pSLX-CMV/TβRⅡ-IgG1 Fc载体的构建

目的构建表达人TGF-β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础.方法以RT-PCR方法扩增目的基因TβRII-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRII-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLX-CMV中,重组质粒pSLX-CMV/TβRII-IgG1 Fc在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度.结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系.结论成功构建了重组质粒pSLX-CMV/TβRII-IgG1 Fc,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.     

可溶性转化生长因子β1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体对人肝细胞凋亡的抑制作用

目的构建表达人转化生长因子-β1(TGF-β1)Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,并研究重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN是否拮抗外源性TGF-β1诱发的肝细胞凋亡,从而为该载体对于肝纤维化的临床应用提供理论依据.方法(1)以RT-PCR法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度.(2)以人正常肝细胞HL-7702为靶细胞,将细胞分为空白对照组、TGF-β1组、载体组、TGF-β1 载体组.用TUNEL原位标记法和流式细胞仪对各组细胞凋亡率进行检测.结果(1)经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系.(2)TGF-β1组TUMEL阳性细胞明显多于其他各组,而TGF-β1 载体组和空白对照、载体组细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05).流式细胞仪分析结果显示,与其他各组细胞相比,TGF-β1组细胞碎片占细胞总数的百分比明显增加,而加入载体后细胞周期的比例、凋亡率和正常对照组相比没有明显变化.结论成功构建的重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN可有效的阻断外源性TGF-β1诱导肝细胞凋亡的作用,提示该载体可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.     

TGF-β1重组腺病毒载体的快速构建及鉴定

目的应用简化的两步法细菌内同源重组高效制备TGF-β1基因重组腺病毒载体,为下一步的基因治疗奠定基础。方法应用PCR技术扩增TGF-β1-pcDNA3.1质粒中的目的基因片段,将TGF-β1目的基因片段定向克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,转化DH5a感受态细胞,用卡那霉素平板筛选阳性克隆,提取质粒,将酶切鉴定正确的质粒用PmeI线性化后采用两步法同源重组:先将pAdEasy-1转化入BJ5183细菌中,制备pAdEasy-1-BJ5183感受态细胞,再将PmeI线性化的pAdTrack-CMV-TGF-β1转入其中,进行同源重组,用卡那霉素平板筛选小的阳性克隆,提取质粒,酶切或PCR鉴定。结果经酶切,PCR鉴定成功构建了TGF-β1重组腺病毒载体。结论运用简化的两步法细菌内同源重组可以在大肠杆菌中快速高效地构建重组腺病毒载体。     

pSLX-CMV/TβRII-IgG1Fc载体的构建

目的构建表达人TGFβ1II型受体细胞外结合区和人IgG1Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础。方法以RTPCR方法扩增目的基因TβRIIIgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRIIIgG1Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLXCMV中,重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度。结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系。结论成功构建了重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径。     

TGF-β1Ⅱ型受体部分基因表达质粒对实验性大鼠肝纤维化的影响

目的　观察缺陷型TGF β1 Ⅱ型受体表达质粒在大白鼠体内阻断TGF β1 的作用后对免疫性大鼠肝纤维化的影响。方法　运用基因重组技术 ,构建人的含有细胞外结合区、跨膜区和少量细胞质区的缺陷型TGF β1 Ⅱ型受体真核细胞表达质粒 ,经脂质体包埋后 ,通过腹腔注射将其导入免疫性大鼠肝纤维化模型体内 ,观察其对大鼠肝纤维化的影响。结果　早期接受缺陷型TGF β1 Ⅱ型受体表达质粒治疗的大鼠 ,其血清透明质酸 (HA)、层黏连蛋白 (LN)、Ⅲ型前胶原 (PCⅢ )、Ⅳ型胶原 (Ⅳ C)的水平均比模型组低 (P <0 .0 1) ,晚期组与模型组之间差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;在病理形态学的观察方面 ,早期、晚期运用缺陷型TGF β1 Ⅱ型受体表达质粒进行治疗 ,均可使大鼠肝纤维化程度较模型组减轻 (P <0 .0 1)。结论　在肝纤维化形成的早期应用缺陷型TGF β1 Ⅱ型受体表达质粒进行治疗可以预防肝纤维化的形成 ,而晚期应用只能阻止肝纤维化的进一步发展 ,尚不能有效逆转肝纤维化     

Smad4和TGF-βRⅡ在肝细胞癌中的表达及意义

目的探讨转化生长因子β(TGF-β)通路中Smad4蛋白与转化生长因子βⅡ型受体(TGF-β RⅡ)蛋白的变化及其在肝细胞癌中可能的作用机制.方法用免疫组化SABC法检测45例石蜡包埋人肝细胞癌标本及36例癌旁组织中Smad4、TGF-β RⅡ蛋白表达情况.结果 45例肝癌组织中,Smad4、TGF-βRⅡ阳性表达率分别为51.5%和42.2%.肝细胞癌组织中Smad4、TGF-β RⅡ阳性表达与癌旁组织比较均明显降低(P＜0.05),且与包膜是否完整和有无癌栓有关(P＜0.05),TGF-βRⅡ与肝细胞癌组织分化程度有相关性(P＜0.05).结论肝细胞癌组织中Smad4、TGF-β RⅡ阳性表达均降低,Smad4及TGF-β RⅡ的丢失、功能失活对诱发肝细胞癌及肝细胞转移都起到一定作用.     

丹参酮ⅡA对人肝癌细胞TGF-β1基因表达的影响

目的探讨丹参酮ⅡA对人肝癌细胞TGF-β1表达的影响及其抗肿瘤作用机制。方法体外培养SMMC-7721肝癌细胞株，采用倒置相差显微镜、Hoechst 33342染色荧光显微镜观察，以及“梯状”DNA确定凋亡的发生并计算凋亡率；用RT—PCR方法检测肝癌细胞TGF．岛的表达。结果倒置相差显微镜观察可见各试验组细胞的生长不同程度受抑，并可见典型的凋亡形态改变；Hoechst 33342染色可见凋亡细胞核浓染，亮度明显加深或有染色质边集现象，亦可见典型的凋亡小体；提取基因组DNA电泳检测，出现典型的梯状条带；RT—PCR检测显示，丹参酮ⅡA作用48小时后TGF—β1表达量随药物浓度的增大而逐渐减低。结论丹参酮ⅡA可抑制人肝癌细胞SMMC-7721的细胞增殖，促进其凋亡，此作用可能与细胞内TGF-β1表达下调有关。     

TGF-β1和Tβ RⅡ在胆管癌组织中的表达及临床意义

胆管癌早期诊断困难 ,手术切除率低。姑息性治疗的平均生存期为 1年 ,但 5年生存率仍较低。目前 ,对胆管癌的生物学行为和预后影响因素的了解还不深入。转化生长因子 (ＴＧＦ) β1和转化生长因子 β受体Ⅱ (ＴβＲⅡ )是生长因子家族的成员 ,ＴＧＦ β1与细胞膜上的ＴＧＦ β1 4型受体结合后通过各种细胞信号传导作用导致细胞凋亡。本研究 ,通过检测ＴＧＦ β1和ＴβＲⅡ在胆管癌中的表达 ,探讨其与胆管癌进展、转移的关系。材料与方法一、标本来源30例系 1990年 1月～ 1999年 12月在东方肝胆外科医院行手术治疗的胆管癌患者 ,均为腺癌。其…     

HSV1-tk基因逆转录病毒载体构建、病毒包装及稳定细胞株建立

目的构建携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,包装后产生携带相应基因的逆转录病毒并稳定感染T47D乳腺癌细胞。方法用PCR方法扩增HSV1-tk基因,利用基因重组技术构建逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,经PCR及BamHI、SalI双酶切鉴定后与gag-pol和env表达载体用脂质体法共同转染293T包装细胞,产生含有HSV1-tk基因的逆转录病毒并用其感染T47D细胞,经G418筛选获得稳定表达株,命名为tk/T47D。结果构建了携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,并通过PCR及BamHI、SalI双酶切证实。包装产生的逆转录病毒提取病毒基因组后PCR扩增出目的基因HSV1-tk,并成功地建立稳定表达HSV1-tk基因的T47D细胞。结论成功的构建了含有HSV1-tk基因的逆转录病毒载体并包装出携带相应基因的逆转录病毒,建立稳定表达HSV1-tk基因的乳腺癌T47D细胞株。     

靶向表达的逆转录病毒载体LN．ALBTRS．TK的构建

目的：构建出在肝细胞中具靶向表达潜能的逆转录TK基因载体。方法：用p2335A-l中的一段2．0Kb的人白蛋白组织特异性转录谓节序列(ALBTRS)取代pSTK中的SV40启动子，所构建的载体命名为LN．ALB-TRS．TK。结果：载体LN．ALBTRS．TK的结构中。含有ALBTRS启动子，具有在肝细胞中特异表达白蛋白的潜能，载体经酶切鉴定表明结构符合要求。结论；成功地构建出具靶向表达潜能的逆转录载体LN．ALBTRS．TK。     

pSLX-CMV／TpRII-IgG1 Fc载体的构建

目的 构建表达人TGF-β111型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体，为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础。方法以RT-PCR方法扩增目的基因TβRII-IgG1 Fc，扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy，挑取阳性克隆酶切鉴定后测序；利用重组DNA技术，将TβRII-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLX-GMV中，重组质粒pSLX-CMV／TβRII-IgG1 Fc在脂质体介导F转染PA317包装细胞，G418筛选，直至出现抗性克隆，扩大培养，测定病毒滴度。结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定，载体插入基因序列、大小、位置均正确无误，并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选，建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系。结论成功构建了重组质粒pSLX-CMV／TβRII-IgG1 Fc，可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径。     

hIFN-β基因重组腺病毒载体的构建

目的构建hIFN—β基因的腺病毒载体，为探索hIFN—β在肿瘤基因治疗中的作用作准备。方法从健康人外周血中提取出基因组DNA，pyrobest Taq酶PCR法扩增出hIFN—β基因片段。将目的基因克隆入中间载体pMD-18T载体，经蓝白筛选和PCR筛选后测序证实序列无误。酶切目的基因并将之克隆入穿梭载体pAdTrack—CMV中，将新形成的pAdTrack—CMV—hIFN—β用限制性内切酶Pme Ⅰ线性化，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌株BJ5183细胞中。卡那霉素及酶切筛选出重组子pAd—hIFN-β，内切酶pacⅠ再次将重组子线性化，脂质体转染细胞株HEK293。借助GFP的表达可以在转染的2—3天观察到包装病毒Ad—hIFN—β产生，7—10天出现病毒斑。结果经PCR法及酶切证实各中间过程载体，且最终的包装病毒中携带有目的基因hIFN—β。结论大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便的构建出含有目的基因的腺病毒载体Ad—hIFN—β，重组子能够在HEK293细胞中扩增，病毒包装的成功为进一步研究hIFN—β基因治疗肿瘤提供了一个良好的转导载体。     

应用载体介导的RNAi技术抑制人胃癌和腹膜间皮细胞中TGF-β1的表达

目的:应用载体介导的RNAi技术特异地干扰TGF-β1在人胃癌细胞株SGC-7901和腹膜间皮细胞中的表达.方法:使用线性化的pcPURβiCassette质粒构建针对TGF-β1基因的siRNA表达载体;hU6载体启动子下游插入含TGF-β1基因特异性序列的62mer寡核苷酸片段;采用胰蛋白酶-EDTA消化法,从人的腹膜组织中分离腹膜间皮细胞.采用形态学和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法对培养细胞进行鉴定.将TGF-β1-siRNA载体转染人的上述两种细胞,以半定量RT-PCR和Western印迹方法检测转染后两种细胞中TGF-β1的表达水平的变化.结果:电泳、DNA测序证实合成的siRNA基因序列正确并已准确克隆入pcPURβiCassette载体.免疫组化染色结果显示腹膜间皮细胞角蛋白,波形蛋白表达阳性,而白细胞共同抗原(CD45),第Ⅷ因子相关抗原阴性.与各自未处理组比较,两种细胞TGF-β1-siRNA载体组的mRNA和蛋白均明显下降,并以蛋白下降更为明显.人胃癌细胞株SGC-7901TGF-β1蛋白下降约65.8%,人腹膜间皮细胞TGF-β1蛋白下降约61.8%.结论:载体介导的RNAi技术可成功地干扰TGF-β1在人胃癌细胞株SGC-7901和腹膜间皮细胞中的表达,为今后胃癌腹膜转移的基因靶向治疗奠定了基础.     

FZD2基因RNAi逆转录病毒载体的构建

设计含不同FZD2基因特异性序列的62bp寡核苷酸片段,将其构建到含有H1启动子并具有绿色荧光蛋白的逆转录病毒载体pQsupR／F中,将构建好的质粒转染293T细胞。通过酶切鉴定和测序分析,62bp寡核昔酸片段已经成功插入到RNA干扰（RNAi）的逆转录病毒载体中,转染293T细胞,通过绿色荧光可见其转染效率非常高。     

肝癌组织中TGF-β1、TGF-β1RⅡ和NF-κB的表达

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β1Ⅱ型受体(TGF-β1RⅡ)、核转录因子-κB(NF-κB)在肝细胞癌(HCC)中表达.方法:在30例肝癌组织和癌旁肝组织中,用免疫组化技术,分别检测TGF-β1 TGF-β1RⅡ及NF-κB蛋白的表达;用原位杂交方法检测TGF-β1mRNA的表达,以CD34标记血管内皮细胞,观察TGF-β1及TGF-β1RⅡ蛋白与微血管密度(MVD)、TGF-β1蛋白与TGF-β1mRNA、NF-κB与TGF-β1的关系.结果:肝癌组织TGF-β1mRNA平均光密度明显高于癌旁组织(0.1 043±0.035 vs 0.0 620±0.0 225,P＜0.01)、TGF-β1蛋白平均光密度表达明显高于癌旁组织(0.0 72 5±0.0 102 vs 0.0 442±0.0 103,P＜0.01);肝癌组织TGF-β1RⅡ蛋白平均光密度表达明显低于癌旁组织(0.0 402±0.0 113 vs 0.0 669±0.0 157,P＜0.01);肝癌组织NF-KB蛋白表达均明显高于癌旁组织(0.0 723±0.0 210 vs 0.0 305±0.0116,P＜0.01),肝癌组织MVD明显高于癌旁组织(31.23±9.25 vs 4.24±2.10,P＜0.01),肝癌组织TGF-β1蛋白阳性表达与MVD呈正相关(t=3.25,P＜0.01);TGF-β1 mRNA与TGF-β1蛋白呈正相关(χ2=8.21,P＜0.01);NF-κB蛋白阳性表达与TGF-β1蛋白阳性表达呈正相关(χ2=9.075,P＜0.01);而TGF-βRⅡ蛋白与MVD呈负相关.结论:肝癌组织中TGF-β1基因的变化发生在多个水平,肝癌细胞中TGF-β1RⅡ、NF-KB蛋白表达异常,并与MVD相关,提示他们在肝细胞癌血管形成中发挥重要作用,NF-κB可能在介导TGF-β1的活化或产生中发挥一定的作用.     

GATA-3基因反义逆转录病毒载体的构建

支气管哮喘(简称哮喘)是一种呼吸道慢性炎症性疾病。Ⅱ型辅助性T淋巴细胞(Th2)在起始和维持气道慢性炎症级联反应中具有重要作用。GATA-3为Th2淋巴细胞特异性转录因子，在Th2淋巴细胞分化及Th2类细胞因子基因转录中具有关键性作用^[1]。我们的实验应用反义真核表达载体构建技术，构建了GATA-3反义逆转录病毒载体．对进一步研究Th2淋巴细胞定向分化及Th2类细胞因子基因转录的分子机制和探讨哮喘治疗的新途径均具有重要意义。