桂皮醛脂质体制备工艺研究

[目的]建立桂皮醛脂质体包封率的测定方法,以包封率与载药量为指标,研究桂皮醛脂质体的制备工艺及最优处方。[方法]采用超滤法分离桂皮醛脂质体中游离的药物,高效液相色谱法测定药物含量,计算桂皮醛脂质体包封率;采用薄膜-超声分散法制备桂皮醛脂质体;以胆固醇与卵磷脂质量的比例、桂皮醛与辅料质量的比例、水化温度、磷酸缓冲盐p H值为影响因素,采用正交法进行处方筛选。[结果]桂皮醛脂质体优化后的处方为:胆固醇与卵磷脂质量比为1∶8,桂皮醛与胆固醇卵磷脂总量比为1∶12,pH为7.0,水化温度为55℃,在此条件下制备的桂皮醛脂质体包封率为82.71%,载药量为5.32%。[结论]实验制备的桂皮醛脂质体方法简单可行,包封率较高,对桂皮醛改善皮肤光老化提供一定的指导意义。     

R8多肽修饰表阿霉素与双氢青蒿素脂质体处方优选及含量测定

目的:优选R_8多肽修饰表阿霉素与双氢青蒿素脂质体的处方,并建立脂质体中表阿霉素的含量测定方法。方法:以薄膜分散法-硫酸铵梯度法制备R_8多肽修饰表阿霉素与双氢青蒿素脂质体,采用星点设计-响应面法对卵磷脂/胆固醇(EPC/Chol)质量比、超声功率、卵磷脂/表阿霉素(EPC/EPI)质量比进行优选,采用高效液相色谱法(HPLC)法测定脂质体中表阿霉素的含量。结果:优选后卵磷脂/胆固醇(EPC/Chol)质量比为4∶1,超声功率为300 W,卵磷脂/表阿霉素(EPC/EPI)质量比为25∶1,所得脂质体平均包封率为(94.5%±0.51%)(n=3);脂质体中表阿霉素的平均含量为(150.01±1.26)μg/mL(n=3)。结论:优化所得处方稳定,适用于制备R_8多肽修饰表阿霉素与双氢青蒿素脂质体;建立的HPLC法准确可靠,简单快速,可用于测定脂质体中表阿霉素的含量。     

舒马普坦脂质体的处方与制备工艺优化

目的:研究舒马普坦脂质体的处方工艺并对其进行优化.方法:单因素试验考察卵磷脂/胆固醇质量比、舒马普坦/卵磷脂质量比、超声时间和水合时间对脂质体包封率的影响,再用Box-Behnken设计进行优化.结果:舒马普坦脂质体最佳制备工艺为:卵磷脂/胆固醇比5.4:1,舒马普坦/卵磷脂比1:14,超声时间31 min,水合时间4...     

正交试验法优选盐酸小檗碱脂质体制备工艺

目的:优选盐酸小檗碱脂质体的制备工艺。方法:采用主动加药法制备盐酸小檗碱脂质体,在单因素考察基础上采用正交试验设计,以包封率为评价指标,筛选脂质体制备的最佳工艺条件。结果:最佳制备工艺为A2B1C1D1,即卵磷脂与胆固醇之质量比为3∶1,药脂质量比1∶30,孵化时间为20min,孵化温度60℃。制备3批脂质体,平均包封率为(78.51±2.45)%,粒径范围为2.2μm～3.5μm。结论:所选工艺制备的脂质体包封率较高,粒径分布较均匀。     

正交试验优选仙人掌多糖脂质体的制备工艺

目的:优选仙人掌多糖脂质体的最佳制备工艺.方法:采用熔融法制备仙人掌多糖脂质体,以载药量为指标,以大豆卵磷脂、胆固醇、仙人掌多糖的用量和温度为因素,采用L9(34)正交试验设计对制备条件进行优选,紫外-可见分光光度法测定仙人掌多糖脂质体的包封率.结果:熔融法制备仙人掌多糖脂质体的最佳工艺为大豆卵磷脂的质量为100mg,胆固醇的质量为200mg,仙人掌多糖的质量为70mg,温度为34℃.结论:仙人掌多糖脂质体的制备工艺可行.     

人前列腺癌靶向超声造影剂的制备及其体外实验研究

目的制备人前列腺细胞癌靶向超声造影剂,并对其进行鉴定,探讨其体外寻靶能力.方法静电吸附法制备免疫脂质体微泡造影剂;免疫荧光染色试验证明抗体与脂质体微泡的结合,普通光镜和荧光显微下观察微泡与前列腺癌细胞的结合情况,探讨靶向脂质体微泡对癌细胞的体外寻靶能力;同时以普通微泡作为对照.结果免疫脂质体微泡的荧光免疫染色试验为阳性;体外寻靶试验显示携带PSM(C-15)抗体的靶向脂质体微泡能较好地粘附于癌细胞周边;而对照组未见微泡与靶细胞的结合.结论采用静电吸附法成功制备了具有良好免疫活性的的人前列腺癌靶向脂质体造影剂,该造影剂在体外能高效特异性地与人前列腺癌细胞结合.     

应用溶剂注入法制备抗耐药结核菌药物利奈唑胺脂质体的实验研究

目的利用乙醇注入法制备利奈唑胺脂质体,并通过响应面法优化处方及工艺。方法单因素考察优选出主要影响因素并联合Box-Behnken响应面法分析筛选出最佳处方及工艺,并以此工艺制备载药脂质体。使用倒置荧光显微镜对最佳工艺条件下制备的利奈唑胺脂质体进行形貌观察。结果最佳工艺为:胆固醇与卵磷脂的质量比1:3、类脂注入缓冲液速度1.2 mL/min、超声时间3 min。包封率82.36%,RSD=1.32%,显微镜观察利奈唑胺脂质体粒径较均一,形态圆整。结论乙醇注入法制备利奈唑胺脂质体具有较高的包封率,Box-Behnken响应面法可快速全面选取最佳制备工艺,方便准确。     

KGDS血栓靶向超声造影剂的制备及其初步评价

目的：探讨制备靶向结合活化血小板的脂质超声造影剂的新方法,评价制备的靶向超声造影剂体外与血栓靶向结合的能力。方法：首先合成荧光标记的,能与血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体特异性结合的赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸多肽-棕榈酸化合物（KGDS-Palm）。采用“超声-高速剪切”法,以带荧光FITC的KGDS-Palm为主要原料之一,制备靶向脂质超声造影剂。马尔文公司粒径测定仪检测微泡大小及分布;Coulter计数仪分析浓度;荧光显微镜下观察KGDS多肽与微泡的结合情况;流式细胞仪评价多肽与微泡的结合效率;观察靶向微泡在体外的稳定性;采用体外血栓模型,检测靶向微泡与血栓靶向结合的特异性。结果：KGDS靶向超声造影剂呈淡黄色混悬液,微泡浓度约为1.5×109/mL,平均粒径为1.5 μm,98%的微泡小于5 μm。荧光显微镜显示靶向超声造影剂表面呈明亮的绿色荧光;流式细胞仪检测KGDS结合效率为90.04%;体外4 ℃保存48 h后微泡浓度及粒径无显著改变;体外靶向及其拮抗实验证实,靶向超声造影剂与血栓特异性结合。结论：采用“超声-高速剪切法”制备靶向超声造影剂,方法简单易行,有利于靶向造影剂的制备及纯化;KGDS靶向超声造影剂稳定性好、靶向结合特异性强。     

蛇床子素脂质体的制备及其质量评价

目的: 对蛇床子素脂质体最佳制备工艺及处方进行研究,并评价其质量。方法: 采用薄膜-超声分散法制备蛇床子素脂质体,以包封率为评价指标,采用单因素和正交实验优化蛇床子素脂质体的制备工艺和处方,并测定其粒径和Zeta电位。结果: 蛇床子素脂质体优化后的制备工艺和处方为：胆固醇与大豆卵磷脂质量比为1:3,药脂比为3:20,pH值为7.9,成膜温度为45 ℃。按此处方工艺制备蛇床子素脂质体包封率在80%以上。平均粒径为（466.6 ± 6.4）nm,平均Zeta电位为（-29.0 ± 1.8）mV。结论: 优选的处方和工艺条件可行且稳定,制备的蛇床子素脂质体包封率高,稳定性好。     

蔗糖酯-磷脂脂质体阻碍家兔腹腔巨噬细胞摄取胆固醇

目的:将蔗糖酯掺入磷脂中制成脂质体,观测利用蔗糖酯包结胆固醇的作用影响胆固醇出入巨噬细胞的效果。方法:按3:3和1.5:3两种摩尔比例将蔗糖酯与卵磷脂混合,然后用乙醚注射法制备蔗糖酯-卵磷脂脂质体,用铜离子诱导法制备氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)。在家兔腹腔巨噬细胞充分摄取ox-LDL并转化成荷脂的或泡沫化的巨噬细胞之后及之前两种情况下,加入制备好的脂质体与之共同孵育,于细胞摄取ox-LDL后脂质体干预12、24h,及摄取ox-LDL前脂质体干预24、36h4个时段结束实验,然后检测细胞内胆固醇含量。结果:家兔腹腔巨噬细胞与ox-LDL共同孵育24h后,其细胞内胆固醇含量较孵育前明显增加(t=7.8353,P<0.01);加入各种脂质体作用12、24h后,各组细胞的细胞内胆固醇含量无明显减少(F值分别为0.2412、0.3145,P>0.05);在细胞充分摄取ox-LDL之前,加入脂质体共同孵育24、36h后,各组细胞内胆固醇含量均无明显增加,都低于荷脂的或泡沫化的巨噬细胞内胆固醇含量(P<0.05),尤以不含鞘磷脂的蔗糖酯-磷脂脂质体处理的细胞为著。结论:蔗糖酯脂质体及磷脂脂质体对于已经充分摄取胆固醇并已转化的荷脂细胞或泡沫细胞,均无促进其胆固醇外流的作用,但脂质体能阻碍巨噬细胞从ox-LDL中摄取胆固醇,且脂质体的组分差异,能影响其阻碍巨噬细胞从ox-LDL中摄取胆固醇的效率。     

可携基因超声造影剂的制备及其体内外显影效果

目的制备一种新型的超声造影剂,研究其理化性质及体内、外显影效果。方法选用体内可降解的两种脂质体二软脂酰卵磷脂（DPPC）和1,2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷（DOTAP）,采用薄膜分散法制备超声造影剂,观察其外观和形态及粒径分布。以声诺维超声造影剂、PBS和水合液作为对照组,比较其基因携带能力。采用体内、外显影实验,观察自制超声造影剂的显影效果和时间。结果光学显微镜下显示,自制超声造影剂形态规则,呈球形,大小均一,平均粒径为6.969μm。自制超声造影剂与声诺维超声造影剂相比有较好的基因携带能力,而声诺维超声造影剂与PBS及水合液的携基因能力无明显差异。体外超声显影显示,自制超声造影剂在Skeletalmuscular模式下显影时间为18min,造影模式下显影时间为14min,两种模式下管内均表现为强回声,有很好的影像增强效果;体内超声显影（造影模式）显示,大鼠尾静脉注射造影剂后1s时下腔静脉开始显影,3s时腹主动脉中下段开始显影,内均可见强回声充填。结论脂质体包裹的微泡理化性质稳定,具有较好的基因携带能力,体内外显影效果较好,有望成为一种新型的可携带基因和药物的超声造影剂。     

携RGDS超声造影剂的制备及体外靶向血栓研究

目的探讨制备携精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(Arg-Gly-Asp-Ser,RGDS)靶向脂膜超声造影剂的制备,并对靶向微泡的特性及靶向作用进行初步鉴定.方法分别采用酰胺键共价键合的方式和表面吸附法将脂膜超声造影剂与RGDS血栓靶向短肽片段进行结合;制备产物通过流式细胞仪进行携带率和稳定性的检测;对内源性凝血途径产生的血栓进行寻靶作用研究.结果流式细胞仪显示共价键合RGDS脂膜超声造影剂其微泡外壳波长发生了明显变化,显示改变率达到82%,而表面吸附法制备的靶向超声造影剂改变率达到23%;激光共聚焦显微镜显示携带RGDS的脂膜超声造影剂在大量的PBS液清洗后,对离体血栓仍具有很强的靶向性和稳定性,而表面吸附法制备的靶向超声造影剂在大量PBS液清洗后,失去了其靶向性.结论采用共价键合的化学修饰方法可以成功制备稳定性好的亲血栓靶向脂膜超声造影剂.     

共聚物微泡造影剂的制备与体外二次谐波特性研究

目的 用PLLA-PEG-PLLA共聚物为外壳材料制备微泡造影剂,建立体外声学性质测定装置和方法.方法 用开环聚合方法合成三嵌段共聚物;用双乳化法制备空心造影剂微泡;使用光学显微镜和扫描电镜观察形貌;测定微泡的粒径分布;体外测试微泡的二次谐波特性.结果 获得一系列在生理盐水中分散性很好的空心微泡,在低机械指数下呈现很好的二次谐波增强信号增强.结论 以共聚物PLLA-PEG-PLLA为外壳材料,采用双乳化法得到的空心微泡可以用作为超声造影剂.     

超声分子靶向显像体外胰岛移植立即经血液介导的炎症反应

目的：探讨采用赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(Lys-Gly-Asp-Ser,KGDS)血栓靶向超声造影剂显示体外 胰岛移植立即经血液介导的炎症反应(immediately blood-mediated inflammatory reaction,IBMIR)可行性,为无创、实 时、动态地研究和评价IBMIR探索一种新的分子影像学方法。方法：7 mL新鲜全血+1 000 胰岛当量(islet equivalent quantity,IEQ)新生猪胰岛体外制作IBMIR模型。实验分为3组,均重复3次：A组对照组,不加造影剂;B组加普通 超声造影剂;C组加靶向超声造影剂。将上述各组Loops管道固定于摇床,并浸于37 ℃的水浴中。采用超声造影模式 实时观察Loops管内的回声,记录超声发现血栓出现的时间;并采用Line成像模式存储在硬盘,脱机分析血栓超声增 强强度。实验开始后10,30,60 min 3个时间点,经70 μm过滤网过滤Loops管内血液,测定过滤液体的凝血系统[凝血 酶抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex,ATA),D-二聚体(D-dimer)]、补体系统(C3a,C5b-9)及胰岛素含量 等指标,过滤网内血块做病理学检测。结果：A组没有加入造影剂,超声不能发现血栓形成;B组、C组加入超声造 影剂后超声可以发现血栓,其中B组加入自制普通超声造影剂,血栓在超声图像上显示为周边及内部无增强,呈充盈 缺损改变,发现血栓时间为(7.3±0.5) min,相应血栓超声增强强度的灰阶值为31.22±3.56;C组加入靶向超声造影剂, 超声清晰显示环状增强的血栓,发现血栓时间为(13.2±0.6) min,其超声增强强度的灰阶值为75.85±5.21。B组、C组血 栓灰阶值及发现时间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。血液学检测证实各实验组均发生了IBMIR;病理结果显示胰 岛与新鲜全血接触后,其表面形成血栓壳,加入带荧光的靶向超声造影剂,荧光显微镜可以清楚观察到胰岛周边呈 明亮的荧光光环,与血栓壳位置、形态、范围完全吻合。结论：超声分子影像技术可以靶向显像体外IBMIR,为无创 评估IBMIR的发生及其范围、程度提供了可能。     

TATp和CXCR4修饰的载V P3基因超声微泡制备及体外寻靶实验

目的：制备一种载VP3基因、反式激活转录激活肽（TATp）与基质细胞衍生因子‐1（SDF‐1）同时修饰的新型载基因高分子靶向超声造影剂,表征其性质。方法采用W／O／W双乳化法制备载基因超声微泡。并通过硫醚键将SDF‐1与TATp共价连接到聚乳酸／羟基乙酸共聚物（PLGA）微泡的表面,制备成靶向载基因超声微泡。Malvern测量仪测定其粒径、分布及表面电位,流式细胞仪及共聚焦显微镜检测TATp、SDF‐1在高分子微泡表面的连接状况,酶切反应实验鉴定其对DNA的保护性,光镜观察及流式细胞仪初步评估其体外寻靶能力,超声考察体外成像。结果靶向载基因超声微泡呈规则球形。粒径为（536．00±16．55）nm ,分布集中,表面电位为（－0．08±0．08）mV。平均载药量为0．62％,平均包封率为36．13％。对DNA保护作用持续60 min ,未见损坏。TATp、SDF‐1同时加载于PLGA微泡表面的连接率为69．84％。体外寻靶实验显示,靶向微泡较多地稳定簇聚在舌癌SCC‐15细胞膜上,连接率为91．44％。而非靶向微泡较少结合,连接率为12．96％。体外超声显像呈细小点状、均匀高回声。结论成功制备出TATp‐SDF‐1‐VP3‐PEG‐PLGA微泡,其能在体外高效靶向结合舌鳞癌SCC‐15细胞,且短时间穿过细胞膜。体外成像效果较好。     

Microbubble ultrasound contrast agent with three esters and carboxylic methyl cellulose as main shell materials：Its preparation and imaging evaluation

Objective: To study on the preparation process of a new surfactant-based microbubble ultrasound contrastagent and to evaluate its contrast effects in vivo. Methods: Microbubble ultrasound contrast agent with three ester sur-factants and other additives as its shell materials was prepared by sonication. Sulfur hexafluoride was adopted as the in-ner gas of the microbubbles. New methods through the combination of optical microscope and some softwares were usedto measure the size distribution and the concentration of the microbubbles. Some parameters such as the pH value of thephosphate buffer, quantity of the carboxylic methyl cellulose in the shell materials, selection of the ultrasound powerand process time, were studied. Six hybirded dogs were used to verify the in vivo contrast imaging of the contrast agentusing second harmonic power Doppler modality. Safety and persistent time of the agent inner animal body were also in-     

诊断超声介导自制微泡造影剂联合尿激酶体外溶栓效应及参数优化的实验研究

目的研究诊断超声介导自制微泡造影剂对体外血栓的溶解效应及探讨影响溶栓效果的主要因素,确定最优溶栓参数组合。方法制备标准化红色血栓,设计、建立体外溶栓模型。选用L16(45)正交表设计不同输出能量(因素A:5%、25%、50%、100%)、不同微泡量(因素B:50、100、200、400μL)、不同尿激酶浓度(因素C:100、200、400、800U/mL)、不同溶栓时间(因素D:10、20、30、40min)的4因素4水平实验组合,在固定诊断超声频率为1.82MHz条件下,按照组合对制备好的4种栓龄(3、6、12、24h)标准红色血栓进行体外溶栓实验。采用组织病理切片HE染色及扫描电镜观察溶栓前后血栓结构。采用溶栓前后质量减少计算溶栓率,统计学方法分析结果。结果光镜及扫描电镜下见各栓龄血栓溶栓后,血栓纤维网架被破坏。超声输出能量、微泡量、尿激酶浓度、溶栓时间4个因素对各栓龄血栓溶栓效果的影响均有统计学意义(P均<0.05);尿激酶对溶栓率的影响最大,最优溶栓参数组合为C4-D4-A1-B4,即:尿激酶800U/mL、溶栓时间40min、输出能量5%、微泡量400μL;4种因素各水平对4种栓龄血栓实验结果影响的效应曲线由高到低依次为3h、6h、12h、24h;不同栓龄血栓溶栓结果之间差异有统计学意义(P均<0.05)。结论诊断超声介导微泡造影剂具有助溶作用;在超声频率为1.82 MHz、能量输出为5%时,微泡已能被破坏而增强超声空化效应;固定超声频率,在高尿激酶浓度、延长溶栓时间、增大微泡量参数条件下可获得最优溶栓效果;随着血栓栓龄的增大,溶栓效果减低。     

iRGD靶向声学脂质体在类风湿关节炎诊疗中的作用

目的 制备集治疗与成像为一体的载甲氨喋呤(MTX)和吲哚菁绿(ICG)iRGD靶向载药声学脂质体(iRGD-MTX-ICG-ELIP),观察其靶向性及联合低频超声体外抑制滑膜细胞(MH7A)增殖的效果.方法 采用薄膜水化法和冷冻冻干法制备iRGD-MTX-ICG-ELIP,检测其一般特性及声学响应性,通过细胞摄取实验验证iRGD-MTX-ICG-ELIP的体外靶向结合性能,构建类风湿关节炎小鼠模型,通过靶组织的药物荧光强度验证iRGD-MTX-ICG-ELIP的体内靶向性;CCK8法检测iRGD-MTX-ICG-ELIP联合超声体外抑制MH7A增殖的效果.结果 制备的iRGD-MTX-ICG-ELIP粒径为134.4±17.6 nm,电位为-10.07± 4.28 mv,iRGD-MTX-ICG-ELIP中MTX和ICG的包封率分别为(62.56±0.77)%和(95.13±0.82)%;其联合低频超声控释药物发现,随超声作用强度增加和作用时间的延长,MTX与ICG释放均增多.细胞摄取实验表明血管内皮细胞HUVECs对iRGD-MTX-ICG-ELIP的摄取效率比对MTX-ICG-ELIP摄取效率高1.89倍,差异有统计学意义(P<0.05),活体成像实验显示iRGD-MTX-ICG-ELIP在RA发病关节的荧光强度明显强于非靶向组;CCK8检测结果显示,iRGD-MTX-ICG-ELIP联合超声组的MH7A存活率为(32.49±3.04)%,与未联合超声组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 本研究制备的iRGD-MTX-ICG-ELIP粒径小、均一性好,对HUVECs和RA病变关节组织具有较好的靶向性.较佳的药物包封率和声学响应性增强了iRGD-MTX-ICG-ELIP联合超声抑制MH7A的增殖作用,为后续更精准有效的治疗类风湿关节炎提供前期基础.