半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层的组织相容性

目的:观察小肠黏膜下层与半月板纤维软骨细胞的组织相容性,评价其作为组织工程半月板支架材料的可行性及应用价值。方法:实验于2005-06/12在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。①物理和化学方法处理猪小肠黏膜下层支架材料。②体外复合培养兔半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层。③通过苏木精-伊红染色观察小肠黏膜下层的组织学结构表现;倒置相差显微镜观察细胞生长及与生物材料附着的情况;扫描电镜观察半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层复合情况。结果:①小肠黏膜下层组织学检查:经物理方法处理后的小肠黏膜下层表面有大量残留的细胞碎屑;化学方法处理后的小肠黏膜下层表面没有残留的细胞碎屑,胶原纤维未受损。②细胞生长及附着情况:相差显微镜观察,复合培养第1～4天时细胞增殖不明显,第5天有较多细胞直接贴附于材料边缘,第7天有大量细胞向材料边缘聚集,细胞形态多为梭形或多角形,连成一片。③细胞与支架复合情况:扫描电镜观察,单纯小肠黏膜下层支架材料可见黏膜表面较粗糙,孔隙较多,大小不一。半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层复合培养7d可见细胞间通过突起相互连接附着在材料表面,细胞在小肠黏膜下层支架材料上生长、黏附、增殖良好,并分泌大量的细胞外基质成分。结论:小肠黏膜下层具有良好的组织相容性,可以用作组织工程半月板的支架材料。     

以脱细胞牛软骨基质为支架体外构建组织工程软骨的实验研究

目的以脱细胞牛软骨基质（acellular cartilaginous matrix,ACM）作支架体外构建组织工程软骨,了解其作为软骨组织工程支架的可行性。方法 2003年1月-2005年12月联合应用冻干-反复冻融-酶消化法对牛软骨基质行脱细胞处理。将体外培养扩增的2～5代兔软骨细胞接种在材料上,体外培养3周,观察软骨细胞在支架材料上的生长分布情况。结果软骨细胞在制备的ACM上可较好地黏附生长,并且分泌大量Ⅱ型胶原和葡萄糖胺聚糖;但软骨细胞不能长入ACM内部,只能在表层生长,少量软骨细胞分布在ACM孔隙中。结论 ACM支架材料具有良好的细胞相容性和活性,并且能促进软骨细胞增殖和维持软骨细胞表型。     

以交联透明质酸钠为支架体外构建组织工程软骨简

背景：采用组织工程技术再生和重建软骨是目前修复软骨组织缺损效果最好、最有应用前景的方法。 目的：以体外培养的软骨细胞和交联透明质酸钠为支架材料,开发一套体外构建组织工程软骨的完整方案。方法：分离新西兰兔膝关节软骨细胞,制成细胞悬液滴加于交联透明质酸钠支架上,体外复合培养21 d,提取RNA进行RT-PCR检测,制备冰冻切片进行显微观察和免疫组织化学观察。 结果与结论：软骨细胞接种于交联透明质酸钠支架材料后,可贴附于支架上生长,并且大量细胞聚集成团,在支架材料的纤维间隙中生长或呈单层细胞附着于支架材料纤维。细胞-支架复合物表达软骨组织特异性蛋白聚糖基因和Ⅱ型胶原α1基因,以及软骨组织特异性蛋白Ⅱ型胶原蛋白,可维持软骨细胞表型。表明培养的细胞-支架复合物在体外培养可形成软骨细胞外基质,有望获得组织工程软骨组织。     

卵磷脂、多聚赖氨酸二次包埋新型支架材料的亲水性及对人鼻中隔软骨细胞的吸附力(英文)

背景: 甲壳胺是一种天然生物材料, 具有良好的生物相容性、可降解吸收性及优良的力学性能, 但在软骨组织工程中可否成为一种较理想的细胞支架?目的: 观察以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋新型支架- 聚丙交酯- 乙交酯共聚物 / 甲壳胺无纺布, 对支架亲水性和对人鼻中隔软骨细胞吸附力的改变, 及对人鼻中隔软骨细胞功能的影响。设计: 空白对照实验。单位: 解放军南京军区南京总医院耳鼻咽喉- 头颈外科。材料: 实验于 2005- 10/2006- 06 于解放军南京军区总医院耳鼻咽喉-头颅外科实验室完成。甲壳胺无纺布( 海南欣龙公司) , 主要技术参数为: 脱乙酰度≥90%, 相对分子质量(2～5)×105; 聚丙交酯- 乙交酯共聚物 / 甲壳胺无纺布支架为南京军区南京总医院耳鼻咽喉- 头颈外科与中山大学高分子研究所合作自行制备, 其主要技术参数为: 单体丙交酯和乙交酯的摩尔比为 75∶25, 孔隙率 82%～86%, 孔径 100～300 μm, 剪切强度为 48 MPa, 厚度约 1.5 mm, 完全降解时间 14～18 周。人鼻中隔软骨细胞为无菌条件下取鼻中隔偏曲手术患者的鼻中隔软骨。方法: 将 PLGA/ 甲壳胺无纺布支架剪成 1.5 cm×1.5 cm 大小的片状, 体积分数为 0.01 的卵磷脂无水乙醇及 1 g/L 多聚赖氨酸中浸泡 6 h, 干燥后紫外线照射 1 h, 体积分数为 0.75 乙醇中浸泡 24 h, 大量 Hanks 液冲洗后孵育 24 h。得到含不同成分的 2 种类型支架: ①单纯支架; ②卵磷脂 多聚赖氨酸包埋的支架。取第 3 代的人鼻中隔软骨细胞制成细胞悬液, 将细胞悬液种于 2 种支架上, 通过观察人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上扩散程度来判断其亲水性大小, 在相差显微镜下观察人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上是否飘动来判断细胞与支架的吸附情况; 同时观察细胞生长繁殖及基质产生情况。主要观察指标: ①两种支架材料亲水性( 人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上扩散程度) 、对细胞的吸附力(人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上是否飘动)。②细胞生长繁殖及基质产生情况。结果: ①单纯支架加入人鼻中隔软骨细胞悬液后悬液先呈球型附在支架表面, 然后缓慢地扩散到支架空隙内。培养期间相差显微镜观察见细胞成团地附在支架纤维表面, 晃动培养皿可见细胞团漂浮不定[黏附率为(21±3.7)%], 随着培养时间延长无基质产生。②卵磷脂 多聚赖氨酸包埋的支架加入人鼻中隔软骨细胞悬液后悬液迅速均匀地扩散到支架空隙内[黏附率为(89±5.6)%, 高于单纯支架组], 表明支架有较强的亲水性; 相差显微镜下见软骨细胞以单个或群落状均匀分布于支架纤维之间及吸附在支架纤维表面, 晃动培养皿细胞团无飘动, 散落在培养皿底部的细胞较少, 表明支架对细胞有较强的吸附力; 培养 1 周, 支架纤维间有呈蜘蛛网状基质产生, 随着培养时间延长, 基质产生旺盛。结论: 以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的聚丙交酯- 乙交酯共聚物 / 甲壳胺无纺布的新型生物支架, 亲水性良好, 对人鼻中隔软骨细胞的吸附力明显增强, 并可促进软骨细胞分泌基质。     

卵磷脂、多聚赖氨酸二次包埋新型支架材料的新水性及对人鼻中隔软骨细胞的吸附力

背景: 甲壳胺是一种天然生物材料, 具有良好的生物相容性、可降解吸收性及优良的力学性能, 但在软骨组织工程中可否成为一种较理想的细胞支架?目的: 观察以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋新型支架- 聚丙交酯- 乙交酯共聚物 / 甲壳胺无纺布, 对支架亲水性和对人鼻中隔软骨细胞吸附力的改变, 及对人鼻中隔软骨细胞功能的影响。设计: 空白对照实验。单位: 解放军南京军区南京总医院耳鼻咽喉- 头颈外科。材料: 实验于 2005- 10/2006- 06 于解放军南京军区总医院耳鼻咽喉-头颅外科实验室完成。甲壳胺无纺布( 海南欣龙公司) , 主要技术参数为: 脱乙酰度≥90%, 相对分子质量(2～5)×105; 聚丙交酯- 乙交酯共聚物 / 甲壳胺无纺布支架为南京军区南京总医院耳鼻咽喉- 头颈外科与中山大学高分子研究所合作自行制备, 其主要技术参数为: 单体丙交酯和乙交酯的摩尔比为 75∶25, 孔隙率 82%～86%, 孔径 100～300 μm, 剪切强度为 48 MPa, 厚度约 1.5 mm, 完全降解时间 14～18 周。人鼻中隔软骨细胞为无菌条件下取鼻中隔偏曲手术患者的鼻中隔软骨。方法: 将 PLGA/ 甲壳胺无纺布支架剪成 1.5 cm×1.5 cm 大小的片状, 体积分数为 0.01 的卵磷脂无水乙醇及 1 g/L 多聚赖氨酸中浸泡 6 h, 干燥后紫外线照射 1 h, 体积分数为 0.75 乙醇中浸泡 24 h, 大量 Hanks 液冲洗后孵育 24 h。得到含不同成分的 2 种类型支架: ①单纯支架; ②卵磷脂 多聚赖氨酸包埋的支架。取第 3 代的人鼻中隔软骨细胞制成细胞悬液, 将细胞悬液种于 2 种支架上, 通过观察人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上扩散程度来判断其亲水性大小, 在相差显微镜下观察人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上是否飘动来判断细胞与支架的吸附情况; 同时观察细胞生长繁殖及基质产生情况。主要观察指标: ①两种支架材料亲水性( 人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上扩散程度) 、对细胞的吸附力(人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上是否飘动)。②细胞生长繁殖及基质产生情况。结果: ①单纯支架加入人鼻中隔软骨细胞悬液后悬液先呈球型附在支架表面, 然后缓慢地扩散到支架空隙内。培养期间相差显微镜观察见细胞成团地附在支架纤维表面, 晃动培养皿可见细胞团漂浮不定[黏附率为(21±3.7)%], 随着培养时间延长无基质产生。②卵磷脂 多聚赖氨酸包埋的支架加入人鼻中隔软骨细胞悬液后悬液迅速均匀地扩散到支架空隙内[黏附率为(89±5.6)%, 高于单纯支架组], 表明支架有较强的亲水性; 相差显微镜下见软骨细胞以单个或群落状均匀分布于支架纤维之间及吸附在支架纤维表面, 晃动培养皿细胞团无飘动, 散落在培养皿底部的细胞较少, 表明支架对细胞有较强的吸附力; 培养 1 周, 支架纤维间有呈蜘蛛网状基质产生, 随着培养时间延长, 基质产生旺盛。结论: 以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的聚丙交酯- 乙交酯共聚物 / 甲壳胺无纺布的新型生物支架, 亲水性良好, 对人鼻中隔软骨细胞的吸附力明显增强, 并可促进软骨细胞分泌基质。     

改性聚乳酸-羟基乙酸/Ⅰ型胶原复合支架与兔耳软骨细胞的细胞相容性

背景:聚乳酸-羟基乙酸是一种应用前景较好的细胞支架材料,其亲水性和细胞亲和性较差,因此对其改性很有必要.目的:观察改性聚乳酸-羟基乙酸/Ⅰ型胶原复合支架的亲水性及与兔耳软骨细胞的细胞相容性.方法:利用多聚赖氨酸对聚乳酸-羟基乙酸改性后与Ⅰ型胶原构成改性复合支架,倒置显微镜下观察支架的大体结构.将改性复合支架(实验组)与聚乳酸-羟基乙酸支架(对照组)分别浸泡在双蒸水中,间隔0.5,1,2,4,8,12,24 h后计算吸水率.用酶消化法培养兔耳软骨细胞并传代,取第2代软骨细胞,浓度为1×10~(11)L~(-1)接种在两种支架上并培养,倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况,采用细胞计数法计算细胞接种24 h后支架对细胞的吸附率;以及采用细胞增殖法(MTT比色试验)分别于1,2,4,6 d测细胞吸光度值.结果与结论:改性复合支架具有高孔隙率,表面粗糙度较对照组增加.两种支架吸水率在相同时间点比较差异有显著性意义(P<0.01),说明改性复合支架具有较好的亲水性.第2代软骨细胞接种后24 h,实验组对细胞的吸附率为0.908 0±0.019 2,对照组为0.733 2±0.047 5,两组比较差异有显著性意义(P<0.05),说明改性复合支架具有较好的细胞亲和性.软骨细胞在实验组和对照组支架上接种培养后1,2,4,6 d吸光度值比较,差异均有显著性意义(P<0.05),说明改性复合支架对细胞增殖有显著的促进作用.     

胶原/羟基磷灰石复合支架负载软骨细胞构建组织工程软骨

背景:新型复合软骨组织工程支架克服了传统支架的诸多不足,如组织相容性差、生物力学性能不足、降解过快、材料单一、难与关节软骨的分层结构相匹配等,为软骨组织工程的发展提供新的途径。目的:观察具有柱状分层结构的胶原/羟基磷灰石复合支架对软骨细胞的吸附作用,以及对软骨细胞生物学性状的影响,评价其作为软骨组织工程支架的可行性与价值。设计:开放性实验。单位:中山大学附属第三医院骨科,华南理工大学材料学院。材料:实验于2004-06/11在中山大学附属第三医院动物实验中心完成。选取2周龄普通级健康新西兰白兔1只,雄性,饲养环境温度20℃,湿度40%。方法:①在羟基磷灰石中加入少量的去离子水,分散后加入I型胶原溶液搅拌复合,并按一定比例加入碳二亚氨,调配形成不同比例的胶原/羟基磷灰石复合物,并逐层加入模具,最上层采用纯胶原,底层为纯羟基磷灰石。将制备好的柱状分层的胶原/羟基磷灰石复合材料冷冻干燥后,经环氧乙烷气体消毒后备用。②体外培养幼兔关节软骨细胞并扩增,吸附于多孔胶原/羟基磷灰石复合支架上三维立体培养,通过相差倒置显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。主要观察指标:①胶原/羟基磷灰石多孔支架的形貌观察。②体外培养的软骨细胞生物学性状观察。③胶原/羟基磷灰石多孔支架材料与软骨细胞相容性的观察。结果:①胶原/羟基磷灰石多孔支架的形貌观察:胶原/羟基磷灰石为具有一定力学强度的柱状分层的三维多孔支架,最上层为纯胶原,底层为纯羟基磷灰石,中间为胶原与羟基磷灰石复合。扫描电镜可见支架内具有不规则的通孔结构,孔径较均匀,相互连通,平均孔径约为147μm。②体外培养的软骨细胞生物学性状观察:刚分离的软骨细胞为球形,活细胞率达95%。24h后细胞开始贴壁,逐渐伸展为三角或多角形,内含分泌颗粒。细胞保持单层生长,传代后增殖速度加快,4d铺满培养瓶。随着传代次数的增加,增殖速度开始减慢,当传到第6代时,细胞分裂能力明显下降,细胞变形明显,体积变大,梭形为主,边沿模糊,折光性弱,表现出细胞老化和向成纤维细胞反分化的趋势。③胶原/羟基磷灰石多孔支架材料与软骨细胞相容性的观察:多孔胶原/羟基磷灰石复合支架亲水性好,软骨细胞吸附于支架表面,增殖并逐渐顺孔隙迁徙至支架内部,在孔壁贴附良好,表型维持稳定,分泌胞外基质。结论:柱状分层结构的胶原/羟基磷灰石复合支架具有良好的细胞相容性,较单纯胶原力学性能更强,是比较理想的软骨组织工程支架材料。     

滑膜间充质干细胞与软骨细胞三维条件下混合培养向软骨细胞的分化

背景：软骨细胞通过自分泌及旁分泌的作用可以为滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化提供所需的生长因子及微环境,三维条件下更有利于细胞的黏附增殖与分化。目的：观察滑膜间充质干细胞与软骨细胞混合培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中向成软骨细胞分化的能力。方法：取SD大鼠滑膜组织及软骨组织,用酶消化法获得滑膜间充质干细胞及软骨细胞分别进行培养。取第3代滑膜间充质干细胞及第2代软骨细胞,将二者以1∶2的比例混合培养负载于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料21 d,进行激光共聚焦扫描及免疫组织化学检测。结果与结论：培养72 h后,扫描电镜观察细胞黏附于支架材料表面,并可见细胞分泌大量基质成分。培养21 d后,激光共聚焦扫描可见细胞在支架表面分布均匀,逐层扫描后细胞逐渐减少。免疫组织化学检测可见基质能被Ⅱ型胶原染色,细胞染色呈现棕黄色。结果表明壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料提供三维生长空间,利用软骨细胞分泌生长因子及细胞间的相互作用可以诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化。     

胶原／羟基磷灰石复合支架负载软骨细胞构建组织工程软骨

背景：新型复合软骨组织工程支架克服了传统支架的诸多不足，如组织相容性差、生物力学性能不足、降解过快、材料单一、难与关节软骨的分层结构相匹配等，为软骨组织工程的发展提供新的途径。目的：观察具有柱状分层结构的胶原／羟基磷灰石复合支架对软骨细胞的吸附作用，以及对软骨细胞生物学性状的影响，评价其作为软骨组织工程支架的可行性与价值。设计：开放性实验。单位：中山大学附属第三医院骨科，华南理工大学材料学院。材料：实验于2004-06／11在中山大学附属第三医院动物实验中心完成。选取2周龄普通级健康新西兰白兔1只，雄性，饲养环境温度20℃，湿度40％。方法：①在羟基磷灰石中加入少量的去离子水，分散后加入Ⅰ型胶原溶液搅拌复合，并按一定比例加入碳二亚氨，调配形成不同比例的胶原／羟基磷灰石复合物，并逐层加入模具，最上层采用纯胶原，底层为纯羟基磷灰石。将制备好的柱状分层的胶原／羟基磷灰石复合材料冷冻干燥后，经环氧乙烷气体消毒后备用。②体外培养幼兔关节软骨细胞并扩增，吸附于多孔胶原／羟基磷灰石复合支架上三维立体培养，通过相差倒置显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。主要观察指标：①胶原／羟基磷灰石多孔支架的形貌观察。②体外培养的软骨细胞生物学性状观察。③胶原／羟基磷灰石多孔支架材料与软骨细胞相容性的观察。结果：①胶原／羟基磷灰石多孔支架的形貌观察：胶原／羟基磷灰石为具有一定力学强度的柱状分层的三维多孔支架，最上层为纯胶原，底层为纯羟基磷灰石，中间为胶原与羟基磷灰石复合。扫描电镜可见支架内具有不规则的通孔结构，孔径较均匀，相互连通，平均孔径约为147μm。②体外培养的软骨细胞生物学性状观察：刚分离的软骨细胞为球形，活细胞率达95％。24h后细胞开始贴壁，逐渐伸展为三角或多角形，内含分泌颗粒。细胞保持单层生长，传代后增殖速度加快，4d铺满培养瓶。随着传代次数的增加，增殖速度开始减慢，当传到第6代时，细胞分裂能力明显下降，细胞变形明显，体积变大，梭形为主，边沿模糊，折光性弱。表现出细胞老化和向成纤维细胞反分化的趋势。③胶原／羟基磷灰石多孔支架材料与软骨细胞相容性的观察：多孔胶原／羟基磷灰石复合支架亲水性好，软骨细胞吸附于支架表面，增殖并逐渐顺孔隙迁徙至支架内部，在孔壁贴附良好，表型维持稳定，分泌胞外基质。结论：柱状分层结构的胶原／羟基磷灰石复合支架具有良好的细胞相容性，较单纯胶原力学性能更强，是比较理想的软骨组织工程支架材料。     

绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨构建中的示踪作用

目的:探讨绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨体外构建和体内移植修复关节软骨缺损中对细胞的示踪作用。方法:实验于2003-09/12在第三军医大学西南医院中心实验室完成。选取清洁级雄性3～4周龄日本大耳白兔2只作为供体,麻醉处死后,切取关节软骨,系列酶消化分离软骨细胞,洗涤,37℃于体积分数为0.05的CO2中培养,传代扩增。再选取清洁级雄性4月龄日本大耳白兔2只作为受体。首先用反转录病毒载体pLEGFPN1感染软骨细胞,将胶原凝胶包埋的绿色荧光蛋白标记软骨细胞接种于聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸三维支架后体外培养3周,再用标记软骨细胞～支架复合物移植修复兔膝关节软骨缺损。倒置荧光显微镜下观察细胞接种支架率和体外培养过程中细胞在支架上生长、增殖、分化、分布及术后4周细胞在缺损区的成活与软骨缺损修复情况。结果:实验共纳入4只日本大耳白兔,作为受体的2只进入结果分析。①绿色荧光蛋白反转录病毒转染第一代关节软骨细胞情况:转染后3d,倒置荧光显微镜下可看到表达绿色荧光蛋白的关节软骨细胞,主要为三角形,少数呈多角形和梭形。随着传代次数的增加,绿色荧光蛋白阳性软骨细胞的形态变为以梭形为主,少数细胞为三角形和椭圆形,体外培养8周,细胞增殖良好,荧光强度无减弱。流式细胞仪检测G418筛选2周后软骨细胞的绿色荧光蛋白表达率为87.3%。②绿色荧光蛋白标记软骨细胞支架复合物倒置荧光显微镜观察结果:软骨细胞三维接种支架后,细胞几乎全部种植于支架上,在支架材料内分布均匀,刚接种的细胞呈圆形,发出明亮的绿色荧光;3～4h细胞开始变形,2～3d即己基本完全变形,细胞的形态以长梭形为主,呈网状排列,随着培养时间延长,支架上的细胞逐渐由梭形变成圆形,移植前(体外培养3周)支架上细胞大多数己呈圆形。体外培养6周,细胞密度增加,荧光强度未见减弱,而不能在荧光显微镜下观察未标记软骨细胞～支架复合物中细胞的形态。③绿色荧光蛋白标记关节软骨细胞在修复区成活及参与软骨缺损修复情况:移植术后4周,大体观察可见移植组织有别于周围软骨,表面尚平整。绿色荧光蛋白标记软骨细胞～支架复合移植修复关节软骨缺损4周,苏木精-伊红染色可见修复区细胞为透明软骨样细胞,排列不规则,表层细胞体积较小,数量较多,深层细胞体积较大,细胞外基质较少,与周围组织分界清楚。甲苯胺蓝染色可见修复区甲苯胺蓝阳性的基质较少,支架材料大部分降解吸收,修复区与周围组织分界清楚,连接处稍不平整,未见淋巴细胞浸润。倒置荧光显微镜进行观察,修复区可见发绿色荧光的圆形细胞及其分裂相,荧光充满整个细胞,荧光细胞未进入周围的软骨及软骨下骨中,与周围正常关节软骨分界清楚。结论:反转录病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染对关节软骨细胞的黏附、伸展、生长和增殖等功能没有明显的影响,可长期稳定的标记关节软骨细胞以及动态观察软骨细胞的生长和增殖等情况,对组织工程软骨体外构建和体内软骨形成有良好的示踪作用。     

Passaged human chondrocytes accumulate extracellular matrix when induced by bovine chondrocytes

A source of sufficient number of cells is a major limiting factor for cartilage tissue engineering. To circumvent this problem, we developed a co‐culture method to induce redifferentiation in bovine articular chondrocytes, which had undergone dedifferentiation following serial passage in monolayer culture. In this study we determine whether human osteoarthritic (OA) and non‐diseased passaged dedifferentiated chondrocytes will respond similarly. Human passaged chondrocytes were co‐cultured for 4 weeks with primary bovine chondrocytes and their redifferentiation status was determined. Afterwards the cells were cultured either independently or in co‐culture with cryopreserved passaged cells for functional analysis. The co‐culture of passaged cells with primary chondrocytes resulted in reversion of their phenotype towards articular chondrocytes, as shown by increased gene expression of type II collagen and COMP, decreased type I collagen expression and extracellular matrix formation in vitro. Furthermore, this redifferentiation was stable, as those cells not only formed hyaline‐like cartilage tissue when grown on their own but also they could induce redifferentiation of passaged chondrocytes in co‐culture. These data suggest that it may be possible to use autologous chondrocytes obtained from osteoarthritic cartilage to form tissue suitable to use for cartilage repair. Copyright © 2009 John Wiley & Sons, Ltd.     

Low‐oxygen conditions promote synergistic increases in chondrogenesis during co‐culture of human osteoarthritic stem cells and chondrocytes

There has been increased interest in co‐cultures of stem cells and chondrocytes for cartilage tissue engineering as there are the limitations associated with using either cell type alone. Drawbacks associated with the use of chondrocytes include the limited numbers of cells available for isolation from damaged or diseased joints, their dedifferentiation during in vitro expansion, and a diminished capacity to synthesise cartilage‐specific extracellular matrix components with age and disease. This has motivated the use of adult stem cells with either freshly isolated or culture‐expanded chondrocytes for cartilage repair applications; however, the ideal combination of cells and environmental conditions for promoting robust chondrogenesis remains unclear. In this study, we compared the effect of combining a small number of freshly isolated or culture‐expanded human chondrocytes with infrapatellar fat pad–derived stem cells (FPSCs) from osteoarthritic donors on chondrogenesis in altered oxygen (5% or 20%) and growth factor supplementation (TGF‐β3 only or TGF‐β3 and BMP‐7) conditions. Both co‐cultures, but particularly those including freshly isolated chondrocytes, were found to promote cell proliferation and enhanced matrix accumulation compared to the use of FPSCs alone, resulting in the development of a tissue that was compositionally more similar to that of the native articular cartilage. Local oxygen levels were found to impact chondrogenesis in co‐cultures, with more robust increases in proteoglycan and collagen deposition observed at 5% O₂. Additionally, collagen type I synthesis was suppressed in co‐cultures maintained at low‐oxygen conditions. This study demonstrates that a co‐culture of freshly isolated human chondrocytes and FPSCs promotes robust chondrogenesis and thus is a promising cell combination for cartilage tissue engineering.     

Processed xenogenic cartilage as innovative biomatrix for cartilage tissue engineering: effects on chondrocyte differentiation and function

One key point in the development of new bioimplant matrices for the reconstruction and replacement of cartilage defects is to provide an adequate microenvironment to ensure chondrocyte migration and de novo synthesis of cartilage‐specific extracellular matrix (ECM). A recently developed decellularization and sterilization process maintains the three‐dimensional (3D) collagen structure of native septal cartilage while increasing matrix porosity, which is considered to be crucial for cartilage tissue engineering. Human primary nasal septal chondrocytes were amplified in monolayer culture and 3D‐cultured on processed porcine nasal septal cartilage scaffolds. The influence of chondrogenic growth factors on neosynthesis of ECM proteins was examined at the protein and gene expression levels. Seeding experiments demonstrated that processed xenogenic cartilage matrices provide excellent environmental properties for human nasal septal chondrocytes with respect to cell adhesion, migration into the matrix and neosynthesis of cartilage‐specific ECM proteins, such as collagen type II and aggrecan. Matrix biomechanical stability indicated that the constructs retrieve full stability and function during 3D culture for up to 42 days, proportional to collagen type II and GAG production. Thus, processed xenogenic cartilage offers a suitable environment for human nasal chondrocytes and has promising potential for cartilage tissue engineering in the head and neck region. Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd.     

胶原-壳聚糖支架与软骨细胞的生长

背景：目前软骨支架材料的种类比较多,但还没有一种材料能完全符合软骨修复的要求。目的：观察在混合材料胶原-壳聚糖支架中软骨细胞的生长情况。方法：采用冷冻干燥法将质量分数为2%胶原与3%壳聚糖混合制备胶原-壳聚糖多孔支架。将分离培养的第2代兔软骨细胞接种到胶原-壳聚糖支架上,对照组将软骨细胞接种到无支架的培养板中。观察支架的孔隙率、吸水性及内部形态结构,MTT法检测软骨细胞在支架上的增殖情况,组织切片苏木精-伊红染色,扫描电镜观察细胞在支架的生长、贴附情况,RT-PCR检测细胞支架复合物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果与结论：胶原-壳聚糖支架的吸水性为（80.0±0.55）%,孔隙率为（88.5±1.5）%,孔径为100～150μm,复合细胞培养2周后,细胞增殖活力高,软骨细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于对照组。说明质量分数为2%胶原与3%壳聚糖的混合支架适合软骨细胞生长和快速增殖,是一种良好的修复和重建软骨载体。     

Evaluation of the potential of novel PCL-PPDX biodegradable scaffolds as support materials for cartilage tissue engineering

Cartilage is a specialized tissue represented by a group of particular cells (the chondrocytes) and an abundant extracellular matrix. Because of the reduced regenerative capacity of this tissue, cartilage injuries are often difficult to handle. Nowadays tissue engineering has emerged as a very promising discipline, and biodegradable polymeric scaffolds are widely used as tissue supports. In cartilage injuries, the use of autologous chondrocyte implantation from non-affected cartilage zones has emerged as a very interesting technique, where chondrocytes are expanded in order to obtain a greater number of cells. Nevertheless, it has been reported that chondrocytes in bidimensional cultures suffer a dedifferentiation process. The present study sought, in the first place, to standardize a novel protocol in order to obtain primary cultures of chondrocytes from newborn rabbit hyaline cartilage from the xiphoid process. Second, the potential of porous three-dimensional (3D) biodegradable polymeric matrices as support materials for chondrocytes was evaluated: a novel poly(ε-caprolactone)-poly(p-dioxanone) (PCL-PPDX) blend in a 90:10 w:w ratio and poly(ε-caprolactone) (PCL). After achieving the standardization, a typical round-shaped chondrocyte morphology and the expression of collagen type II and aggrecan, evaluated by RT-PCR, were observed. Second-passage chondrocytes adhered effectively to these scaffolds, although cell growth at 7 days in culture was significantly less in the PCL-PPDX blend. After 3 weeks of culture on PCL-PPDX or PCL, the cells expressed collagen type II. The present study demonstrates the potential, unknown until now, of PCL-PPDX blend scaffolds in the field of cartilage tissue engineering.     

自体脂肪间充质干细胞复合人脐带Wharton胶支架修复兔膝关节软骨缺损

背景:脐带Wharton胶富含透明质酸,糖胺多糖及胶原等,成分与天然软骨细胞外基质类似,因此由人脐带提取的Wharton胶很可能是一种较为理想的软骨组织工程支架材料。目的:评价自体脂肪间充质干细胞复合人脐带Wharton胶支架修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法:将终浓度为1010L-1、成软骨方向诱导后的兔自体脂肪间充质干细胞与人脐带Wharton胶支架复合,继续培养1周构建组织工程软骨,对兔膝关节全层软骨缺损进行修复(实验组),并与单纯支架修复的对照组及空白组进行比较。术后3个月对修复组织行大体观察、组织学检测、糖胺多糖、总胶原定量检测及生物力学测定。结果与结论:实验组的缺损多为透明软骨修复,对照组以纤维组织修复为主,空白组无明显组织修复。提示脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞具有可行性;实验构建的组织工程软骨能有效的修复关节软骨缺损,人脐带Wharton胶可作为软骨组织工程良好的支架材料。     

Gene transfer of a human insulin-like growth factor I cDNA enhances tissue engineering of cartilage

The repair of articular cartilage lesions remains a clinical problem. Two novel approaches to cartilage formation, gene transfer and tissue engineering, have been limited by short-term transgene expression in transplanted chondrocytes and inability to deliver regulatory signals to engineered tissues according to specific temporal and spatial patterns. We tested the hypothesis that the transfer of a cDNA encoding the human insulin-like growth factor I (IGF-I) can provide sustained gene expression in cell-polymer constructs in vitro and in vivo and enhance the structural and functional properties of tissue-engineered cartilage. Bovine articular chondrocytes genetically modified to overexpress human IGF-I were seeded into polymer scaffolds, cultured in bioreactors in serum-free medium, and implanted subcutaneously in nude mice; constructs based on nontransfected or lacZ-transfected chondrocytes served as controls. Transgene expression was maintained throughout the duration of the study, more than 4 weeks in vitro followed by an additional 10 days either in vitro or in vivo. Chondrogenesis progressed toward the formation of cartilaginous tissue that was characterized by the presence of glycosaminoglycans, aggrecan, and type II collagen, and the absence of type I collagen. IGF-I constructs contained increased amounts of glycosaminoglycans and collagen and confined-compression equilibrium moduli as compared with controls; all groups had subnormal cellularity. The amounts of glycosaminoglycans and collagen per unit DNA in IGF-I constructs were markedly higher than in constructs cultured in serum-supplemented medium or native cartilage. This enhancement of chondrogenesis by spatially defined overexpression of human IGF-I suggests that cartilage tissue engineering based on genetically modified chondrocytes may be advantageous as compared with either gene transfer or tissue engineering alone.     

转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化

背景:转化生长因子β1是关节软骨组织工程研究的首选生长因子,适当浓度能刺激关节软骨细胞增殖、分裂和分化.目的:建立含有转化生长因子β1的特殊诱导体系培养条件下骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的能力,观察诱导后的细胞形态及表型变化.方法:于兔胫骨结节内侧抽取骨髓,采用贴壁培养法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞行流式细胞仪检测鉴定其表面抗原,以含有转化生长因子β1的特殊软骨诱导体系的培养条件下对第3代骨髓间充质干细胞诱导培养21 d,诱导后与人鼻中隔软骨细胞进行比较.采用免疫组织化学法对Ⅱ型胶原进行定性检测.结果与结论:贴壁培养法可分离并纯化兔骨髓间充质干细胞,所得第3代骨髓间充质干细胞表面抗原CD44 阳性,CD34、CD45 阴性.经诱导培养21 d后细胞形态变为不规则,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示可见阳性细胞.提示含有转化生长因子β1的特殊软骨诱导体系的培养条件下,骨髓间充质干细胞可以转化为软骨细胞,且与正常软骨细胞无明显差异.