚类.结论 成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因,并成功构建其原核表达载体.     

抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2融合蛋白的构建与序列测定

目的:构建以人抗乙肝表面抗原（HBsAg）单链抗体（ScFv）为导向作用,白细胞介素-2（IL-2）为治疗作用的融合蛋白原核表达载体pQE 40/ScFv-IL-2。方法:应用PCR技术将抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2在分子水平上进行基因重组,构建中间载体pGEM7Zf（+）/ScFv-IL-2,经酶切鉴定及序列测定正确后,将目的基因片段克隆到pQE 40表达载体中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约4.3×104Da处,可见蛋白表达带。以鼠抗人IL-2单克隆抗体经免疫印迹验证,该表达蛋白为所设计的融合蛋白。结论:融合蛋白ScFv-IL-2的成功构建及表达,为融合蛋白的纯化和研究开发新型的乙肝导向治疗的基因工程药物打下良好的基础。     

HPV6bL1-TpN15嵌合基因原核表达系统的构建

目的 分别从梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)临床菌株和尖锐湿疣(cA)组织中扩增人乳头瘤病毒(HPV)6b型L1和TpN15基因,构建HPV6b L1-TpN15嵌合基因及其原核表达系统.方法 采用PCR分别从CA组织及Tp临床菌株中扩增HPV6b L1和TpN15基因片段,构建HPV6b L1-TpN15嵌合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a(+)构建重组质粒pET32a(+)/HPV6b L1-TpN15,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21 (DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后表达的融合蛋白用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、蛋白质印迹法分析鉴定.结果 HPV6b L1-TpN15融合蛋白在原核表达系统中得到了较高表达.结论 原核表达的HPV6bL1-TpN15融合蛋白具较强的抗原性.     

大鼠血栓调节蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的研究大鼠血栓调节蛋白基因的扩增、克隆及在原核细胞中的表达。方法以大鼠基因组DNA为模板,进行PCR扩增,用pMD18-Tsimple vector进行T克隆并测序。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,将目的基因克隆到pET-28a(+)表达载体质粒中,转化E.coliBL21(DE3)表达重组蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物。结果含有大鼠血栓调节蛋白基因的PCR产物约为1850bp。重组pMD18-Tsimple vector质粒和重组pET-28a(+)质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,有相应大小的目的片段,测序结果正确。经IPTG诱导,重组pET-28a(+)质粒在E.coliBL21(DE3)中有相对分子质量约为72000的融合蛋白表达。结论成功克隆了大鼠血栓调节蛋白基因,并成功表达了该基因编码的蛋白。     

肿瘤抗原基因MAGE-A9的克隆及原核表达

目的扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A9cDNA,构建原核表达载体,表达并纯化MAGE-A9蛋白。方法从人肝癌组织提取总RNA,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从中扩增出MAGE-A9 cDNA,插入载体pMD18-T中,测序正确后,构建重组表达载体pBAD/gⅢ-MAGE-A9,转化大肠杆菌TOP10株。以L-Arabi-nose进行诱导表达,并纯化。结果获得MAGE-A9cDNA,测序结果与GenBank一致。成功构建表达载体,表达可溶重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其相对分子质量为35 000。结论成功地构建了pBAD/gⅢ-MAGE-A9原核表达质粒,获得了MAGE-A9蛋白,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

抗铜绿假单胞菌PcrV的scFv-Fc抗体的制备及体外活性研究

目的 制备靶向铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)III型分泌系统组件蛋白PcrV的scFv-Fc形式的单克隆抗体MFa,并研究其体外对铜绿假单胞菌生物膜形成及细胞黏附和侵入的影响。方法 将编码MFa的DNA序列合成后,插入到真核表达载体中,获得重组质粒,再采用聚乙烯亚胺(PEI)将质粒转染HEK293E细胞并获得瞬时表达;表达的产物通过HiTrap MabSelect SuRe柱进行纯化,所得到的抗体采用SDS-PAGE分析纯度,采用BCA法测定蛋白浓度。为了检测MFa抗体与PcrV抗原的亲和力,对PcrV抗原进行表达纯化,方法是将PcrV目的序列插入到pET28a表达载体中,转化E. coli BL21(DE3)获得宿主菌,在0.5mmol/L IPTG 15℃的条件下诱导过夜,并通过His-Tag标签进行亲和纯化。对于纯化的MFa抗体与PcrV抗原通过Western blot、ELISA、SPR(表面等离子共振)研究抗体与抗原的亲和力,并研究抗体体外对生物膜形成的影响,对铜绿假单胞菌黏附与侵入HeLa细胞的影响。结果 MFa抗体在HEK293瞬转系统成功获得表达与纯化,且对PcrV蛋白具有较好的亲和活性,KD值为492.2nmol/L。功能实验证实,MFa抗体能够降低铜绿假单胞菌生物膜的形成,降低铜绿假单胞菌对HeLa细胞黏附与侵入作用。结论 靶向PcrV的scFv-Fc抗体MFa具有对铜绿假单胞菌引起的感染的潜在效用,具有进一步开发为抗铜绿假单胞菌治疗药物的价值。     

人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。结论成功构建了抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体